Name: השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: חקור את הפוטנציאל המיוגני של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במודלי עכבר לחידוש שרירים. השיטה כוללת השתלה תוך-שרירית וזריקה עורקית זעירה-כירורגית להערכת השתלבות התאים ותפקודם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לג'וליו קוסו, מרטינה רגאזי ולכל המעבדה על דיון ותמיכה מועילים, וג'ף צ'מברליין על שסיפק בחביבות וקטור MyoD-ER. כל הניסויים בבעלי חיים חיים הושלמו בהתאם לעמידה בכל הגופים הרגולטוריים והמוסדיים הרלוונטיים, תקנות והנחיות. העבודה במעבדת המחברים נתמכת על ידי המועצה למחקר רפואי בבריטניה, הקהילה האירופית 7 פרויקטים Optistem ו Biodesign ופרויקט ההורה האיטלקי דושן.

<ol><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).</li>
<li>Minasi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meso-angioblast%3A+a+multipotent%2C+self-renewing+cell+that+originates+from+the+dorsal+aorta+and+differentiates+into+most+mesodermal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues.</a> Development. 129, 2773-2783 (2002).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat. Commun. 2, 499 (2011).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).</li>
<li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+of+alpha-sarcoglycan+null+dystrophic+mice+through+intra-arterial+delivery+of+mesoangioblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts.</a> Science. 301, 487-492 (2003).</li>
<li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoangioblast+stem+cells+ameliorate+muscle+function+in+dystrophic+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs.</a> Nature. 444, 574-579 (2006).</li>
<li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Genetically+Corrected+Human+iPSC-Derived+Progenitors+in+Mice+with+Limb-Girdle+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-mediated+transfer+of+a+human+artificial+chromosome+ameliorates+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 3, (2011).</li>
<li>Lattanzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+myogenic+conversion+of+human+fibroblasts+by+adenoviral+vector-mediated+MyoD+gene+transfer.+An+alternative+strategy+for+ex+vivo+gene+therapy+of+primary+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li>
<li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%3A+validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+Duchenne+muscular+dystrophy+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells.</a> Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).</li>
<li>Kimura, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-lineage+regulated+myogenesis+for+dystrophin+replacement%3A+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Wu, S. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine.</a> Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).</li>
</ol>

F.S.T. הגישה בקשה בינלאומית לפטנט (לא. PCT/GB2013/050112) כולל חלק מהאסטרטגיה המתוארת במאמר זה. הוא קיבל מימון מחברת פרומימטיק ו-DWC בע"מ עבור מחקרו.

iPSCs ניתן להרחיב ללא הגבלת זמן תוך שמירה על פוטנציאל ההתחדשות העצמית שלהם ובכך להיות מופנה להבדיל למגוון רחב של שושלת התא12. מסיבות אלה ואחרות תאי גזע/אב שמקורם ב- iPSC נחשבים למקור מבטיח לטיפול אוטולוגי בגנים ובתאים מתקרבל -13. עבודה שפורסמה בעבר מן המחברים דיווחה על הדור של עכברים ואבים מיוגניים אנושיים מ- iPSCs עם פנוטיפ דומה לזה של MABs נגזר pericyte (IDEMs) ואת תרומתם היעילה התחדשות שרירים במודל העכבר של ניוון שרירים7.
תנאי מוקדם כדי למקסם את הפוטנציאל המ...

