הפרעות optogenetic של פעילות עצבית עם תאורת לייזר בחצי ללא פגע
4 ביולי 2013
כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור המניפולציה optogenetic פעילות motoneuronal תוך מעקב אחר שינויים בתפוקת מנוע (התכווצות שרירים) בחצי ללא פגע דרוזופילה זחלים באמצעות לייזרים במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להשיג הפרעות מקומית של פעילות עצבית בכמה neuromeres להבהיר את הדינמיקה של מעגלים מוטוריים.
בפרוטוקול זה, נתחיל בהאכלת פשפש (larva) בעל גנוטיפ מתאים במזון מבוסס E המכיל את כל ה-trans A TR. כל פשפש מקובע ומושבת בתוך תמיסת סלין נורמלית, לאחר מכן מחליפים את הסלין הנורמלי ב-2 mL של תמיסת ריינגר סידן (calcium ringer solution) ומניחים את תכשירי ה-LABA עלבמתו של המיקרוסקופ. תנועת ה-LABA המושבת מוקלטה בווידאו באמצעות מצלמת CCD. על ידי הארה מקומית של מערכת העצבים, ניתן להשפיע על הפעילות העצבית של תת-קבוצה של נוירונים בתזמון ספציפי, תוך ניטור תנועת אותה דגימה של תכשיר לא פגוע.
שלום, אני Tega מהמעבדה של Dr.A. שלום, אני Hi Kosaka, גם מהמעבדה של Dr. A, ברמת Oph.
תנועה היא מערכת מודל שימושית לחקר מעגלים מוטוריים. הודות לטכניקות גנטיות מתקדמות בפרוטוקול זה, נבצע מניפולציה אופטוגנטית של נוירונים מוטוריים תוך ניטור רמת התנועה. באמצעות שימוש בלייזרים במיקרוסקופ קונפוקאלי, ניתן לעורר תת-קבוצה של נוירונים ולנתח את התגובות המוטוריות להפרעה המרחבית-זמנית של הנוירונים.
אם כן, נתחיל. תחזקו מושבות זבובים של K six G four US CHR two, או K six G four US NPHR בתוך מבחנות פלסטיק המכילות מזון חי סטנדרטי. הוסיפו תמיסת TL למצע מבוסס שמרים בריכוזים המתאימים וערבבו היטב. פזרו את המצע מבוסס השמרים על מצע של מיץ תפוחים.
העבירו את המושבה השנייה או השלישית מתוך ה-SLA מהמבחנות. הניחו את המושבה על פלטה עם מצע שמרים המכיל TR. כסו את הפלטה בנייר אלומיניום כדי לשמור על ה-TR בחושך. גדלו את המושבה בטמפרטורה של 25 °C למשך פרק זמן מתאים.
זוהי מצלמת CCD להדמיה של אותה מעבדה שלמה. חברו את מצלמת ה-CCD למיקרוסקופ קונפוקאלי רגיל באמצעות התקן הפרדה מסוג SEMA. קחו את A TRA lobby ושטפו אותם במים.
כדי להסיר שאריות מזון מהגוף, הניחו את הזחל על צלחת קרה עם מגן C כאשר הצד הגבי פונה כלפי מטה. קבעו את הראש והזנב באמצעות סיכות לחרקים. הוסיפו תמיסת סליין נורמלית נטולת סידן.
בצעו חתך קטן ליד הזנב באמצעות מיקרו-מספריים. בצעו חתך אורך לאורך קו האמצע הגבי (dorsal midline). היזהרו לא לפגוע בליבת העצב הבטנית (ventral nerve core) ובבעצבים ההיקפיים.
בצעו חתך צדי קטן באמצעות סיכת הראש בכל אחת מהפינות של דופן הגוף המנוסחת. הסירו את האיברים הפנימיים למעט המוח ושרוך העצבים הגבי (ventral nerve cord). החליפו את התמיסת המלח הפיזיולוגית בתמיסת Ringer בסידום של 2 מיליון דגם.
