Name: טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: למד את שיטת עיכול הטריפסין לניתוח כלי הדם ברשתית בעכבר. שיטה זו מאפשרת בידוד רשתית כלי הדם תוך שמירה על מבנה כלי הדם והדגשת שינויים פתולוגיים כמו מיקרו-אנויריזמות וניוון נימי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH RO1-EY019951 (AAF), חברת אילינוי למניעת עיוורון (מרכז קהילתי יהודי, משרת בחיל אוויר), קרנות בלתי מוגבלות למחלקת עיניים ממחקר למניעת עיוורון (RPB), ניו יורק וRPB הרפואי הסטודנטים המלגה גרנט (JCC).

1. הכנת רשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate עין העכבר. שימוש ביד אחת, לפתוח את עפעפי העין, כך שהעין גלויה. ביד השנייה, תוך שימוש במלקחיים מעוקלים כלפי מעלה (מול מעוגל), להפעיל לחץ על היבטים עליונים ונחותים של המסלול עד שבולט הגלובוס. בעדינות לסגור מלקחיים בחלק האחורי של העין ולהרים בתנועה רציפה לenucleate העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העין עם 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין במשך לפחות 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיניו את המקום בפתרון PBS בצלחת פטרי קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רשתית בזהירות מתחת למיקרוסקופ, מקפידים להימנע מגרימת דמעות גדולות. הפוך את חתך ראשוני בקרנית עם מספריים לנתיחה. ואז, תוך כדי לחיצה על אזור החתך עם מלקחיים ישרים, השתמש במספריים כדי לגזור לאורך הגבול של הקרנית ולובן עין הסרת הקרנית. באמצעות מלקחיים מעוקלים וישרים עדינים, בזהירות לקלף את לובן העין ורחוקה מהרשתית אל עצב הראייה דמית העין. צעד זה דורש סבלנות כמולשחרר את הרשתית במהירות יכול לגרום לדמעות. הסר את העדשה וכל קשתית עודפת ופסולת מהרשתית 16. </li></ol> 2. מים שוטפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשתית מניחה בצלחת ומכסים במים (כ 500 μl, מסונן עם לפחות מסנן מיקרומטר 45) 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מים כל דקות-1 שעות 30, לפחות 4-5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשאיר למשך לילה במים עם טלטול עדין בטמפרטורת חדר. </li></ol> הערה: שלבי הכביסה הם מאוד חשובים כפי שהוא לסייע להפריד בין שכבות רשתית עצביות מכלי הדם. 3. טריפסין דייג&#39;סט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים ואת רשתית דגירה בתמיסה של 3% טריפסין (Difco 1:250) ב0.1 מ &#39;טריס חיץ (pH 7.8) בשעה 37 ° C עם רעד עדין לא. טריפסין עיכול יושלם כאשר הרקמה מתחילה להראות סימני ההתפוררות (כ 1.5 שעות). שים לב: יש להימנע מטלטול מהירכמו זה יכול לגרום נזק לכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות, פיפטה טריפסין אל נפרד גם באמצעות מיקרוסקופ כדי להימנע מלגעת ברשתית. טריפסין עודף זה יכול לשמש מאוחר יותר, כאשר מניפולציה של כלי מתחת למיקרוסקופ, בשלב 4.3. </li></ol> 4. הפרדת כלי הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מים מסוננים לרשתית. לאחר מכן, אנסה לקלף את קרום הגבלה הפנימי עם מלקחיים, תוך שימוש במספריים במידת צורך. Shake עם תסיסה עדינה במשך 5 דקות. זהירות, פיפטה את המים מתחת למיקרוסקופ, כדי למנוע פגיעה ברשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שוטף למים (5 דקות כל אחד) כדי לסייע בחינם ברשת של כלי מרקמת הרשתית חסיד. שוטף מים הושלם כאשר יש לא מעט פסולת שנותרה במים לאחר שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניפולציות זהירות תחת מיקרוסקופ לנתיחה כעת זקוקה לחופשיים יותר את הרשת של כלי דם. להלן כמה טכניקות שימושיות, אשר עשוי לשמש ברצף או individually כדי להשיג את התוצאה הרצויה על בסיס העדפה טכנית: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה μl 200, פיפטה בזהירות מים למעלה ולמטה בסמוך לכלי שיט, שנושב בכלי מים, גורם לתסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה μl 200, פיפטה טריפסין למעלה ולמטה כדי לעזור קירות מעיל של פיפטה. ואז, בזהירות פיפטה רשת הכלי כולו למעלה ולמטה פעם אחת כדי לעזור לשבור את הרקמה ללא כלי דם. הערה: מרכוז קצה פיפטה בעצב הראייה ולא את הקצוות של רשת כלי הדם יכול גם למנוע מהם להידבק כלי דם ועד לקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בעדינות כלי דם עם מלקחיים עדינים מחוץ למים כדי לסלק רכיבים שאינם בכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצעדים הנ&quot;ל אינם עובדים, להוסיף טריפסין לרשתית כדי לעזור לשבור את הרקמה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות. לאחר מכן, להסיר טריפסין וחזור על שלבי 4.1-4.3. </li></ol></li></ol> &lt;חזקה&gt; הערה: הקפד מעיל כל המכשירים שבאים במגע עם הכלים בטריפסין (למשל פיפטה הקצה, מלקחיים). זה יעזור למנוע הדבקה של כלי דם לציוד. 5. לדמיין את כלי הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של מים לשקופית נקי. בעזרת פיפטה μl 200 או מלקחיים, להעביר את כלי מתעכלים אל תוך המים. ודא שטוח כלי דם ההר הוא פרש. מתח הפנים של המים מסייע לנפרש רשת כלי דם החברה שקופה. אם הרקמה לא להתפתח, להוסיף מים נוספים ובעדינות לנער את השקופית כדי להקל על התגלגלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את עודפי מים באיטיות רבה על ידי pipetting או בעזרת מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר שקופיות להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם שקופיות באמצעות פרוטוקול מתאים גם עם PAS / hematoxylin או H &amp; E כתם. הערה: PAS / hematoxylin שימושי לזיהוי קיר כלי וגרעיני הסלולר; H &amp; E היא שימושית עבור דemonstration של RBC גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים ולעלות (Permount הרכבה בינונית). </li></ol>