Mesoangioblasts (MABs) הם אבות שרירים הקשורים לכלי שמקורם בקבוצת משנה של pericytes1-3. היתרון העיקרי של MABs על אבות שרירים קנוניים כגון תאי לווין4 שוכן ביכולתם לחצות את קיר כלי השיט כאשר מועברים תוך עורקי ולכן לתרום התחדשות שריר השלד בפרוטוקולים טיפול בתא. תכונה זו הוערכה ואושרה הן במודלים מורין והן במודלים של ניוון שרירים1,5,6. מחקרים פרה-קליניים אלה בנו את היסודות לניסוי קליני שלב I/II ראשון באדם המבוסס על השתלת פנים-עורקים של MABS זהה HLA בילדים עם ניוון שרירים דושן (EudraCT מס '2011-000176-33; כרגע הולך בבית החולים סן רפאלה של מילאנו, איטליה). אחד המכשולים העיקריים של גישות טיפול בתאים, שבו מיליארדי תאים נדרשים לטיפול בשריר של גוף שלם, הוא הפוטנציאל המשגשג המוגבל של "המוצר הרפואי" (התאים). יתר על כן הוכח לאחרונה כי לא ניתן להשיג MABs מחולים מושפעים על ידי צורות מסוימות של ניוון שרירים, כפי שהוא מתרחשת ניוון שרירים מחוך גפיים 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, פרוטוקול להפקת תאי גזע / אב דמויי MAB מ- IPSCs אנושיים ומורין הוקם לאחרונה7. הליך זה מייצר אוכלוסיות תאים הניתנות להרחבה בקלות עם חתימת גן כלי דם ואימונופנוטיפ הדומה מאוד ל- MABs שמקורם בשרירים למבוגרים. עם ביטוי של גורם רגולטורי מיוגני MyoD, הן מורין ו IDEMs אנושי (בהתאמה MIDEMs ו HIDEMs) לעבור בידול שריר השלד סופני. כדי להשיג מטרה זו IDEMs יכול להיות transduced עם וקטורים מסוגלים לנהוג ביטוי MyoD, או מכונן או באופן בלתי ניתן להעברה8-10. וקטור lentiviral המכיל MyoD cDNA התמזגו עם קולטן האסטרוגן (MyoD-ER) משמש, ובכך מאפשר טרנסלוקציה הגרעינית שלה על טמוקסיפן (אנלוגי אסטרוגן) הממשל11. אסטרטגיה זו גורמת להיווצרות של myotubes רב-גרעיני היפרטרופי, עם יעילות גבוהה7. יש לציין, IDEMs הם nontumorigenic, יכול לחרוט ולהבדיל בתוך השרירים המארחים בעת ההשתלה והוא יכול להיות מתוקן גנטית באמצעות וקטורים שונים(למשל lentiviruses או כרומוזומים מלאכותיים אנושיים), סולל את הדרך אסטרטגיות טיפוליות אוטולוגיות בעתיד. הנגזרת, האפיון וההשתלה של IDEMs תוארו בפרסוםלעיל 7. נייר פרוטוקול זה מפרט את הבדיקות שבוצעו כדי להעריך את הבידול המיוגני במבחנה של IDEMs ואת מדידות התוצאה הבאות כדי לבדוק את היעילות של ההשתלה שלהם במודלים העכבר של התחדשות שרירים.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>MegaCell DMEM</td><td>Sigma</td><td>M3942</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>סיגמא</td><td>D5671</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>סיגמא</td><td>I3390</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום לסוסים</td><td>Euroclone</td><td>ECS0090L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>לונזה</td><td>DE14801F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS ללא סידן/מגנזיום</td><td>לונזה</td><td>BE17-516F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא</td><td>G7513</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P0781</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>גיבקו</td><td>31350-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS (אינסולין-טרנספרין-סלניום)</td><td>גיבקו</td><td>51500-056</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פר-אין-סול</td><td>מיד ג'ונסון</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פרליקסיט</td><td>אוונטיס</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה אולאית</td><td>סיגמא</td><td>01257-10 מ"ג</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה לינולאית</td><td>Sigma</td><td>L5900-10 מ"ג</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>bFGF אנושי</td><td>Gibco</td><td>AA 10-155</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מופחת גורמי גדילה Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356230</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סיגמא</td><td>T3924</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן הפרין</td><td>מיין פארמה</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסה כחולה טריפאן</td><td>סיגמא</td><td>T8154</td><td>HARMFUL</td></tr><tr><td>צבע כחול פטנט</td><td>סיגמא</td><td>19, 821-8</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא</td><td>E-4884</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>טמוקסיפן</td> מזיק <td>Sigma</td><td>T5648</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-OH Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pLv-CMV-MyoD-ER(T)</td><td>Addgene</td><td>26809</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קרדיוטוקסין</td><td>סיגמא</td><td>C9759</td><td></td></tr><tr><td>פובידון מזיק יוד</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tragachant gum</td><td>MP Biomedicals</td><td>104792</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>איזונתן</td><td>VWR</td><td>24,872,323</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>טישו-טק OCT</td><td>סאקורה</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>VWR</td><td>27,480,294</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מגלשות זכוכית מקוטבת</td><td>תרמו</td><td>J1800AMNZ</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>סיגמא</td><td>HHS32</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>הטריכרום של מאסון</td><td>ביו-אופטיקה</td><td>04-010802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>עכבר אנטי מיוזין נוגדן שרשרת כבדה</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן AC נגד למין</td><td>עכבר Novocastra</td><td>NLC-LAM-A/C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>סיגמא פלוקה</td><td>B2261</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי למינין ארנב</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>חומרים וציוד</חזק></td></tr><tr><td>תפר אנטיבקטריאלי נספג 4-0</td><td>Ethicon</td><td>vcp310h</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מזרק מחט 30 גרם</td><td>BD</td><td>324826</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>מכשיר <td></td><td>הליכון</td><td>קולומבוס</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Leica</td><td>DMIL LED</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>יחידת איזופלורן</td> מכשירי <td></td><td>הרוואד</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סיבים אופטיים</td><td>Euromecs (הולנד)</td><td>EK1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Vet Tech</td><td>C17A1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אזמל</td><td>סוואן-מורטון</td><td>11REF050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים כירורגיים</td><td>Fine Scientific Tools</td><td></td><td>5/45</td></tr><tr><td>צריבה בטמפרטורה גבוהה</td><td>Bovie Medical</td><td>AA01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">הרכב מדיה<</td></tr><tr>td colspan="4">הרכב המדיה מפורט להלן. מדיום גידול HIDEMs: <ul> <li>MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM)</li> <li>5% סרום בקר עוברי (FBS)</li> <li>2 מ"מ גלוטמין</li> <li>0.1 מ"מ &בטא;-מרקפטואתנול</li> <li>1% חומצות אמינו לא חיוניות</li> <li>5 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי (bFGF)</li> <li>100 IU מ"ל פניצילין</li> <li>100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין</li> </ul> לחלופין, אם חלק מהריאגנטים לעיל אינם זמינים, ניתן לגדל HIDEMs ב: <ul> <li>מדיום דולבקו מעובד של Iscove (IMDM)</li> <li>10% FBS</li> <li>2 מ"מ גלוטמין</li> <li>0.1 מ"מ ובטא;-מרקפטואתנול</li> <li>1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)</li> <li>1% ITS (אינסולין/טרנספרין/סלניום)</li> <li>5 ננוגרם/מ"ל אנושי bFGF</li> <li>100 יחב"ל פניצילין</li> <li>100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין</li> <li>0.5 &mu; חומצה אולאית ולינולאית</li> <li>1.5 &mu; M Fe2+ (Fer-In-Sol)</li> <li>0.12 &mu; M Fe3+ (Ferlixit)</li> </ul> מדיום גידול MIDEMs: <ul> <li>DMEM</li> <li>20% FBS</li> <li>2 מ"מ גלוטמין</li> <li>5 ננוגרם/מ"ל bFGF</li> <li>100 יחב"ל פניצילין</li> <li>100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין</ li> </ul> מדיום התמיינות: <ul> <li>DMEM</li> <li>2% סרום סוסים (HS)</li> <li>100 יחב"ל מ"ל פניצילין</li> <li>100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין</li> <li>2 מ"מ גלוטמין</li> </ul> </td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 1. רשימת ריאגנטים, חומרים, ציוד ומדיה.</td></tr></tbody></table>

