טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד את הרשת הווסקולרית של הרשתית. זאת מושגים תחילה על ידי ביצוע סדרה של שטיפות מים ברשתית המבודדת. בשלב השני, הרשתית עוברת עיכול בטריפסין בטמפרטורה של 37 °C למשך כשעה עד שעה וחצי, בהתאם לגודל הרשתית.

בשלב הבא, מערכת כלי הדם מבודלת באמצעות שטיפות נוספות במים ודיסקציה תחת מיקרוסקופ. בסופו של דבר, ניתן להוות ויזואליזציה לשינויים וסקולריים פתולוגיים כגון מיקרו-אניוריזמות, דגנרציה של נימי דם ויחס לא תקין בין תאי אנדותל לטפילים. לפיכך, היתרון המרכזי של שיטת ה-try and digest על פני שיטות קיימות, כגון הכנת דגימות רטינה שטוחות (retinal flat mounts), הוא שניתן להבליט את כל הרשת הוסקולרית בבהירות רבה.

בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה, כיוון שהיא מאתגרת מבחינה טכנית וקשה לביצוע עקבי. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי הבידוד של כלי הדם קשה ללמוד באמצעות הסברים מילוליים בלבד. זהו כלי בעל ערך רב בכל מעבדה המבצעת מחקרים בביולוגיה של כלי הדם ברשתית, כגון מחקרים על מחלות כמו רטינופתיה סוכרתית. את הטכניקה זו ידגים ג'ונתן צ'ו (Jonathan Chow), סטודנט לרפואה מוכשר מהמעבדה שלי.

לאחר קיבוע של עין עכבר שעברה אנוקלואציה בפורמלין בבফার ניטרלי בריכוז 10% למשך 24 שעות, הנח את העין בצלחת פטרי וכסה אותה בכמות קטנה של מים. התחל את הניתוח באמצעות מספרי ניתוח כדי לבצע בזהירות חתך ראשוני בקרנית. לאחר מכן, תוך כדי החזקת אזור החתך באמצעות פינצטה ישרה, השתמש במספריים כדי לחתוך לאורך הגבול שבין הקרנית ללובן העין (סקלרה) להסרת הקרנית.

בשלב הבא, השתמש בפינצטות עדינות, מעוקלות וישרות, כדי לקלף באיטיות ובזהירות את הסקלרה והכורואיד מהרשתית לכיוון העצב האופטי. לאחר מכן, הסר את העדשה ואת כל שאריות הקשת והפסולת מהרשתית כדי לסייע בהפרדת שכבות הרשתית העצביות מכלי הדם.

הוסיפו כ-500 µL של מים מסוננים ב-45 µm לפלטת 24 בארות, הניחו את הרשתית בבאר ולאחר מכן נערערו בעדינות במשך ארבע עד חמש שעות בטמפרטורת החדר, תוך החלפת המים מדי 30 עד 60 דקות. המשיכו לשטוף את הרשתית במים למשך הלילה עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר. למחרת, הסירו את המים והוסיפו 3% trypsin, ובדקו תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שלא נמצאו שרידים בבאר. כדי למנוע מהכלי הדם להיצמד אליה, דגרו את הרקמה ב-37 °C עם ניעור עדין או ללא ניעור למשך שעה עד שעה וחצי.

כאשר הרקמה מתחילה להראות סימנים של התפרקות, הניחו את הפלטה עלבמת המיקרוסקופ והימנעו מהרשתית. הסירו בזהירות את ה-trypsin כדי להפריד את כלי הדם. תחילה, הוסיפו מים מסוננים לרשתית באמצעות פינצטה.

קלפו את קרום הגבול הפנימי (internal limiting membrane), הנראה כשכבה דקה ושקופה. נערו את הפלטה בתנועות עדינות. לאחר חמש דקות, הניחו את הפלטה שוב על במת המיקרוסקופ והחזירו בזהירות את המים, תוך הימנעות מפגיעה ברשתית, כדי לסייע בשחרור רשת כלי הדם מהרקמת הרשתית הדבוקה.

שטפו את הרשתית כפי שהודגם כעת, עד שיישאו מעט מאוד או שום שרידי רקמה במים לאחר השטיפה האחרונה. בדרך כלל, הסרת כל הרקמה שאינה כלי דם היא החלק המורכב ביותר בפרוצדורה. ניתן להשתמש בטכניקות הבאות באופן רצף או בנפרד. כדי להקל על בידוד רשת כלי הדם, טיפ חשוב אחד הוא לטבול את כל הכלים ואת ה-trypsin לפני הטיפול ברשתית.

