נחישות של חומצות שומן נסבלות וריכוזי רעלן הכולרה שימוש בתאי אפיתל במעי אדם ומקרופאגים עכבר BALB / ג

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע ריכוזים סביליים של חומצות שומן ושל רעלן הכולרה שאינם משפיעים לרעה על הישרדות התאים. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול של סוג התאים המתאים. השלב השני הוא דגירה של התאים עם ריכוזים משתנים של שלוש חומצות השומן לבדיקה או עם רעלן הכולרה.

לאחר 24 שעות, הישרדות התאים מוערכת באמצעות בדיקת MTT. בסופו של דבר, נתוני הספקטרומטריה מבדיקת ה-MTT מראים את הריכוזים האופטימליים של חומצות שומן ורעלים של כולרה שבהם ניתן לטפל בתאים ללא הפחתה משמעותית בהישרדותם. להשלכות של טכניקה זו יש חשיבות למניעת זיהומי כולרה, כיוון שחיסונים אינם תמיד מצליחים.

בכל מדידות הרעלן co ייעשה שימוש במקרופגים של Moose musculus מעכברי bowel C, ולמדידות ריכוז של חומצות שומן בקנה מידה רחב יותר, התאים יורבו באחד משני מצעים: DMEM עם L glutamine בתוספת 10% fetal bovine serum ו-1% antibiotic antimycotic, או מצע בסיס RPMI 1640 בתוספת 10% fetal bovine serum, 5% L-glutamine ו-1% antibiotic antimycotic. עבור פרוטוקול זה, יש לגדל את תאי bowel C בבקבוקי Corning של 75 centimeter square עם פקקים מאווררים בטמפרטורה של 37 °C, 95% אוויר ו-5% carbon dioxide. למדידות ריכוז של חומצות שומן בקנה מידה מדויק, יש להשתמש בתאי אפיתל של מעי אנושי המורבים בבקבוקי Corning של 75 centimeter square עם פקקים מאווררים במצע hypercare בתוספת 10% FPS ו-30 ng/mL.

אין להשתמש ברכיבי אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוט עבור EGF אנושי, בהתאם להנחיות היצרן; יש להדגיר בטמפרטורה של 37 °C, 95% אוויר ו-5% פחמן דו-חמצני. יש לבצע תרבית משנה לכל התאים ביחס של 1:3 בערך ב-70% תפוסה (confluency), בהתאם לסוג התאים; בדרך כלל מבצעים תרבית משנה לתאים כל שניים עד חמישה ימים לפני הטיפול בחומצות שומן. הכינו תחילה את חומצות השומן: העבירו חומצות אולאית, לינולאית ולינואלנית מהאמפולות מזכוכית שסיפקה החברה לבקבוקוני זכוכית סטריליים. לאחר מכן, העבירו כל חומצת שומן לפרונטה (Eppendorf tube) סטרילית נפרדת.

המסו כל חומצת שומן ב-100% Ethanol בדילול של אחד לשש, ולאחר מכן הוסיפו RPMI 1640 Incomplete media עד לריכוז סופי של 10 micrograms per microliter. ערבבו כל תמיסה באמצעות וורטקס והעבירו אותן לבקבוקוני זכוכית לאחסון במקפיא בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.

זריעה של תאי אפיתל של מעי אנושי בריכוז של 2,500 תאים לבאר בלוחות תרבית רקמה של 96 בארות; הוסף את המצע המלא המתאים כדי להביא את הנפח הכולל של כל באר ל-200 µL. דגרי את התאים ב-37 °C, 95% אוויר ו-5% carbon dioxide למשך 24 שעות.

לאחר תקופת שגשוג של 24 שעות, יש להסיר את המצע. הוסף לבארות את הריכוזים המתאימים של כל חומצת שומן לבדיקה כביקורת חיובית. דגור את התאים במצע מלא כביקורת שלילית, ודגור תאים עם 70% ethanol.

לאחר מכן, הוסיפו מצע מלא כדי להביא את הנפח הכולל של כל באר ל-200 µL. דגרו את המצעים שעברו טיפול למשך 24 שעות לפני תחילת בדיקת ה-MTT כדי להכין את רעלן הכולרה לטיפולים בתאים. המיסו את רעלן הכולרה ב-PBS בריכוז של 1 mg/mL.

חלק את התמיסה לאליקוטים במבחנות קריו ואחסן בטמפרטורה של 2°C עד 8°C לפני הטיפולים בתאים. דלל את הרעל ביחס של 1:100 ב-PBS סטרילי או ב-DMEM חסר (incomplete) לקבלת ריכוז עבודה סופי של 1 ng/µL ללוחית. זרע מקרופאגים בריכוז של 2,500 תאים לבאר בלוחית 96.