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

IPSCs שמקורם בחולה יכול להיות מקור תאים שלא יסולא בפז עבור פרוטוקולים עתידיים של טיפול בתאים אוטולוגיים. תאי גזע/אב מיוגניים שמקורם ב- iPSC בדומה לזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (תאי גזע/אב דמויי iPSC: IDEMs) יכולים להיווצר מ- iPSCs המופקים מחולים המושפעים מצורות שונות של ניוון שרירים. IDEMs ספציפיים למטופל ניתן לתקן גנטית עם אסטרטגיות שונות(למשל, וקטורים lentiviral, כרומוזומים מלאכותיים אנושיים) ומשופר בפוטנציאל הבידול המיוגני שלהם על חשיפת יתר של MyoD הרגולטור myogenesis. פוטנציאל מיוגני זה מוערך לאחר מכן במבחנה עם מבחני בידול ספציפיים ומנותח על ידי כשל חיסוני. הפוטנציאל ההתחדשותי של IDEMs מוערך עוד יותר vivo, על השתלה תוך שרירית תוך עורקית בשני מודלים של עכבר מייצג המציגים התחדשות שרירים חריפה וכרונית. תרומתם של IDEMs לשריר השלד המארח מאושרת לאחר מכן על ידי בדיקות תפקודיות שונות בעכברים מושתלים. בפרט, ההשתלבות של היכולת המוטורית של בעלי החיים נחקרת בבדיקות הליכון. חריטה של תאים ובידול מוערכים לאחר מכן על ידי מספר מבחני היסטולוגיה ואימונופלואורסצנטיות על השרירים המושתלים. בסך הכל, מאמר זה מתאר את הבדיקות והכלים המשמשים כיום להערכת יכולת הבידול של IDEMs, תוך התמקדות בשיטות ההשתלה ובאמצעי התוצאה הבאים כדי לנתח את היעילות של השתלת תאים.

התוצאות הייצוגיות המדווחות עוקבות אחר הבדיקות העיקריות במבחנה/in vivo המתוארות בזרימת העבודה באיור 1. 48 שעות לאחר ניהול 4OH-טמוקסיפן גרעינים חיוביים MyoD ניתנים לזיהוי בתוך MYoD-ER transduced IDEMs בתרבות (איור 2A). לאחר מכן התאים מתמזגים ומבדילים לתוך מיוטובים רב-גרעיניים (איור 2B). כאשר מושתלים תוך שרירית במודל מורין של פגיעה חריפה בשרירים, IDEMs תורמים להתחדשות רקמות (איור 3). היעילות של IDEMs בסביבה של ריפוי בגנים ובתאים עבור מודלים מוריניי...

