אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

הליך זה כולל קולוניזציה של הלוע האף-מורן עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס ומיצוי לאחר מכן של חיידקים מתיישבים כמו גם תאים דבקים או מגויסים. זה מושג על ידי הכנת חיסון חיידקי לדלקת ריאות S. מתח של עניין.

לאחר מכן החיידקים החיים מועברים דרך האף לעכברים מורדמים כשהם נמצאים במנגנון ריסון לאחר משך הקולוניזציה הרצוי, עכברים מורדמים ושטיפת האף מבוצעת על ידי קנולציה של קנה הנשימה החשוף שלהם ושטיפת התוכן החוצה דרך האף. ניתן לכמת את מספרי החיידקים הקיימים בשטיפת האף באמצעות שיטות מיקרוביולוגיות. לחלופין, ניתן לבחון תגובות חיסוניות באמצעות טכניקות ציטומטריית זרימה לתאים מגויסים פנוטיפ או טכניקות PCR כמותיות.

כדי למדוד רמות של mRNA מבוטא מעניין לפני שמתחילים, תצטרך להכין מאמצי עכברים לחלק ההתיישבות התוך-אפית של ההליך ומחטים משופרות לשטיפת האף. ניתן להכין מסנן עכבר פשוט על ידי חיתוך הקצה המחודד של צינור בז של 50 מיליליטר. לאחר שיצרת את הצמצם, הקפד להשתמש במספריים כדי ללטש קצוות חדים.

להכנת מחטים משופרות, תזדקק לצינורות פוליאתילן PE 20 הבאים בקוטר פנימי של 0.38 מילימטרים. מזרק מיל אחד מכוסה במחטים משופעות בגודל 26 ושלוש שמונה, זוג קשתית חדה ועדינה, מספריים וזוג מלקחיים. חותכים את צינור PE 20 עם המספריים העדינים לחתיכות באורך של כ -2.5 סנטימטרים או סנטימטר אחד, ומוודאים שלכל קצה יש קצה משופע.

בעזרת המלקחיים החלק בזהירות את אחד החלקים הללו על קצה המחט שלך. הימנעות מניקוב צד הצינור, ניתן לשמור מחטים משופרות באתנול 70% עד הצורך ולשטוף עם PBS ישירות לפני השימוש. עבור קולוניזציה תוך-אפית של עכברים עם S pmo, אנו ממליצים להשתמש בריכוז של 10 עד תשע יחידות יוצרות מושבה למיל המועברות ב-10 מיקרוליטר.

למנה אחרונה של 10 עד 7 יחידות יוצרות מושבה, שמרו את החיסון על קרח עד רגע לפני השימוש והקפידו לערבב בין כל קולוניזציה. בנוסף לחיסון, תזדקק גם לקצות פיפטה מעוקרות P 10 או P 20 ולמסנן העכבר שלך. בודד עכבר בודד בזנבו ורסן אותו על ידי הכנסתו למנגנון ריסון העכברים שהוכן בעבר.

אם אתה מתקשה לכוון את העכבר לתוך המרסן, זה עשוי לעזור למקם אותו לפני ומעל העכבר, ולאפשר לבעל החיים לזחול כלפי מעלה. ברגע שהעכבר נמצא בתוך המרסן, אבטח אותו בבסיס גופו ודחף אותו בעדינות כלפי מעלה כך שאפו ייצא מהקצה המחודד של המרסן. באמצעות פיפטה P 10 או P 20 חיסנו כל עכבר על ידי הפקדת 10 מיקרוליטר מהתרבית המוכנה, והפצתה באופן שווה בין שניהם. נארס.

אפשרו לחיסון לטפטף לתוך האף על ידי פעימת החיסון בהדרגה, ולקחת את הזמן הדרוש לעכבר לשאוף את החיסון. העכבר עלול להתעטש חלק מהחיסון מהאף, וזה צפוי. שימו לב שיש להרדים עכברים לצורך הליך זה כדי להבטיח שהחיידקים יישארו מקומיים בלוע האף ולא יתפשטו לדרכי הנשימה התחתונות.