פעולה זו יכולה לסייע במניעת הידבקות של הרקמה לציוד. יש לצפות קצה של מיקרופיפט של 200 microliter ב-trypsin שהוקצב לכך, ולאחר מכן לשאוב ולהזרים מים בזהירות, בסמוך לכלי הדם ברשתית ובכיוונם, כדי ליצור ערבול עדין. אם הרקמה הלא-כליית עדיין עמידה במרכז, יש להניח את קצה המיקרופיפט המצופה ב-trypsin בעצב האופטי ולשאוב ולהזרים בזהירות את כל רשת כלי הדם כדי לסייע בפירוק הרקמה הלא-כליית.

לבסוף, ניתן להשתמש בפינצטה כדי להרים בעדינות את כלי הדם מהמים כדי להסיר רכיבים לא-כליים הדבקים אליהם. התוצאה הסופית צריכה להיות רשת של כלי דם רטינליים שלמה ללא פסולת.

כדי להדגים את כלי הדם, יש להניח תחילה טיפת מים על זכוכית חפיה נקייה. לאחר מכן, העבירו את כלי הדם שעברו עיכול אל תוך המים תחת בקרה במיקרוסקופ. אם הרכבת ה-VAs flap היא מקופלת או פתוחה, כלי דם מקופלים יובילו לנראות נמוכה.

במהלך הצביעה, אם הרקמה מקופלת, יש להוסיף מים ולנער בעדינות את הפסית כדי לסייע בפתיחת הקיפול. לאחר מכן, השתמש במיקרופיפט כדי להסיר לאט את עודפי המים. התוצר הסופי של פרוצדורה מוצלחת הוא דגימה שטוחה (flat mount) של כל רשת כלי הדם ברשתית העכבר, כאשר הארכיטקטורה נשמרת והדגימה צבועה ב-hematoxylin and eosin.

כפי שמוצג כאן, כפי שניתן לראות בתמונה זו, ניתן להבחין בהבדל ברור בין התאים האנדותלייליים לבין הפריציטים ברשתית. הגרעינים של התאים האנדותלייליים, כפי שסומנו על ידי החץ הלבן, הם אובליים או מוארכים ונמצאים כולם בתוך דופן כלי הדם. גרעיני הטפיל, המסומנים על ידי החץ השחור, הם קטנים, כדוריים, נצבעים בצורה דחוסה, ובדרך כלל נמצאים בעמדה בולטת לאורך דופן הנימא.

טריפסין ועיכול (Trypsin and digest) הוא הליך נפוץ המשמש לניתוח פתולוגיה וסקולרית במודלים של בעלי חיים עם סוכרת. תמונה זו מציגה דוגמה לניוון של נימי דם, כפי שמצוין על ידי החץ הלבן, שנצפה בעכבר DB DB, המהווה מודל לסוכרת מסוג 2. למרות שהליך זה עבר אופטימיזציה עבור רשתית של עכברים, ניתן להשיג תוצאות דומות גם ברשתית של חולדות.

חשוב לציין כי רשתות של חולדות, כפי שמוצג בתמונות אלו, גדולות יותר מרשתות של עכברים ודורשות 12 פלטות במקום 24. רשת כלי הדם של רשתית החולדה היא גם פחות שבירה מזו של העכבר. חיוני ביותר להסיר כמה שיותר מרקמה שאינה וסקולרית.

כל שארית שתישאר תוביל לצביעה לא ספציפית ותגרום לוויזואליזציה לקויה של כלי הדם. בתמונה זו, לדוגמה, ניתן להבחין בהסרה לא מוצלחת של כל הרקמה הבלתי-כלית. באופן דומה, חשוב שהרשתית תהיה פרוסה בעת העלייה למסבך כדי לשפר את הוויזואליזציה של כלי הדם.

תמונה זו מציגה פריסה לא מוצלחת של דגימת כלי דם שטוחה (vascular flat mount). לאחר שליטה בפרוצדורה טכנית קשה זו, שיטות של פריסה ועיכול יכולות להוות כלי בעל ערך רב המאפשר ויזואליזציה מפורטת של רשת כלי הדם כולה.

על ידי שיפור טכניקה זו בעין של עכבר, חוקרים יכולים לנצל עכברים שעברו מניפולציה גנטית כדי לחקור מסלולים שונים העשויים לשלוט בכלי הדם של הרשתית, ובכך להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות רשתית שונות. כתוצאה מכך, נוכל לשפר את הבנתנו לגבי פתולוגיות של מחלות כגון רטינופתיה סוכרתית. מחקר של מודלי עכברים, כגון עכבר DVDB, עשוי לאפשר בסופו של דבר את ההזדמנות למצוא התערבויות טיפוליות פוטנציאליות חדשות המכוונות לכלי הדם של הרשתית.