<ol><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li>
<li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li>
<li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRP%2Ftrypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li>
<li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model%3B+SHR%2FN%3AMcc-cp+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li>
<li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li>
<li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li>
<li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db%2Fdb+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li>
<li>Chapter 30. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diabetic+Retinopathy%22">Diabetic Retinopathy</a>. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).</li>
<li>Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenblatt%2C+B+%22Ophthalmology%22">Ophthalmology</a>. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).</li>
<li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li>
<li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li>
<li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li>
<li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li>
<li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%3A+a+model+of+vessel+loss%2C+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li>
<li>The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html">http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html</a> (2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

טריפסין עיכול הוא שיטה סטנדרטית על מנת להעריך בכלי הדם של הרשתית. למרבה הצער, זה מאתגר מבחינה טכנית ויכול לגרום לשיעור גבוה של אובדן דגימה אם לא מבוצע כהלכה. יתר על כן, ההליך הוא קשה במיוחד בעכברים, מה שיכול להגביל את היישום של טכניקה זו במודלים של בעלי החיים הגנטיים הנפוצים של מחלות עיניים. מאמר זה מספק הדרכה כיצד לבצע את ההליך בצורה יעילה ועקבי בעיני עכבר. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, חשוב כי הרשתי...

לדמיין את כלי הדם של הרשתית היא גישה מאוד חשוב לנתח את המנגנונים של מחלות עיניים שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית. זה מאפשר לאדם להעריך את ליקויים בכלי הדם המוקדמים, כולל microaneurysms, ניוון נימים, ואובדן pericyte 8,9. עד כה, היו מספר טכניקות שפותחו לניתוח בכלי הדם ברשתית. טפטוף של צבעים שונים נעשה שימוש כדי לסמן את הכלים, אבל כולם חלקו מגבלות דומות. לעתים רחוקות הזרקה מדגישה את כלי הדם ברשתית כולה, אלא אם כן ניתנו בלחץ גבוה, המסכן את פקיעת ופגיעה בכולים 1. Immunostaining של האנדותל של כלי דם שבכותרת fluorophore G isolectin B4 (אלקסה פלואוריד 594 מצומדות; I21413; Invitrogen; 1:100 דילול) וmounts שטוח רשתית יכול להדגיש את הארכיטקטורה הכוללת של כלי, אבל בלי הדמיה מפורטת של נימי דם, קרומי מרתף וpericytes . צוין על ידיפרידנוואלד שיכול להיות מודגש על ידי צביעת כלי שטוח mounts של רשתית עם תקופתי חומצה שיף (PAS) או hematoxylin ו eosin (H &amp; E) מכתים 10. עם זאת, הצביעה הייתה לא ספציפית לכלי, והדגישה את הרקמה ללא כלי הדם, כמו גם, ולכן קשה להבדיל בין הכלים. בשנתי ה -1960, קוגן וKuwabara פיתחה