לצורך הדגמה זו אנו מחסנים ב-PBS, אך בכל פעם שעובדים עם חיידקים חיים, הקפידו לבצע את ההליך על פי הנחיות המכון. לדוגמה, רוב המוסדות ידרשו שהקולוניזציה תתבצע במכסה מנוע ברמה 2 של בטיחות ביולוגית. אם אתה משתמש במדדי משקל כחלק מדרך ניטור נקודת הקצה שלך, MA מיד לאחר הקולוניזציה, עקוב אחר עכברים כל 12 עד 24 שעות לאיתור תסמינים קליניים כולל עייפות, פרווה פרועה וירידה במשקל.

לאחר שהעכברים מתיישבים, שמור אותם למשך הזמן הרצוי. בתום תקופה זו, עכברים יעברו המתת חסד ושטיפת האף מתבצעת מכיוון שפריקת צוואר הרחם עלולה לפגוע בקנה הנשימה. יש להימנע משיטה זו של המתת חסד.

לפני ביצוע שטיפת אף, ודא שיש לך את הדברים הבאים בהישג יד. מחטים משוכללות שהוכנו בעבר, אתנול מימי 70%, זוג מלקחיים, זוג מספריים חדים של קשתית עדינה, פוספט, מי מלח חוצצים, מאגר ליזה RNA וצינורות עינור של מיל אחד. ברגע שאתה מוכן להתחיל, הניח את החיה שטוחה על גבה, ובעזרת אתנול מימי 70% עקר את החלק הקדמי של פרוותה, במיוחד את אזור הצוואר.

לדאוג למנוע מאתנול גישה לנארס. בצע חתך אורכי יחיד לאורך קו האמצע של צוואר החיה, ואפשר לעצמך ליצור פתח כדי לדמיין את קנה הנשימה. יש לקלף בזהירות את העור משני הצדדים ולחשוף את רקמת הצוואר שמתחתיו.

בשלב זה, קנה הנשימה צריך להיות גלוי מוקף בשרירי אורך משני הצדדים. גזור אותם בזהירות כדי לספק תצוגה ברורה של קנה הנשימה עצמו, תוך הקפדה לא לחתוך את כלי הדם שמסביב. במקרה שאתה חותך בטעות את כלי הדם ודם נמצא באזור לפני ההמשך.

אפשר לדימום להיפסק ולאחר מכן נקה את האזור מספר פעמים על ידי הוצאת PBS סטרילי ושימוש בגזה סטרילית כדי לספוג בעדינות עודף לחות. לאחר שקנה הנשימה נחשף כראוי, בצע חתך חצי ירחי רוחבי בקנה הנשימה בערך באמצע הדרך למעלה. זרוק PBS סטרילי למזרק קנול.

הכנס את הצינורית לקנה הנשימה לכיוון האף, תוך שמירה על הקצה המשופע כלפי מטה כדי להקל על ההחדרה. לאחר שהצינורית במקומה, סובב ב-180 מעלות ובדוק בעדינות כלפי מעלה עד שתרגיש התנגדות קלה. הנח את צינור ה-EEND DPH המיועד לאיסוף דגימות ממש מתחת לאף העכבר.

בדוק את המיקום הנכון של הצינורית על ידי הוצאת כמות מינימלית של נוזל שטיפה PBS. לאחר מכן, אמורה להיווצר טיפת נוזל סביב ה-NAS של העכבר אם הצינורית ממוקמת כהלכה. אם PBS הבדיקה יוצא ישירות מפיו של בעל החיים, משוך את הצינורית לאחור ומקם אותה שוב על ידי גישוש עדין קדימה עד שתורגש התנגדות קלה מאוד.

