אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

הליך זה כולל יישוב של הנאזו-פרינקס (הלוע האפי) של עכבר באמצעות *Streptococcus pneumoniae*, ולאחר מכן מיצוי של החיידקים המיישבים וכן תאים דבקים או גויסים. הדבר מבוצע תחילה על ידי הכנת תמיסת接חיידקים (inoculum) של זן ה-*S. pneumoniae* הרלוונטי.

לאחר מכן, מזריקים את החיידקים החיים באופן תוך-אפי (intranasally) לעכברים שהורדמו בזמן שהם נמצאים במכשיר קיבוע. לאחר משך הזמן הרצוי של הקולוניזציה, העכברים מושמדים (euthanized) ומבוצעים שטיפות נזאליות על ידי קנולציה של הקנה החשוף ושטיפת התכולה דרך הנחיריים. ניתן לכמת את מספר החיידקים שנמצאים בשטיפות הנזאליות באמצעות טכניקות מיקרוביולוגיות. לחלופין, ניתן לבחון תגובות חיסוניות באמצעות טכניקות של ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) לצורך אפיון התאים שגויסו, או באמצעות טכניקות של PCR כמותי (quantitative PCR).

כדי למדוד את רמות ה-mRNA המבוטא של גן העניין לפני התחלת העבודה, יהיה עליך להכין מחזיקי עכברים עבור שלב הקולוניזציה תוך-אפית וסיכות קנולציה עבור שטיפות האף. ניתן להכין מחזיק עכברים פשוט על ידי חיתוך הקצה המצרף של מבחנת פלקון בנפח 50 milliliter. לאחר יצירת הפתח, ודא כי השתמשת במספריים כדי להחליק כל קצה חד.

להכנת מחטים עם קנולה, תזדקקו לצינוריות פוליאתילן PE 20 בעלות קוטר פנימי של 0.38 מילימטרים. מזרק של 1 מיליליטר המצויד במחטים בעלות קצה חתוך (beveled) במידה 26 ו-3/8, זוג מספרי איריס דקים וחדים, וזוג פינצטות. גזרו את צינוריות ה-PE 20 בעזרת המספריים הדקים לחתיכות באורך של כ-2.5 סנטימטרים או אינץ' אחד, תוך וידוא שלכל קצה יש טיפ חתוך.

בעזרת הפינצטה, החליקו בזהירות את אחד מהחלקים הללו על קצה המחט. כדי למנוע ניקור של צד הפיתול, ניתן לשמור מחטים קנוליות ב-70% ethanol עד למועד השימוש, ולשטוף אותן ב-PBS מיד לפני השימוש. עבור קולוניזציה תוך-אפית של עכברים עם S pmo, אנו ממליצים להשתמש בריכוז של 10 to the nine colony forming units per mil המוגש ב-10 µL.

עבור מינון סופי של 10⁷ CFU, שמרו את התוסיף על קרח עד רגע לפני השימוש וודאו כי אתם מערבבים בין כל פעולת התיישבות. בנוסף לתוסיף, תזדקקו גם לפיפט P 10 או P 20, טיפים סטריליים למסננת ומחזיק עכברים. בודדו עכבר בודד באמצעות הזנבו וקבעו אותו על ידי הנחתו במכשיר מחזיק העכברים שהכנתם מראש.

אם אתם נתקלים בקושי בהכנסת העכבר למכשיר הריסון, ניתן להציב את המכשיר לפני העכבר ומעליו, כדי לאפשר לבעל החיים לזחול כלפי מעלה. ברגע שהעכבר נמצא בתוך מכשיר הריסון, ייסבו אותו בבסיס גופו על ידי דחיפה עדינה כלפי מעלה, כך שאפו המכשיר תבלוט מהקצה המצומצם של המכשיר. באמצעות פפית P 10 או P 20, חסנו כל עכבר על ידי הזרקת 10 µl מהתרבית שהוכנה, תוך חלוקה שווה בין שתי הנחיריים.