את הטכניקה לעכל טריפסין שעשה את זה קל יותר לדמיין את כלי הדם ברשתית על ידי לעכל את מרכיבי nonvascular של הרשתית 1. מאז אותו הזמן, לעכל טריפסין הפכה את שיטת תקן זהב בניתוח בכלי הדם של רשתית 2-5. עם זאת, חשוב לציין כי טכניקות חלופיות אחרות כדי לבודד את כלי הדם כבר תאר. השימוש בתמוגה האוסמוטי נעשתה שימוש כדי לבודד את כלי הדם ומאפשר מחקרים ביוכימיים של רקמת 11,12, אך ההליך לא נעשה שימוש כדרך עיקרי ללימוד אנטומי. שיטת הדפסת הרקמות כברמשמש לבודד חלקים גדולים של microvasculature ומאפשר את היכולת ללמוד ארכיטקטורת electrotonic של כלי הדם 13. בתאוריה, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את השינויים אנטומיים, כמו האיכות של כלי היא גבוהה. עם זאת, הוא רק הצליח לבודד מקטעים של רשת כלי הדם כולו. למרות ששיטות אלה לא יכולים להחליף טריפסין לעכל, חשוב לציין שיש להם יתרונות וחסרונות שונים ומשלימים בעניין זה. שיטת עיכול טריפסין היא מאתגרת מבחינה טכנית וקשה לביצוע באופן עקבי 6,7. יתר על כן, כבר ציין כי טריפסין לעכל קשה במיוחד במודל של עכברים, במיוחד אם אחד רצונות כדי לשמר את הארכיטקטורה הכללית של כלי הדם ברשתית 6,7. אתגרים כוללים (1) יתר מערכת העיכול של הרשתית שגורמת לאובדן של שניהם בכלי הדם, כמו גם רקמה ללא כלי דם, (2) מתחת לעיכול, הדורשיםנתיחה מכאנית נרחבת אשר עלולה להוביל לנזק של כלי המיטה, (3) הפרדה לקויה של הרקמות שאינן כלי דם מכלי הדם שמוביל לכתמים שאינם ספציפיים. כמה כתבי יד הדגישו האתגרים הללו, אבל אף סיפקו פרוטוקול מפורט ועקבי כדי להתגבר עליהם 14,15. כתב יד זה יציג מתודולוגיה צעד אחר צעד המפרטת את הטכניקה לביצוע לעכל טריפסין על רשתיות עכבר וחולדה עם עצות ספציפיות בטיפול בשלבים הקשים במיוחד. סקירה סכמטית מוצגת באיור 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>10% ניטרלי פורמלין</td><td>Fischer Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין (1:250)</td><td>Amresco</td><td>0458-50G</td><td>הכינו 3% טריפסין ב-0.1 M בסיס Tris</td></tr><tr><td>TRIZMA</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>צרו 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg; C)</td></tr> <tr><td>TRIZMA</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק ואקום סטרילי Steritop</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td>צור מים</td></tr><tr> מסוננים<td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק</td></tr><tr><td>>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td> מנתח <td>כל מיקרוסקופ המאפשר הדמיה טובה של הרשתית מספיק. (10x מספיק עם מרחק עבודה של 24 מ"מ)</td></tr><tr><td>מספריים ישרים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 15024-10</td><td>קצה חיתוך: 8 מ"מ; קוטר קצה: 0.2 מ"מ; 10 ס"מ</td></tr><tr><td>מלקחיים ישרים (Inox)</td><td>Dumont #5</td><td>11252-20</td><td>קצה ביולוגי; 0.05 x 0.02 מ"מ; 11 ס"מ</td></tr><tr><td>Forcepts מעוקלים (Dumostar)</td><td>Dumont #7</td><td>11297-10</td><td>קצה ביולוגי; 0.07 x 0.04 מ"מ; 11.5 ס"מ</td></tr><tr><td>Dubnoff מטבולי שייקר אינקובטור</td><td>דיוק מדעי</td><td>BDG59442</td><td>שייקר אופציונלי</td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>פלקון</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>VWR</td><td>82027-132</td><td></td></tr></tbody></table>

טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

טריפסין עיכול הוא שיטת תקן זהב לניתוח בכלי הדם ברשתית 1-5. זה מאפשר הדמיה של כל הרשת מורכב של כלי תלת ממדים ברשתית ונימי דם על ידי יצירת שטוח הר דו ממדי של כלי הדם המחוברים בין הערוצים לאחר עיכול של המרכיבים שאינם בכלי הדם של הרשתית. זה מאפשר לאדם ללמוד שינויים פתולוגיים בכלי הדם שונים, כגון microaneurysms, ניוון נימים, והאנדותל נורמלי ליחסי pericyte. עם זאת, השיטה היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד בעכברים, שהפך למודל של בעלי החיים באופן נרחב ביותר שקיימים כדי ללמוד את הרשתית בגלל הקלות של מניפולציות גנטיות 6,7. בעיני העכבר, זה קשה במיוחד להסרה מלא של רכיבים שאינם כלי הדם, תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם ברשתית. נכון להיום, קיים מחסור בספרות המתארת ​​את הטכניקה לעכל טריפסין בפירוט אניn העכבר. כתב יד זה מספק מתודולוגיה צעד אחר צעד מפורט של לעכל טריפסין ברשתית עכבר, תוך מתן גם טיפים על שלבים לפתרון בעיה קשים.

התוצר הסופי של הליך מוצלח הוא בעלת הר בכל הרשת של כלי הדם ברשתית העכבר, עם שמרה על האדריכלות, מוכתם גם PAS / hematoxylin או H &amp; E, כפי שמוצג באיורים 2-4. הבחנה ברורה של תאי האנדותל וpericytes ניתן לראות, כפי שמוצגת באיור 3. ברשתית, הגרעינים של תאי האנדותל הם סגלגלים או מוארכים ולשכב לחלוטין בתוך דפנות כלי הדם. גרעיני Pericyte הם קטנים, כדוריים, כתם בצפיפות ובאופן כללי יש לי עמדת תפוח של הנימים לאורך הקיר. <p class="jove_content" style=";te...

טריפסין עיכול הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר לניתוח כלי הדם ברשתית. כתב יד זה מתאר את השיטה בפירוט, כולל שינויים מרכזיים כדי לייעל את הטכניקה ולהסיר את הרקמה ללא כלי הדם תוך השמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם.

