שיטה רגישה לכמת תאי סרטן senescent

המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת סנצנס (הזדקנות) תאית באופן מהיר ורגיש. כאן אנו מדגימים את התועלת בשיטה זו לסריקת תרופות כימותרפיות פוטנציאליות. ראשית, יש להשרות סנצנס תאית.

התרופה כימותרפית doxorubicin מוספת לתאי סרטן. לאחר מכן, מתווסף Bain A one כדי לנטרל את ה-pH החומצי של הליזוזומים התאיים. לאחר מכן, מתווסף C 12 FDG, שהוא סובסטרט beta galacto חודר תאים, עם קליטתו על ידי התאים.

ה-C 12 FDG עובר הידרוליזה ופולט פלואורסצנציה. מכיוון ש-beta GCSEs מרוכזים בליזוזומים של תאים מזדקנים, הם הופכים לפלואורסצנטיים יותר מתאים שאינם מזדקנים. כדי לכמת את ההבדל בפלואורסצנציה, התאים מועברים בניתוח באמצעות ציטומטר זרימה; ניתוח הנתונים שמתקבל מאפשר כימות של אחוז התאים הסרטניים המזדקנים תחת תנאי טיפול שונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת beta galactose, הוא שהיא מאפשרת כימות מהיר ורגיש של תאים סנצנטיים. למעשה, הרעיון לשיטה זו עלה לנו כאשר נתקלנו בקושי בכימות תאים סנצנטיים באמצעות בדיקת ה-beta galactose הנפוצה. למרות שביצענו טכניקה זו כדי לזהות סנצנציה בתאי סרטן, ניתן להשתמש בה גם בתאים נורמליים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מהירות בתחום הסרטן, כגון השאלה האם תרופה כימותרפית גרמה לתאי סרטן לבצע sse, דבר שעשוי לקדם ממאירות. לפיכך, טכניקה זו עשויה לסייע בסופו של דבר בזיהוי טיפולים תרפויטיים חדשים לסרטן. בעבודה תחת מנדף כימי, המסה את אבקת ה-C 12 FDG ב-DMSO לריכוז סופי של 20 millimolar, חלק למנורות של 0.5 milliliter ואחסן בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.

יש להשתמש ב-DMSO בתנאי בטיחות מתאימים. המיס את אבקת CIN A ב-DMSO עד לריכוז סופי של 0.1 Millimolar. חלק את התמיסה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 milliliter ואחסן אותן בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.

שימו לב, יש להשתמש ב-CIN תוך נקיטת אמצעי בטיחות מתאימים. ניתן לבצע הליך זה באמצעות תאים דבקים או תאים שאינם דבקים. כאן מוצג ההליך באמצעות שורת התאים של מיאלומה אנושית RPMI 8 2 2 6.

תאים אלו גדלים בתרחיף; יש לגדל תאי RPMI 8 2 2 6 במדיום המכיל 10%FBS ו-1%antibiotics בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5%carbon dioxide. 24 שעות לפני ביצוע הניסוי, יש לזרוע את התאים בלוחות שש-בארות כך שיהיו בשלב הלוגריתמי של עקומת השגשוג התאי. במועד הניסוי, כדי לקבוע את אחוז התאים הסנצנטיים, יידרשו שלוש דגימות תאים: תאים לא מטופלים וללא צביעת ST, תאים לא מטופלים הצבועים ב-C 12 FDG, ותאים מטופלים הצבועים ב-C 12 FTG.

עבור כל תנאי, נדרש מינימום של חמישה כפול 10 בחזקת 5 תאים לצורך ניתוח flow cytometry של הזדקנות מושרית בתאי סרטן. באמצעות הוספת התרופה הכימותרפית doxorubicin, יש להתאים את ריכוז התרופה ואת משך הטיפול לסוג התא. נבדק עבור תאי rpmi 8 2 2 6.

ניתן להשרות סנצנציה (הזדקנות תאית) על ידי טיפול ב-10 מתוך שש תאים למלליליטר ב-15 nanomolar doxorubicin למשך 48 שעות. אין לשכוח לכלול דגימה ללא טיפול כביקורת שלילית, ולהדגיר ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. טיפול בתרופות כימותרפיות עלול להוביל לאפופטוזיס של התאים.

לפיכך, לאחר יומיים, יש לבדוק את חיוניות התאים באמצעות דחיית trypan blue בעזרת ציטומטר המטולוגי ומיקרוסקופ. אם אחוז החיוניות נמוך מ-70%, יש להסיר את התאים המתים באמצעות ערכה מתאימה, כגון ה-dead cell removal kit מבית Milton E, כדי להבטיח שהתאים המתים לא יעוותו את הניתוח העוקב. אחרת, יש להסיר את מצע התרבית על ידי סבב של התאים ב-300 g למשך חמש דקות.

לאחר הסרת הנוזל העילאי, חממו מראש מצע גידול טרי המכיל 100 nM cin, A כדי לנטרל את ה-pH החומצי של הליזוזומים, והדגרימו למשך שעה אחת ב-37 °C וב-5% carbon dioxide. המסו את סובסטרט הבטא-גלקטוזידאז C 12 FDG במצע גידול טרי שחומם מראש עד לריכוז סופי של 2 mM. בצעו זאת בעקבות ההדגירה עם beil mycin.