אפשרו לתמיסת ההוצאה (inoculum) לטפטף אל תוך האף על ידי הזרקה פולסית הדרגתית, תוך הקצאת הזמן הדרוש לעכבר כדי לשאוף את התמיסה. ייתכן שהעכבר יעטש חלק מהתמיסה החוצה מהאף, דבר הצפוי מראש. שימו לב שיש להרדימ את העכברים לצורך הליך זה כדי להבטיח שהחיידקים יישארו מקומיים בנזוף (nasopharynx) ולא יתפשטו למסכת הנשימה התחתונה.

לצורך הדגמה זו, אנו מחדירים PBS, אך בכל פעם שעובדים עם חיידקים חיים, ודאו כי הפרוצדורה מבוצעת בהתאם להנחיות המאושרות על ידי המוסד. לדוגמה, רוב המוסדות ידרשו כי הקולוניזציה תתבצע במנדף בבטיחות ביולוגית ברמה 2 (biosafety level two). אם אתם משתמשים במדדי משקל כחלק מניטור נקודת הסיום, שקלו את העכברים מיד לאחר הקולוניזציה, ונטרו אותם כל 12 עד 24 שעות לאיתור סימנים קליניים, כולל לתרגיה, פרווה מקומטת וירידה במשקל.

לאחר שהעכברים קולוניזים, שמרו אותם למשך פרק הזמן הרצוי. בתום תקופה זו, העכברים יומתתו והליך שטיפת נזג (nasal lavage) יבוצע, שכן פריקה צווארית עלולה לגרום לנזק בטרכאה. יש להימנע משיטה זו להמתה.

לפני ביצוע שטיפות אף, ודאו שכל הפריטים הבאים זמינים עבורכם: מחטים קנוולות שהוכנו מראש, ethanol מימי 70%, פינצטה, מספרס איריס דקים וחדים, phosphate, buffered saline, בופר לליזיס של RNA, ואנבוני מיקרוצנטור של 1 mL. לאחר שאתם מוכנים להתחיל, השכיבו את בעל החיים על גבו, ובעזרת ethanol מימי 70% סטריליזרו את פרוותו בחלקו הקדמי, ובמיוחד את אזור הצוואר.

הקפידו למנוע חדירה של אתנול לנרתים. בצעו חיתוך א अनुבדי אחד לאורך קו האמצע של צוואר בעל החיים, כך שייוצר פתח המאפשר לראות את קנה הנשימה. קלפו בזהירות את העור לשני הצדדים כדי לחשוף את רקמת הצוואר שמתחתיו.

בשלב זה, הקנה אמור להיות גלוי כאשר הוא מוקף בשרירים אורך משני צדדיו. גזרו אותם בזהירות כדי לאפשר ראייה ברורה של הקנה עצמו, תוך הקפדה לא לחתוך את כלי הדם הסובבים. במקרה שחתכתם בטעות את כלי הדם וקיים דם באזור, יש לנקות אותו לפני ההמשך.

המתן עד להפסקת הדימום, ולאחר מכן נקה את האזור מספר פעמים על ידי שפיכת PBS סטרילי והספגה עדינה של עודפי הלחות בעזרת גזה סטרילית. לאחר חשיפה נאותה של הקנה, בצע חתך חצי-סהרני רוחבי בקנה, בערך במחצית הגובה שלו. העבר PBS סטרילי למזרק עם קנולה.

החדירו את הקנולה לקנה הנשימה לכיוון האף, כאשר הקצה המשופע פונה כלפי מטה כדי להקל על ההחדרה. לאחר שהקנולה במקומה, סובבו אותה ב-180 מעלות וגששו בעדינות כלפי מעלה עד להססתו של התנגדות קלה. מקמו את צינור ה-EEND DPH המיועד לאיסוף הדגימה ממש מתחת לאפו של העכבר.

יש לבדוק את מיקומה הנכון של הקנולה על ידי הזרקת כמות מזערית של נוזל שטיפה PBS. לאחר מכן, אם הקנולה ממוקמת נכון, צריכה להיווצר טיפת נוזל סביב ה-NAS של העכבר. אם ה-PBS לבדיקה יוצא ישירות מהפה של בעל החיים, יש למשוך את הקנולה לאחור ולמקום אותה מחדש על ידי דחיפה עדינה קדימה עד להתרגשות של התנגדות קלה מאוד.