הקפד לא לדחוף את הצינורית רחוק מדי מעבר להתנגדות זו מכיוון שתזיז אותה מעבר לחיך האף ודרך חלל הפה. לאחר שתאשר שהצינורית ממוקמת כהלכה, המשך להוציא 200 מיקרוליטר PBS במהירות כדי לעזור לעקור ולאסוף את כמות התאים המקסימלית. התוכן צריך לזרום החוצה דרך נרס העכבר ואל צינור האיסוף.

מניחים את הדגימה מיד על קרח. לאחר מכן ניתן לבחון דגימות אלה עבור עומס חיידקים כמו גם גיוס תאים. כדי לאסוף דגימות לניתוח RNA, השתמש במחט קנולטיבית נפרדת המכילה 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה RNA כדי לבצע שטיפת אף משנית.

שימו לב שמאגר הליזה של ה-RNA יכחיש את האפיתל ויהרוס את הרקמה שמסביב. לכן יש להקפיד להימנע ממגע עם איברים כמו הריאות. אם רצוי לשמור על רקמות אלה כדי לכמת את העומס החיידקי של האף-לוע, תזדקק לדברים הבאים.

צינורות אפיקור, צלחות מיקרוביולוגיות המכילות ביצת סויה טריפטיכון מתווספות ל-5% דם כבשים. מערבל מערבולת, קצות פיפטות סטריליות PBS ופיפטות P 20 ו-P 200. תחילה עובדים בשני מכסה מנוע BSL, הכינו סדרת דילול סדרתי לכל דגימת שטיפת אף של מירין.

באופן כללי, ניתן לצפות שריכוזי S pneumoniae בלוע האף יהיו בין 0 ל-10 ל-4 CFU. לכן, בצע דילול סדרתי פי עשרה, הוסף 10 מיקרוליטר מדגימת שטיפת האף המסודרת לצינור הראשון לריכוז של 10 למינוס CFU אחד למיל, והמשך כלפי מטה עד שדיללת שלוש דגימות מערבולת מוגזמת ביסודיות בין כל דילול. שימו לב שהסרטון הזה נועד למטרות הדגמה בלבד.

יש להקפיד תמיד על טכניקת מעבדה נכונה, כולל החלפת קצות הפיפטה בין דילו באמצעות חד, לחלק אותו בחזרה לצלחת הלוגית שלך לרבעים ולתייג את הרבעים עם הדילול המתאים שיצופה עליו. צלחת שלוש טיפות של 10 דגימות מיקרוליטר מכל אחת מהדילול שלך על צלחת האגר. הניחו לאלה להתייבש במשך 15 עד 30 דקות ללא כיסוי ואז כסו את הצלחות והניחו הפוך בחממת חיידקים עם תנאים אופטימליים לצמיחת פנאומוקוק, בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

דגרו על צלחות אלה למשך 24 עד 48 שעות. לאחר פרק זמן זה, הסר את הצלחות וקבע את מספר החיידקים המתיישבים על ידי חישוב ממוצע המושבות שנוצרו על הצלחת. עבור כל דילול, ניתן לזהות מושבות אנימו לפי צבע הבז' הייחודי שלהן, אזורי המוליזה אלפא שלהן, שהם הילות קטנות סביב כל מושבה, שנוצרות על ידי עיכול חיידקי של תוסף הדם באגר.

ולבסוף, על ידי שקעים קטנים במרכז כל מושבה המעניקים לה מראה של אריתרוציטים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה מוצקה כיצד להקים PMO של האף, קולוניזציה בעכבר, כיצד לבודד חיידקים ותאים מהאף של עכבר לאחר קולוניזציה, באמצעות שטיפת אף וכיצד לכמת את העומס החיידקי המתאים באמצעות טכניקות מיקרוביולוגיות. אנו מקווים שהשיטות המתוארות בסרטון זה יעודדו אותך להשתמש במודל תוך-אף של קולוניזציה כדי לחקור את תגובות המארח לפתוגנים בהקשר של אזור זה שאינו נחקר