חברו עדשה אובייקטיבית יבשה בעוצמה מלאה למיקרוסקופ הקונפוקאלי והניחו את הדגימה המעבדתית עלבמת המיקרוסקופ. השגידו תמונת תמסורה של הדגימה המנותחת באמצעות לייזר אדום כדי לאתר את שרשרת העצבים הגחונית במיקרוסקופ הקונפוקאלי. הגדירו את אזור העניין (ROI) בתמונת התמסורה; שימוש בהגדלה יעיל לקביעת אזור העניין הספציפי.
שנו את סט המסננים של המיקרוסקופ כדי להאיר באור של 488 nanometer או 559 nanometer. הדמיזו את דופן הגוף על ידי הארת הדגימה באמצעות נורת ההלוגן. עקבו אחר הדגימה באמצעות מצלמת CCD המחוברת למיקרוסקופ הקונפוקאלי.
החזירו את דופן הגוף למצב תנועה והדליקו את קרן הלייזר רק כדי לבצע מניפולציה זמנית בפעילות העצבית, תוך כדי ניטור תנועת הפריסטלטיקה באותה הכנה שלמה הנצפית ומוקלטת על ידי מצלמת ה-CCD. במעבדה זו מבוטא CHL two בנוירונים מודרניים. הארה של מקטע אחד או שניים של חבל העצבים הגבי (ventral nerve core) מפעילה נוירונים מודרניים במקטעים אלו, אשר בתורם גורמים להתכווצות שרירים במקטעי דופן הגוף התואמים, ובכך מעוררים מקטעים אחרים בעצב הגבי.
קור גורם להתכווצות של מקטעי גוף אחרים. NPHL התבטא בנוירונים מוטוריים כאשר מספר מקטעים של חבל העצבים הגחוני עוררו באמצעות לייזר צהוב. הגל המתפשט נעצר במקטע התואם של דופן הגוף.
הגל התחיל שוב מהקטע שנעצר כאשר ביטול הלייזר הופסק. פרוטוקול זה מבהיר את ההליך לביצוע הפרעה אופטוגנטית של פעילות עצבית באמצעות לייזרים באותה רמה מעגלית לא פעילה בתנועה. אין לפגוע בחבל העצבים הגחוני ובעצב ההיקפי במהלך דיסקציה זו כדי להשיג גירוי מספיק.
יש לכוונן את עוצמת ההארה על ידי שינוי עוצמת הלייזר, מהירות הסריקה או מספר החזרות במיקרוסקופ קונפוקאלי. זהו הפרוטוקול המלא. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול למניפולציה אופטוגנטית של פעילות מוטורונית בזבובים מסוג Drosophila בבתים חלקיים. באמצעות שימוש בלייזרים בתוך מיקרוסקופ קונפוקאלי, חוקרים יכולים לנטר התכווצויות שרירים ולפענח את הדינמיקה של המעגלים המוטוריים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אופטוגנטיקה
- מעגלים מוטוריים
רקע
- אופטוגנטיקה מאפשרת בקרה מדויקת של פעילות נוירונלית.
- זחלי דרוזופילה (Drosophila) משמשים כמודל לחקר מעגלים מוטוריים.
- הבנת הפלט המוטורי חיונית להשגת תובנות לגבי הדינמיקה העצבית.
- טכניקה זו עושה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לצורך ניטור בזמן אמת.
מטרת המחקר
- לביצוע מניפולציה אופטוגנטית של פעילות מוטוניורונית.
- לתצפית על שינויים בכיווץ השרירים בתגובה להפרעה עצבית.
- לניתוח הדינמיקה של מעגלים מוטוריים בהכנה חלקי-שלמה (semi-intact).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של זחלי Drosophila בעלי מודיפיקציות גנטיות ספציפיות.
- דיסקציה והצבה של זחלים על במה של מיקרוסקופ.
- שימוש בלייזרים לעיבור נוירונים ספציפיים תוך ניטור התכווצויות שרירים.
- הקלטה של תגובות מוטוריות באמצעות מצלמת CCD.