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להעריך את הפוטנציאל המיוגני של תאי אב לשריר המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים במודלים של עכברים לרגנרציה שרירית חריפה וכרונית. דבר זה מושג תחילה על ידי הערכת הפוטנציאל המיוגני של התאים in vitro. השלב השני הוא השתלת התאים באמצעות הזרקה תוך-שרירית.לחלופין, תאים מוחדרים לעורק הפמורלי באמצעות הליך מיקרו-כירורגי. השלב הסופי הוא הערכת השיפור התפקודי של הפנוטיפ הדיסטרופי בבעלי החיים שטופלו. לבסוף, נעשה שימוש בבדיקות אימונופלורסצנציה והיסטולוגיה כדי להראות השתבצות ותרומה תפקודית של תאי התורם לשרירי המאכסן.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום התחדשות השריר השלדי, כגון חקירת גישות לטיפול תאי. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות עד לטיפול בדיסטרופיות שריריות, שכן היא עשויה לסלול את הדרך לאסטרטגיות של טיפול בתאים אוטולוגיים באמצעות תאי IPS ותאי DER פרוגניטורים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי טיפולים מבוססי תאי גזע, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון הולכה של מולקולות באופן תוך-שרירי או תוך-מפרקי, וניתוח עוקב של ההשפעה על תפקוד השריר ומורפולוגייתו.הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר הבנו שתרביות IPSL יכולות לספק דרך להתגבר על חלק מהמגבלות של תאי גזע בוגרים, כגון הזמינות מביופסיות של רקמות ופוטנציאל ההתרבות שלהם. התחל ביצירת שורת תאים יציבה של תאים שעברו טרנסדוקציה עם וקטור הניתן להשראה על ידי tamoxifen, המבטא באופן יתר את ווסת המיוגנזה myo D. לאחר ציפוי ב-1%matri gel ושטיפה במדיום, זרע צלחת עם התאים שעברו טרנסדוקציה והדגר ב-37 degrees Celsius במדיום גידול. התאים צריכים להגיע לקונפלואנציה תוך יום או יומיים.כאשר הם מוכנים, יש להוסיף 1 µM של 4-hydroxytamoxifen אל מצע הגידול. לאחר 24 שעות, החליפו את מצע הגידול במצע בידול המועשר ב-1 µM של 4-hydroxytamoxifen.בדוק את התרביות מדי יום לאיתור היווצרות של myotube והחלף מחצית מהמדיום במדיום הפרדה (differentiation medium) טרי מדי יומיים כאשר התרביות מוכנות. הן משמשות במבחני השתלה.כאן, נעשה שימוש בעכברים עם דיסטרופיה ובעכברים עם חסר חיסוני כדי לקבוע את מידת השתבשות השתלים (engraftment) עבור השתלה תוך-שרירית. טפלו במבעלי החיים מראש בהזרקת tamoxifen כ-24 שעות לפני ההשתלה. יש לטפל בתאים מראש באמצעות הוספת tamoxifen למצע הגידול בלילה שלפני.ביום ההשתלה, לאחר ניתוק באמצעות טריפסין, ספירה וצנטריפוגה, שטפו את התאים פעם אחת ב-PBS לפני השהייה, והשעיו אותם ב-PBS נטול סידן ומגנזיום לריכוז של 10⁶ תאים ל-30 µL. לאחר הרדמת בעל החיים וחיטוי העור, אתרו את שריר ה-tibialis anterior. זהו את נקודת ההחדרה של הגיד הפרוקסימלי והחדירו את המחט.החדירו את הקצה שני מילימטרים מתחת לנקודה זו. הכניסו חמישה מילימטרים מהמחט בשיפוע של 15 מעלות ביחס לטיביה (tibia) והזריקו באיטיות את תרחיף התאים תוך써 נסיגה של המחט. רוקנו את המזרק כאשר שני מילימטרים מהמחט עדיין נמצאים בתוך השריר.יש להיזהר בעת הוצאת המחט מהשריר כדי למנוע דליפה של ת сусפנזיית התאים דרך נתיב המחט. בהתאם לאותם הליכים, הזרקות ל-gastro anemia מבוצעות שני מילימטרים מעל החיבור המיו-גידי (myo tendonous junction) של גיד אכילס והקוואדריצפס. הזרקות ל-Femme מבוצעות שני מילימטרים מעל הגיד הדיסטלי לצורך השתלה תוך-עורקית.בצעו טיפול מקדים בבעלי החיים ובתאים באמצעות tamoxifen כפי שהודגם קודם לכן. כאשר התאים מוכנים להשתלה, יש להכינם כפי שהודגם בעבר, למעט העובדה שהם מסוננים לפני הסבוב (centrifugation). השביו את המשקע ב-PBS נטול סידן ומגנזיום והוסיפו 10% צבע patent blue כדי לאפשר ויזואליזציה של התפזורת של תלי התאים.