היזהרו לא לדחוף את הקנולה רחוק מדי מעבר להתנגדות זו, שכן הדבר יגרום לה להחליף את החיך הנחיר ולעבור אל חלל הפה. לאחר שווידאתם שהקנולה ממוקמת נכון, המשיכו להזרים במהירות 200 µL של PBS כדי לסייע בדחיפה ובאיסוף של כמות מקסימלית של תאים. התוכן אמור לזרום החוצה דרך הנחיריים של העכבר ואל תוך מבחנת האיסוף.

הנח את הדגימה מיד על קרח. ניתן לבצע בדגימות אלו מדידה מאוחרת של העומס החיידקי וכן של גיוס תאים. כדי לאסוף דגימות לניתוח RNA, השתמש במחט קנולה נפרדת המכילה 500 microliters של תמיסת ליזיס ל-RNA לביצוע שטיפה נזאלית משנית.

שימו לב כי בופר הליזה של ה-RNA יפשיט את האפיתל וישמיד את הרקמה שמסביב. לכן, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע מגע עם איברים כגון הריאות. אם ברצונכם לשמר רקמות אלו כדי לכמת את העומס החיידקי בנזופרינקס, תזדקקו לדברים הבאים.

מבחנות Epicor, צלחות מיקרוביולוגיות המכילות triptych soy egg מועשרו ב-5% sheep's blood. מערבל vortex, פיפטיות סטריליות של PBS ופיפטיות P 20 ו-P 200. ראשית, בעבודה תחת מנדף BSL two, הכין סדרת דילול עבור כל דגימת שטיפת אף של mirin.

באופן כללי, ניתן לצפות שריכוזי S pneumoniae בנזל ובבלעופרת יהיו בין אפס ל-10⁴ CFU. לכן, בצעו שלושה דילוולים סדרתיים של פי עשרה, הוסיפו 10 µL מדגימת שטיפת האף הבלתי מהולה למבחנה הראשונה עד לריכוז של 10⁻¹ CFU למיל', והמשיכו כלפי מטה עד לדילול של שלוש דגימות; בצעו ערבוב מסיבי באמצעות וורטקס (vortex) בין כל דילול. שימו לב שסרטון זה נועד למטרות הדגמה בלבד.

יש להקפיד תמיד על טכניקת מעבדה נכונה, כולל החלפת טיפי פפטה בין הדילוציות. בעזרת טוש Sharpie, חלק את הצלחת הלוגית שלך לרבעים וסמן כל רבע עם הדילוציה המתאימה שיש להזריע בו. הזריע שלוש טיפות של דגימות בנפח 10 µL מכל אחת מהדילוציות שלך על צלחת האגר. השאר אותן להתייבש במשך 15 עד 30 דקות ללא כיסוי, לאחר מכן כסה את הצלחות והנח אותן הפוך באינקובטור בקטריאלי בתנאים אופטימליים לצמיחת פנומוקוקים, בדרך כלל 37 °C ו-5% CO2.

דגרו את המצעים הללו למשך 24 עד 48 שעות. לאחר פרק זמן זה, הוציאו את המצעים וקבעו את מספר החיידקים שהתנחלו על ידי חישוב ממוצע המושבות שנוצרו על המצע. עבור כל דילול, ניתן לזהות מושבות animo לפי צבען הבז' המובהק ולאפילוני האלפא-המוליזה שלהן, שהם הילות קטנות סביב כל מושבה, הנוצרות כתוצאה מעיכול חיידקי של תמצית הדם בתוך האגר.

ולבסוף, על ידי שקעים קטנים במרכז כל מושבה המעניקים לה מראה של אריתרוצית. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה מוצקה של האופן שבו ניתן לבסס קולוניזציה של nasopharyngeal es pmo בעכבר, כיצד לבודד חיידקים ותאים מהנסופרינקס של עכבר לאחר קולוניזציה באמצעות שטיפת אף (nasal lavage), וכיצד לכמת את העומס החיידקי התואם באמצעות טכניקות מיקרוביולוגיות. אנו מקווים שהשיטות המתוארות בסרטון זה יעודדו אתכם להשתמש במודל קולוניזציה תוך-אפי ללימוד תגובות המאכסן למפתגנים בהקשר של אזור זה, שטרם נחקר מספיק.