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד את הרשת הווסקולרית של הרשתית. זאת מושגים תחילה על ידי ביצוע סדרה של שטיפות מים ברשתית המבודדת. בשלב השני, הרשתית עוברת עיכול בטריפסין בטמפרטורה של 37 °C למשך כשעה עד שעה וחצי, בהתאם לגודל הרשתית.בשלב הבא, מערכת כלי הדם מבודלת באמצעות שטיפות נוספות במים ודיסקציה תחת מיקרוסקופ. בסופו של דבר, ניתן להוות ויזואליזציה לשינויים וסקולריים פתולוגיים כגון מיקרו-אניוריזמות, דגנרציה של נימי דם ויחס לא תקין בין תאי אנדותל לטפילים. לפיכך, היתרון המרכזי של שיטת ה-try and digest על פני שיטות קיימות, כגון הכנת דגימות רטינה שטוחות (retinal flat mounts), הוא שניתן להבליט את כל הרשת הוסקולרית בבהירות רבה.בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה, כיוון שהיא מאתגרת מבחינה טכנית וקשה לביצוע עקבי. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי הבידוד של כלי הדם קשה ללמוד באמצעות הסברים מילוליים בלבד. זהו כלי בעל ערך רב בכל מעבדה המבצעת מחקרים בביולוגיה של כלי הדם ברשתית, כגון מחקרים על מחלות כמו רטינופתיה סוכרתית. את הטכניקה זו ידגים ג'ונתן צ'ו (Jonathan Chow), סטודנט לרפואה מוכשר מהמעבדה שלי.לאחר קיבוע של עין עכבר שעברה אנוקלואציה בפורמלין בבফার ניטרלי בריכוז 10% למשך 24 שעות, הנח את העין בצלחת פטרי וכסה אותה בכמות קטנה של מים. התחל את הניתוח באמצעות מספרי ניתוח כדי לבצע בזהירות חתך ראשוני בקרנית. לאחר מכן, תוך כדי החזקת אזור החתך באמצעות פינצטה ישרה, השתמש במספריים כדי לחתוך לאורך הגבול שבין הקרנית ללובן העין (סקלרה) להסרת הקרנית.בשלב הבא, השתמש בפינצטות עדינות, מעוקלות וישרות, כדי לקלף באיטיות ובזהירות את הסקלרה והכורואיד מהרשתית לכיוון העצב האופטי. לאחר מכן, הסר את העדשה ואת כל שאריות הקשת והפסולת מהרשתית כדי לסייע בהפרדת שכבות הרשתית העצביות מכלי הדם.הוסיפו כ-500 µL של מים מסוננים ב-45 µm לפלטת 24 בארות, הניחו את הרשתית בבאר ולאחר מכן נערערו בעדינות במשך ארבע עד חמש שעות בטמפרטורת החדר, תוך החלפת המים מדי 30 עד 60 דקות. המשיכו לשטוף את הרשתית במים למשך הלילה עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר. למחרת, הסירו את המים והוסיפו 3% trypsin, ובדקו תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שלא נמצאו שרידים בבאר. כדי למנוע מהכלי הדם להיצמד אליה, דגרו את הרקמה ב-37 °C עם ניעור עדין או ללא ניעור למשך שעה עד שעה וחצי.כאשר הרקמה מתחילה להראות סימנים של התפרקות, הניחו את הפלטה עלבמת המיקרוסקופ והימנעו מהרשתית. הסירו בזהירות את ה-trypsin כדי להפריד את כלי הדם. תחילה, הוסיפו מים מסוננים לרשתית באמצעות פינצטה.קלפו את קרום הגבול הפנימי (internal limiting membrane), הנראה כשכבה דקה ושקופה. נערו את הפלטה בתנועות עדינות. לאחר חמש דקות, הניחו את הפלטה שוב על במת המיקרוסקופ והחזירו בזהירות את המים, תוך הימנעות מפגיעה ברשתית, כדי לסייע בשחרור רשת כלי הדם מהרקמת הרשתית הדבוקה.שטפו את הרשתית כפי שהודגם כעת, עד שיישאו מעט מאוד או שום שרידי רקמה במים לאחר השטיפה האחרונה. בדרך כלל, הסרת כל הרקמה שאינה כלי דם היא החלק המורכב ביותר בפרוצדורה. ניתן להשתמש בטכניקות הבאות באופן רצף או בנפרד. כדי להקל על בידוד רשת כלי הדם, טיפ חשוב אחד הוא לטבול את כל הכלים ואת ה-trypsin לפני הטיפול ברשתית.