שחזרו בזהירות את התאים במזרק והסִירו את כל בועות האוויר לפני ההזרקה; לאחר ההרדמה, גלחו וחטאו את האזור כפי שמוצג, בצעו חתך של חמישה עד שבעה מילימטרים ואתרו את צרור העורקים הפמורלי. הסִירו בעדינות בעזרת פינצטה את הפסיה החיברית המכסה את הצרור. לאחר מכן, הפרידו בזהירות את הווריד והעצב הפמורליים מהעורק על ידי הכנסה עדינה של קצה הפינצטה ביניהם והרחבה הדרגתית של המרווח.הוריד הפמורלי (הווריד בירך) הוא שברירי. יש להיזהר לא למעוך אותו במהלך ניתוקו מהעורק הפמורלי. לאחר ההפרדה, הרם את העורק בעזרת קצה אחד של הפינצטה ותפוס את העורק בעזרת הקצה השני.באמצעות מחט 30 G, דקרו את העורק והזריקו 50 µL של תרחיף התאים במורד השטח המהודק, במהירות עירוי של כחמישה µL לשנייה. הוציאו באיטיות את המחט ואת הפינצטה מהעורק כדי להחזיר את זרימת הדם לגפה. הפילו לחץ באמצעות גזה סטרילית כדי למנוע דימום, ובמידת הצורך בצעו צריבה.צבע ה-patent blue מאפשר זיהוי מיידי של הזרקה שבוצעה במקום הנכון; במידה וההזרקה בוצעה כהלכה, הגפה כולה תהפוך במהירות לכחול בהיר. יש לתפור את הפצע ולנטר את בעלי החיים עד להחלמתם. יש לתת משככי כאבים למשך שלושה ימים ולבדוק את הפצע. שינויים יומיים ביכולת המוטורית של העכברים המטופלים מוערכים באמצעות מבחן מסוע (treadmill test). מדידות הבסיס מתחילות כחודש לפני הטיפול ומשמשות להערכת השיפור של כל בעל חיים שנבדק.השלב הראשון הוא אקלימטציה של בעלי החיים לפעילות הגופנית לפני הבדיקה. לשם כך, הגדירו את מסוע הריצה למהירות של six meters per minute למשך 10 minutes. חזרו על הליך זה מדי יום שני במשך שבוע אחד.לאחר שהם רגילים למכשיר, הגדירו את השיפוע ל-10 מעלות והניחו את בעלי החיים במסלולי הליכון. הפעילו את ההליכון במהירות התחלה של six meters per minute. דחפו בעדינות כל בעל חיים שאינו מוכן להתחיל בתרגיל.בשלב הבא, הפעילו את הטיימר והגבירו את המהירות ב-two meters per minute מדי two minutes, ברגע שבעל חיים שוכב באזור המנוחה למשך יותר מ-five seconds. ללא ניסיון להחזיר את העכבר להליכה על המסוע, געו בו בעדינות בעזרת מקל כדי לעודד את חידוש הפעילות. עכבר נחשב לעייף כאשר הוא שוכב באזור המנוחה למשך יותר מ-five seconds מבלי לנסות לחזור להליכה על המסוע.לאחר סדרה של שלושה גירויים מכניים רצופים, אחת לחמש שניות, רשמו את ביצועי כל חיה וחזרו על המדידות מדי שבוע או כל 10 ימים לפחות שלוש פעמים. התחילו שבועיים לאחר השתלת התאים. חזרו על אותו הליך בעכברים המטופלים לאחר הבדיקה.השתמש בהשוואות לקו הבסיס כדי להעריך שינויים בביצועים. 48 שעות לאחר מתן 4-hydroxy tamoxifen, ניתן לזהות גרעינים חיוביים ל-myo d בתוך פריטים שעברו טרנסדוקציה של myo DER בתרבית. כפי שניתן לראות כאן.לאחר שבוע, התאים מתמזגים ומבדילים את עצמם לשפורות שריר (myotubes) רב-גרעיניות. כאשר הם מושתלים תוך-שרירית במודל מקביל של פגיעה שרירית חריפה, הם תורמים לתוצאות של התחדשות רקמה במבחן סיבולת למסירה. מבחן סיבולת לפעילות גופנית מראה שיפור ביכולת המוטורית של עכברים מטופלים לאחר ההשתלה.ניתוחים ex vivo של שרירים מושתלים מראים אזורים חיוביים ל-GFP המייצגים את היקף הקולוניזציה של IMS ברקמת המארח, ובכך מדגימים שתאי תורם נקלטים (engraft) בשריר דיסטרופי. חשוב לציין כי התאים המושתלים מסוגלים להבדיל (differentiate) in vivo ולהיווצר סיבי שריר שלד חדשים. דוגמה זו מראה ביטוי של alphas Sarco glycan מתאי ims שתוקנו גנטית בתוך עכברי skid beige חסרי alphas Sarco glycan.צביעת Masson's trichrome חשפה ירידה בכמות הרקמה הפיברוטית בשריר המטופל. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כמו מבחן FreeWheel, בדיקת Evan Blue Dye ומכניקה של סיב בודד או של השריר כולו, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לשיפור ביכולת המוטורית הרצונית, בשבירות הסיבים ובכוח הספציפי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי האופן שבו ניתן להעריך את יכולת הדיפרנציאציה השרירית, את פוטנציאל ההשתלה ואת היעילות התפקודית של תאי מקור מיוגניים המופקים מתאי IPS, באמצעות בדיקות in vitro, in vivo ו-ex vivo.