הוסיפו C 12 FDG ישירות לתאים ולתווך עד לריכוז סופי של 33 Micromolar. דגרו למשך שעתיים ב-37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide. לאחר הדגירה, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-300 Gs למשך חמש דקות ב-four degrees Celsius.

לאחר הסבוב, שטפו את התאים פעמיים עם PBS, תוך ביצוע סבוב בכל פעם כפי שנעשה קודם לכן, והסירו את העל-מנוף (supernatant) לאחר השטיפה השנייה. השעיקו מחדש את משקע התאים ב-500 µL של PBS קר, ולאחר מכן בצעו סימון אימונו-משותף (co immuno labeling) כדי לאפיין באופן מעמיק יותר את אוכלוסיית התאים הזקנים (senescent cells). אם אין לכם ניסיון בציטומטריה של זרימה, ההיבט הקשה ביותר של הליך זה יהיה ביצוע ניתוח הציטומטריה של הזרימה.

כדי להבטיח הצלחה, הקפידו לכלול את הביקרות המתאימות ובקשו סיוע מאדם מנוסה במידת הצורך. לפני הרצת הדגימה הראשונה, הכינו גרף בעל שני פרמטרים המציג את ערוץ הפיזור הקדמי (FSC) מול ערוץ הפיזור הצדי (SSC). לאחר מכן, הריצו את הדגימה הראשונה המכילה תאים לא מסומנים.

כוון את שפופרות ההכפלה הפוטו-אלקטרית או ה-PMTs והגדר אזור עניין (region of interest), תוך החרגת תאים מתים ושיירי תאים שעשויים להופיע בשער הכניסה במהלך הכנת הדגימה. אזור עניין זה מוגדר בהיסטוגרמה בעלת פרמטר אחד המציגה את הפלואורסצנציה של C 12 FDG כ-FL one בסולם לוגריתמי של ציר ה-x, ואת מספר האירועים בציר ה-Y. מספר האירועים הכולל מייצג את מספר התאים שנותחו.

כוון את ה-PMT כך שתאים לא מסומנים יופיעו בעשור הראשון בסולם הלוגריתמי של ציר ה-x. במידת הצורך, קבע את האוטופלורסצנציה של התאים על ידי הרצת התאים הלא מסומנים בציטומטר הזרימה. הרץ את הדגימה השנייה המכילה תאים לא מטופלים בהיסטוגרמה של פרמטר אחד המציגה את FL1, והצב את הסמן לאחר האוכלוסייה המסומנת בעמימות.

סף זה יאפשר להבחין בין תאים שאינם מזדקנים (non senescent), המסומנים בעמעום, לבין תאים מזדקנים (senescent), המסומנים בבהירות. הרץ את הדגימה השלישית המכילה תאים שעברו טיפול. תאים מזדקנים המסומנים בבהירות יופיעו מעל הסף שנקבע בשלב הקודם.

במידת הצורך, העריכו את אחוז התאים הזקנים על ידי חילוק מספר האירועים הזוהרים במספר האירועים הכולל. ניתן להעריך את פעילות ה-beta galactosidase גם באמצעות עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת כדי לבחון את הזקנה המושרית על ידי הליך כימותרפויטי. קו התאים למיילומה מרובה מסחרי, R RRP I 8 2 2 6, טופל במשך יומיים ב-doxorubicin, תרופה כימותרפית, ונבדק למצב של זקנה כפי שמתואר בסרטון זה; היסטוגרמות אלו מראות את הפלואורסצנציה של תאים לא מטופלים משמאל ותאים מטופלים מימין.

אוכלוסייה של תאים המסומנים בבהירות ומייצגים תאים מזדקנים (senescent cells) מופיעה באזור V. במקביל, אותו דגימת תאים נצבעה באמצעות בדיקת beta galactosidase. בתמונה מייצגת זו מוצגים תאים כחולים לחלוטין ותאים כחולים חלקית כדי להדגים את הקושי בהבחנה בין תאים מזדקנים שהם כחולים באמת. כדי להדגים את הספציפיות של C 12 FDG בקביעת אחוז התאים המזדקנים, התאים טופלו גם בריכוזים שונים של doxorubicin.

את אחוז התאים הזקנים (senescent cells) קבעו על ידי חלוקת מספר האירועים הבהירים במספר האירועים הכולל. עבור מינונים של 5, 25 ו-50 nanomolar של doxorubicin, היו אחוזי התאים הזקנים 0.8%, 15.78% ו-26.31% בהתאמה. תוצאה זו מוכיחה כי סימון באמצעות C 12 FTG הוא ספציפי לתאים זקנים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעמדה להבין היטב כיצד לכמת תאי סנצנציה (senescent cells) באמצעות פלוויטומטריה (flow cytometry) על פי נוהל זה, וכיצד לבצע שיטות כגון סימון אימונולוגי (immuno labeling) במטרה לאפיין תאי סנצנציה. זכרו כי עבודה עם DMSO או תאי סרטן עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט באמצעי זהירות בכל עת בעת ביצוע נוהל זה.