פעולה זו יכולה לסייע במניעת הידבקות של הרקמה לציוד. יש לצפות קצה של מיקרופיפט של 200 microliter ב-trypsin שהוקצב לכך, ולאחר מכן לשאוב ולהזרים מים בזהירות, בסמוך לכלי הדם ברשתית ובכיוונם, כדי ליצור ערבול עדין. אם הרקמה הלא-כליית עדיין עמידה במרכז, יש להניח את קצה המיקרופיפט המצופה ב-trypsin בעצב האופטי ולשאוב ולהזרים בזהירות את כל רשת כלי הדם כדי לסייע בפירוק הרקמה הלא-כליית.לבסוף, ניתן להשתמש בפינצטה כדי להרים בעדינות את כלי הדם מהמים כדי להסיר רכיבים לא-כליים הדבקים אליהם. התוצאה הסופית צריכה להיות רשת של כלי דם רטינליים שלמה ללא פסולת.כדי להדגים את כלי הדם, יש להניח תחילה טיפת מים על זכוכית חפיה נקייה. לאחר מכן, העבירו את כלי הדם שעברו עיכול אל תוך המים תחת בקרה במיקרוסקופ. אם הרכבת ה-VAs flap היא מקופלת או פתוחה, כלי דם מקופלים יובילו לנראות נמוכה.במהלך הצביעה, אם הרקמה מקופלת, יש להוסיף מים ולנער בעדינות את הפסית כדי לסייע בפתיחת הקיפול. לאחר מכן, השתמש במיקרופיפט כדי להסיר לאט את עודפי המים. התוצר הסופי של פרוצדורה מוצלחת הוא דגימה שטוחה (flat mount) של כל רשת כלי הדם ברשתית העכבר, כאשר הארכיטקטורה נשמרת והדגימה צבועה ב-hematoxylin and eosin.כפי שמוצג כאן, כפי שניתן לראות בתמונה זו, ניתן להבחין בהבדל ברור בין התאים האנדותלייליים לבין הפריציטים ברשתית. הגרעינים של התאים האנדותלייליים, כפי שסומנו על ידי החץ הלבן, הם אובליים או מוארכים ונמצאים כולם בתוך דופן כלי הדם. גרעיני הטפיל, המסומנים על ידי החץ השחור, הם קטנים, כדוריים, נצבעים בצורה דחוסה, ובדרך כלל נמצאים בעמדה בולטת לאורך דופן הנימא.טריפסין ועיכול (Trypsin and digest) הוא הליך נפוץ המשמש לניתוח פתולוגיה וסקולרית במודלים של בעלי חיים עם סוכרת. תמונה זו מציגה דוגמה לניוון של נימי דם, כפי שמצוין על ידי החץ הלבן, שנצפה בעכבר DB DB, המהווה מודל לסוכרת מסוג 2. למרות שהליך זה עבר אופטימיזציה עבור רשתית של עכברים, ניתן להשיג תוצאות דומות גם ברשתית של חולדות.חשוב לציין כי רשתות של חולדות, כפי שמוצג בתמונות אלו, גדולות יותר מרשתות של עכברים ודורשות 12 פלטות במקום 24. רשת כלי הדם של רשתית החולדה היא גם פחות שבירה מזו של העכבר. חיוני ביותר להסיר כמה שיותר מרקמה שאינה וסקולרית.כל שארית שתישאר תוביל לצביעה לא ספציפית ותגרום לוויזואליזציה לקויה של כלי הדם. בתמונה זו, לדוגמה, ניתן להבחין בהסרה לא מוצלחת של כל הרקמה הבלתי-כלית. באופן דומה, חשוב שהרשתית תהיה פרוסה בעת העלייה למסבך כדי לשפר את הוויזואליזציה של כלי הדם.תמונה זו מציגה פריסה לא מוצלחת של דגימת כלי דם שטוחה (vascular flat mount). לאחר שליטה בפרוצדורה טכנית קשה זו, שיטות של פריסה ועיכול יכולות להוות כלי בעל ערך רב המאפשר ויזואליזציה מפורטת של רשת כלי הדם כולה.על ידי שיפור טכניקה זו בעין של עכבר, חוקרים יכולים לנצל עכברים שעברו מניפולציה גנטית כדי לחקור מסלולים שונים העשויים לשלוט בכלי הדם של הרשתית, ובכך להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות רשתית שונות. כתוצאה מכך, נוכל לשפר את הבנתנו לגבי פתולוגיות של מחלות כגון רטינופתיה סוכרתית. מחקר של מודלי עכברים, כגון עכבר DVDB, עשוי לאפשר בסופו של דבר את ההזדמנות למצוא התערבויות טיפוליות פוטנציאליות חדשות המכוונות לכלי הדם של הרשתית.