transplantation-induced-pluripotent-stem-cell-derived-mesoangioblast

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

שיטת ניתוק האנזימטית, תיוג משטח וטיהור על ידי cytometry זרימה של fibro / adipogenic ואת אבות myogenic מן שרירי השלד Murine.

טיהור אבות מן שרירי השלד

רקמת שריר מהונדסת יש פוטנציאל גדול ברפואת רגנרטיבית, כמודל מחלה וגם כמקור חלופי לבשר. כאן אנו מתארים ההנדסיים של מבנה שרירים, במקרה זה מתאי עכבר והיצמדות לאב, והגירוי על ידי פולסים חשמליים.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

אמצעי לא פולשני להערכת ההצלחה של השתלה והיצמדות מתואר. השיטה מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכבים של גנים אשר ביטוי ניתן הדמיה בשיטות הדמיה שונות. הנה, אנחנו עושים שימוש...

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים בוגרים ומניפולציות הבאות של השרירים, כגון לנתיחה, מקפיא, חיתוך, מכתים שיגרתי, וניתוח שטח החתך myofiber.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

אנו מתארים טכניקה ניסיוני הרומן נקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME), אשר מבוססת על ראיות כי רקמת שריר השלד מכיל תאים myogenic קיימא יכול להקל על התורם-תאית myogenesis כאשר מושתל לתוך שריר המארח.

שריר פולשנית הטבעה (MIME) - טכניקה ניסיוני הרומן כדי להקל על Myogenesis התורם-תאית

מחלות אנושיות מורכבות יכול להיות מאתגר למודל במערכות מסורתיות דגם מעבדה. כאן, אנו מתארים גישה כירורגית למודל מחלת שריר האדם באמצעות השתלת ביופסיות שריר השלד האנושי לתוך עכברים לקויה.

ביצוע שריר השלד האנושי Xenografts בעכברים חיסוני

פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

פרוטוקול זה מתאר ומשווה שתי שיטות מייצגות להבחנה של hiPSCs לתאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). השיטה החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר. שיטת הגופים העובריים (EBs) מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים

חקור את הפוטנציאל המיוגני של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במודלי עכבר לחידוש שרירים. השיטה כוללת השתלה תוך-שרירית וזריקה עורקית זעירה-כירורגית להערכת השתלבות התאים ותפקודם.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

גלה סרטונים נוספים