שיטה רגישה לכמת תאי סרטן senescent

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את הזדקנות התאים בצורה מהירה ורגישה. כאן אנו מדגימים את התועלת של שיטה זו בבדיקת תרופות כימותרפיות פוטנציאליות. הראשון לגרום להזדקנות תאית.

התרופה הכימותרפית דוקסורוביצין מתווספת לתאים סרטניים. הבא Bain A מוחל כדי לנטרל את ה-pH החומצי של הליזוזומים התאיים. לאחר מכן מחלחל תא בטא גלקטו מצע C 12 FDG מתווסף עם ספיגת התאים.

ה-C 12 FDG עובר הידרוליזה ופלואורסצות. מכיוון ש-GCSE בטא מועשר בליזוזומים של תאים מזדקנים, הם הופכים פלואורסצנטיים יותר מאשר תאים שאינם מזדקנים. כדי לכמת את ההבדל בקרינה, התאים מופעלים על ניתוח ציטומטר זרימה של הנתונים המתקבלים מאפשר לכמת את אחוז תאי הסרטן המזדקנים בתנאי טיפול שונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בטא גלקטוז, למשל, הוא שהיא מאפשרת כימות מהיר ורגיש של תאים מזדקנים. למעשה, אנו מוסיפים תחילה את הרעיון לשיטה זו כאשר אנו חווים קושי בכימות תאים מזדקנים באמצעות אסאי בטא גלקטוז הנפוץ. אף על פי שאנו משתמשים בטכניקה הזו כדי לזהות הזדקנות על תאים סרטניים, היא יכולה לשמש גם על תאים נורמליים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מהירות בתחום הסרטן, כגון האם תרופה כימותרפית גרמה לתאים סרטניים ל-sse, מה שעלול לקדם ממאירות. לפיכך, טכניקה זו יכולה בסופו של דבר לעזור להודיע על טיפולים טיפוליים חדשים לסרטן. בעבודה על קולט אדים כימי המיס את אבקת C 12 FDG ב-DMSO לריכוז סופי של 20 מילי-מולרי לתוך צינורות אינור של 0.5 מיליליטר ומאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.

יש להשתמש ב-DMSO בתנאי בטיחות מתאימים, גם להתמוסס. CIN A אבקה אחת ב-DMSO לריכוז סופי של 0.1. Eloqua מילימולר את התמיסה לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות של 0.5 מיליליטר ואחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס.

שימו לב, יש להשתמש ב-CIN עם אמצעי זהירות מתאימים. ניתן לבצע הליך זה באמצעות תאים דבקים או לא דבקים. כאן ההליך מודגם באמצעות קו תאי המיאלומה האנושית RPMI 8 2 2 6.

תאים אלה גדלים בתרחיף, מטפחים RPMI 8 2 2 6 תאים במדיום המכיל 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני 24 שעות לפני ביצוע הניסוי זורעים את התאים בשש צלחות באר כך שהם יהיו בשלב הלוג של עקומת ההתפשטות התאית. בזמן הניסוי לקביעת אחוז התאים המזדקנים, יידרשו שלוש דגימות תאים. תאים לא מטופלים ולא מוכתמים ST, תאים לא מטופלים צבועים ב-C 12 FDG, ותאים מטופלים צבועים ב-C 12 FTG.

עבור כל מצב, נדרשים לפחות חמישה כפול 10 עד חמישי תאים להזדקנות הנגרמת על ידי זרימה ציטומטרית של תאים סרטניים. על ידי הוספת התרופה הכימותרפית דוקסורוביצין, יש להתאים את ריכוז התרופה ומשך הטיפול לסוג התא. נבדק עבור rpmi 8 2 2 6 תאים.

ניתן לגרום להזדקנות על ידי טיפול בעשירית מתוך ששת התאים למיליליטר ב-15 ננו-מולרי דוקסורוביצין למשך 48 שעות. אל תשכח לכלול דגימה לא מטופלת כדגירה שלילית בקרה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. טיפול בתרופות כימותרפיות עלול להוביל לאפופטוזיס של תאים.

לכן, לאחר יומיים, בדוק את כדאיות התאים על ידי אי הכללה כחולה טריאן באמצעות המו, ציטומטר ומיקרוסקופ. אם אחוז הכדאיות הוא פחות מ-70%, הסר את התאים המתים באמצעות ערכה מתאימה כגון ערכת הסרת התאים המתים ממילטון E כדי להבטיח שתאים מתים לא יטו את הניתוח שלאחר מכן. אחרת, הסר את מדיום התרבית על ידי סיבוב התאים כלפי מטה ב -300 GS למשך חמש דקות.