trypsin-digest-protocol-to-analyze-retinal-vasculature-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הרשתית המכרסם כבר זמן רב מוכרת כחלון נגיש למוח. במאמר זה טכני אנו מספקים פרוטוקול אשר מעסיק את מודל העכבר של מחלת רשתית הנגרמת חמצן כדי ללמוד את המנגנונים שיובילו לכישלון של התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית, לאחר פגיעה איסכמית. המערכת המתוארת גם ניתן לרתום לבחון אסטרטגיות לקידום צמיחה מחודשת של כלי דם פונקציונליים בתוך הרשתית ומערכת העצבים המרכזית.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

מחלות רבות סכנת חזון עינית משויכות לקוי microvessels ברשתית. לכן, המדידה של תגובות arteriole ברשתית הוא חשוב לחקור את המנגנונים הקשורים pathophysiological המשמש כבסיס. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור בידוד arteriole רשתית העכבר והכנות כדי להעריך את ההשפעות של חומרים vasoactive על קוטר כלי הדם.

שלבי הכנה מדידה של תגובתיות ב העכבר רבים ברשתית Vivo לשעבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת להכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של תושבות שטוחות רשתית של עכברים וניתוח. השימוש באנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) עבור גורי עכברים ועיבוד תמונה מתוארים בפירוט גם כן.

ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן

מתואר כאן פרוטוקול מפורט לביצוע בדיקת מתח מיטוכונדריאלית ובוחן קצב גליקוליטי בדגימות רקמת רשתית ex vivo באמצעות ביואנלייזר מסחרי.

קביעת נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בדגימות רקמת רשתית Ex Vivo

רטינופתיה סוכרתית היא אחד הגורמים המובילים לעיוורון. היסטולוגיה, בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית הן טכניקות בעלות ערך להבנת הפתופיזיולוגיה של הרשתית, אשר יכול לשפר עוד יותר את ההקרנה היעילה של סמים נגד רטינופתיה סוכרתית.

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

מאמר זה מתאר בדיקת כתמי לציטין מבוססת וניתן לשחזור עבור כל ההכנות לרשתית ההר ואת הפרוטוקולים הנדרשים למדידה כמותית של פרמטרים וסקולריים משתנים לעתים קרובות ברטינופתיות שגשוג ולא מתרבות.

כימות של פרמטרי כלי דם ברשתיות הר שלמות של עכברים עם רטינופתיות שאינן מתרבות ושגשוגות

מוצג כאן פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה מפורט כדי לזהות, לאמת ולמקד קספאזות רלוונטיות מבחינה תפקודית ברקמות מורכבות.

כימות של Caspase-9 מוכתם חיסונית ברקמת הרשתית

מודלים של עכברים יכולים להיות כלים שימושיים לחקר הביולוגיה של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE). נקבע כי עכברים יכולים לפתח מערך של פתולוגיות RPE. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ כדי להבהיר ולכמת פתולוגיות RPE בעכברים באמצעות אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל

בדיקת הגנה פותחה כדי לעקוב אחר עמידות כלי הדם ברשתית למוות מעלבונות הקשורים לסוכרת / רטינופתיה סוכרתית כגון מתח חמצוני וציטוקינים.

בדיקה לגילוי הגנה על כלי הדם ברשתית מפני מוות הקשור לסוכרת בעכברים

לאחרונה זיהינו התקשות נימי רשתית כפרדיגמה חדשה לתפקוד לקוי של הרשתית הקשור לסוכרת. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לבידוד נימי הרשתית של עכבר והמטריצה התת-אנדותלית מתרביות אנדותל ברשתית, ולאחר מכן תיאור של טכניקת מדידת הנוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

הפריציטים בכלי הדם ברשתית נבדקו על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עם β קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות דם לאחר הזרקה רטרו-אורביטלית של לקטין עגבניות פלואורסצנטי. הרשתית המסומנת טופלה עוד בשיטת ניקוי הרקמות והותקנה בשלמותה להמחשת התצוגות התלת מימדיות של פריציטים המקיפים את כלי הדם ברשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

הדמיה תלת מימדית של פריציטים וסקולריים ברשתית בעכברים על ידי צביעה חיסונית 

למד את שיטת עיכול הטריפסין לניתוח כלי הדם ברשתית בעכבר. שיטה זו מאפשרת בידוד רשתית כלי הדם תוך שמירה על מבנה כלי הדם והדגשת שינויים פתולוגיים כמו מיקרו-אנויריזמות וניוון נימי.

טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר

גלה סרטונים נוספים