תוצאות עיקריות
- הארה מקומית של חבל העצבים הבטני עוררה התכווצויות שרירים.
- הפרעה בפעילות העצבית הובילה לשינויים ניתנים לצפייה בתנועה.
- התגובות השתנו בהתאם לעיתוי ולמיקום של הגירוי.
- הפרוטוקול הבהיר בהצלחה את הדינמיקה של מעגל המוטוריקה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק מסגרת לחקר מעגלים מוטוריים ב-Drosophila.
- מניפולציה אופטוגנטית יעילה לניתוח דינמיקה עצבית.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי לחקור אינטראקציות עצביות מורכבות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הפרעה אופטוגנטית מדויקת בזבובים של Drosophila בשלב הלרווה במצב חצי-שלם מאפשרת מיפוי ברזולוציה גבוהה של תפקוד מעגלים עצביים במהלך התנהגות פעילה. גישה זו מקדמת את רמת הביטחון בחיזוי של תיקוף מטרות, על ידי בידוד ההשפעה הסיבתית של מקבצים עצביים ספציפיים על הפלט המוטורי. השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית בשלב הגילוי המוקדם, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות לגבי פורטפוליו פיתוח של תרכובות נוירו-אקטיביות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה במהירות ובמיקום מוגדרים של תפקוד מעגלים עצביים במערכת ניתנת למניפולציה גנטית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות עצביות פוטנציאליות על ידי קישור הפעילות לפלטים מוטוריים מדידים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד ההשפעות של תתי-אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים על ההתנהגות.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירה ותעדוף של מטרות בשלבים הבאים.
סקר ופיתוח בדיקה
- מבסס פלטפורמה מתוקפסת וניתנת לשחזור לכימות תגובות מוטוריות לשיבוש עצבי.
- מאפשר סטנדרטיזציה של פרמטרי גירוי אופטוגנטי לצורך פיתוח בדיקות.
- מספק תוצאים כמותיים מבוססי וידאו המתאימים לניתוח השוואתי בין תנאים ניסויים שונים.
- תומך בהערכה מהימנה של תרכובות נוירו-אקטיביות במערכת נשלטת וחלקית-שלמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם מניפולציה של מעגלים עצביים עם פנוטיפים מוטוריים הרלוונטיים למחלה, במידת הרלוונטיות.
- מאפשר רצף מהגילוי הגנטי ועד לתיקוף פרה-קליני פונקציונלי באורגניזם מודל.
- תומך בקידום של מטרות נוירוביולוגיות בהתאמה לסיכון, בהתבסס על נתוני פלט פונקציונליים.
- מספק תובנות מכניסטיות המנחות אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול אופטוגנטי זה משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני עבור מטרות נוירו-אקטיביות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקות מבוססות היפותזה של תפקוד נוירונלי ומיפוי מסלולים במערכת חיה וניידת.
- סריקה: מספק נתוני פלט מוטורי כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של תגובות מוטוריות תחת הפרעות עצביות מוגדרות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מניפולציה גנטית לבין פנוטיפ פונקציונלי הרלוונטי למודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר עבור תיקוף יעדים איטרטיבי ומחקרים מכניסטיים בתוכניות נוירוביולוגיה שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות עצביות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הפרעה אופטוגנטית ומדדי התנהגות כמותיים עבור תהליכי עבודה ניתנים להרחבה (scalable).
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכונים במטרות נוירוביולוגיות בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות גילוי של חומרים נוירו-אקטיביים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באופטוגנטיקה, גנטיקה של Drosophila, ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית עם הארה בלייזר ולכידת וידאו ברזולוציה גבוהה.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לפרוטוקולי הניתוח, ההארה וההקלטה.
- עשוי לדרוש התאמה עבור אוכלוסיות נוירונליות שונות או פרדיגמות התנהגותיות.
- תלוי בשליטה מדויקת בפרמטרי ההארה ובטיפול זהיר ברקמה כדי למנוע השפעות מתבלבלות.