לאחר מכן, לאחר הסרת הסופרנטנט במדיום תרבית טרי מחמם מראש המכיל 100 אנום או סין, אחד לנטרול ה-pH החומצי של הליזוזומים מודגר למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני ממיס את הבטא גלקטו מצע C 12 FDG בתרבית טרייה לפני המלחמה. ריכוז בינוני עד סופי של שני מילימולר. לאחר הדגירה עם בייל מיצין.

הוסף C 12 FDG ישירות לתאים ובינוני לריכוז סופי של 33. דגירה מיקרומולרית במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר צנטריפוגת הדגירה התאים ב-300 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הסיבוב יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS מסתובב בכל פעם כמו קודם ולהסיר את הסופרנטנט לאחר הכביסה השנייה. Resus משהה את כדור התא ב-500 מיקרוליטר של PBS קר ואז מבצע תיוג חיסוני משותף כדי לאפיין עוד יותר את אוכלוסיית התאים המזדקנים. אם אין לך ניסיון בזרימה ציטומטרית, ההיבט הקשה ביותר בהליך זה יהיה ביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה.

כדי להבטיח הצלחה, הקפד לכלול את הבקרות המתאימות ובקש סיוע מאדם לא מנוסה לפי הצורך. לפני הפעלת הדגימה הראשונה, הכן גרפיקה של שני פרמטרים המציגה ערוץ פיזור קדימה או FSC לעומת SSC של ערוץ פיזור צדדי. לאחר מכן הפעל את הדגימה הראשונה המכילה תאים ללא תווית.

הגדר את צינורות מכפיל האור או PMT והגדר אזור עניין, למעט תאים מתים ופסולת תאית שאולי הופיעו במהלך שער הכנת הדגימה. אזור עניין זה בהיסטוגרמה של פרמטר אחד המציג את הקרינה של C 12 FDG כ-FL אחד בסולם הלוג של ציר ה-x ומספר האירועים בציר Y. המספר הכולל של האירועים מייצג את מספר התאים שנותחו.

הגדר את ה- PMT כך שתאים ללא תווית יופיעו בעשור הראשון בסולם יומן הרישום של ציר ה- x. קבע את האוטופלואורסצנציה של התאים במידת הצורך על ידי הפעלת התאים ללא תווית בזרימה. ציטומטר מריץ את הדגימה השנייה המכילה תאים לא מטופלים על היסטוגרמה של פרמטר אחד המציג FL מקום אחד את הסמן אחרי האוכלוסייה המסומנת במעומעם.

סף זה יאפשר הבחנה בין תאים שאינם מזדקנים, המסומנים במעומעם, לבין תאים מזדקנים, המסומנים בבהירות. הפעל את הדגימה השלישית המכילה תאים מטופלים. תאים מזדקנים בעלי תוויות בהירות מופיעים מעל הסף שנקבע בשלב הקודם.

הערך את אחוז התאים המזדקנים על ידי חלוקת מספר האירועים הבהירים במספר הכולל של האירועים במידת הצורך. ניתן להעריך את הפעילות של בטא גלקטו טאס גם באמצעות עוצמת הקרינה הממוצעת כדי להעריך את ההזדקנות הנגרמת על ידי הליך כימותרפי. קו תאי המיאלומה הנפוצה R RRP I 8 2 2 6 טופל במשך יומיים עם דוקסורוביצין, תרופה כימותרפית ובדיקה להזדקנות כמתואר בסרטון זה, היסטוגרמות אלה מראות את הקרינה של תאים לא מטופלים משמאל ותאים מטופלים מימין.

אוכלוסייה של תאים בעלי תווית בהירה המייצגים תאים מזדקנים מופיעה באזור V.In מקביל, אותה דגימת תאים נצבעה באמצעות בדיקת בטא גלקטו סאזה. בתמונה מייצגת זו מוצגים תאים כחולים לחלוטין ותאים כחולים חלקיים כדי להמחיש את הקושי להבחין בין תאים מזדקנים כחולים באמת. כדי להמחיש את הספציפיות של C 12 FDG בקביעת אחוז התאים המזדקנים, התאים טופלו גם בריכוזים שונים של דוקסורוביצין.

אחוז התאים המזדקנים נקבע על ידי חלוקת מספר האירועים הבהירים. לפי מספר האירועים הכולל, אחוזי התאים המזדקנים היו 0.8%15.78% ו-26.31% למינון של 5, 25 ו-50 ננו-מולרי דוקסורוביצין בהתאמה. זה מדגים כי תיוג C 12 FTG הוא ספציפי לתאים מזדקנים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת תאים מזדקנים יכולים לסדר או לא על ידי ציטומטריית זרימה בעקבות הליך זה של שיטות כמו תיוג חיסוני שיבוצעו על מנת לאפיין תאים מזדקנים. אל תשכח שעבודה עם DMSO או תאים סרטניים יכולה להיות מסוכנת ביותר. תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.