דגרו את פלטות תרביות הרקמה ב-37 °C, 95% אוויר ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות. לאחר תקופת השגשוג של 24 שעות, הסירו את המצע והוסיפו לבארות את ריכוזי הבדיקה המתאימים של רעל החולרה. באופן דומה לטיפולים בחומצות שומן, דגרו תאים עם מצע מלא כביקורת חיובית ועם 70% ethanol כביקורת שלילית עבור כל הדגימות והטיפולים.

השתמשו בלפחות שלוש חזרות, עם מספר רב יותר של חזרות עבור ביקורות חיוביות. הוסיפו מצע גידול מלא כדי להביא את הנפח הכולל של כל באר ל-200 microliters. דגרו את המצעים שטופלו ברעלן כולרה למשך 24 שעות לפני תחילת בדיקת ה-MTT.

24 שעות לאחר שהתאים טופלו בחומצות שומן או בביקורת, נקבעת חיוניות התאים באמצעות בדיקת MTT. יש להוציא את התמיסה מכל באר בלוח 96 הבארים המיועד לבדיקה ולהחליפה ב-200 µL של תמיסת מצע מלאה טרייה.

הוסיפו 10 µL של תמיסת MTT בריכוז 2.5 mg/mL שהוכנה טרי לכל באר. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות. לאחר שלוש עד ארבע שעות, השליכו את תמיסת המצע והוסיפו 100 µL של חומצה כלורית בריכוז 0.04 M באיזופרופנול לכל באר.

דגרו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את התמיסה מכל באר לשפופרת צנטריפוגה וסובבו בצנטריפוגה ב-20,000 GS למשך דקה אחת או עד להיווצרות משקע. העבירו בין 20 ל-40 microliters מכל דגימה לקורא מיקרופלטות ומדדו את הבליעה ב-570 nanometers באמצעות ספקטרופוטומטר.

איור זה מציג את הישרדות מרבית המקרופאגים כפונקציה של הביקורת החיובית עבור טיפולים המשתמשים בריכוזים עולים של חומצה אולאית, חומצה לינולאית וחומצות לינולאיות. ניכר כי התאים אינם סובלים מריכוזים הגבוהים מ-100 nanograms per microliter עבור מי מחומצות השומן. הניסוי חזר על עצמו תוך שימוש בתאי אפיתל אנושיים עבור ריכוזים נמוכים מ-100 nanograms per microliter במרווחים של 10 nanogram per microliter, עד לריכוז של 70 nanograms per microliter.

גרף זה מציג את הישרדות התאים עבור כל ריכוז של חומצה אולאית. מבחן One way ANOVA העלה כי אחד או יותר מהממוצעים היו שונים באופן סטטיסטי. עם זאת, רק הטיפולים בריכוזים הגבוהים יותר הניבו ממוצעים השונים סטטיסטית מאלו של הביקורת החיובית.

באופן מעניין, ההבדלים שנצפו נבעו מעלייה בחיוניות התאים עם שונות רבה יותר. תוצאות דומות התקבלו עבור חומצות לינולאיות ולינולאיות. דרך אחת.

בדיקת ANOVA הצביעה על כך שאף אחד מממוצעי הטיפולים לא היה שונה באופן סטטיסטי מממוצע הביקורת החיובית, אך נראה כי השונות עולה עבור חלק מהריכוזים הגבוהים יותר, כגון 60 nanograms per microliter של חומצה לינולאית או חומצה לינולאית מתוצאות אלו. נראה כי ריכוזי חומצות השומן האופטימליים בשימוש בתאי אפיתל של מעי אנושי הם בין 1 ל-5 nanograms per microliter. השפעותיהם של ריכוזים משתנים של רעלים על הישרדות רוב המקרופאגים נבחנו אף הן עם טיפולים לרמות רעל בגידולים גדולים יחסית.

נצפתה מגמה של ירידה בביות התאים, כפי שניתן היה לצפות, שכן חיוניות התאים השתנתה במידה רבה בכל טיפול. השונות הגבוהה בחיוניות הובילה לכך שלא נמצא הבדל מובהק בין הממוצע של הביקורת החיובית לבין מי מהטיפולים, דבר שהוביל לבדיקה נוספת של רמות רעלן של 100 nanograms או פחות. גרף זה מציג את חיוניות התאים עבור טיפולים ברמות רעלן נמוכות יותר.

חיוניות התאים היא תנודתית מאוד עבור כמעט כל ריכוזי הרעלן, אם כי נצפו עליות קלות בחיוניות כתוצאה מהטיפולים. עליות אלו אינן מובהקות סטטיסטית עבור אף אחד מהטיפולים בהשוואה לממוצע של הביקורת החיובית. על בסיס תוצאות אלו.

הריכוז המומלץ של רעל הצחור הוא פחות מ-30 ננוגרם לטיפול בעת שימוש במקרופאגים של עכברי Bowel C לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקר הצחור לבחון האם חומצות שומן עשויות להגביר את החסינות מפני זיהום על ידי Vibrio cholerae.