צמיחת מדידה וDynamics ביטוי גנים של גידול ממוקד ס Typhimurium חיידקים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור את דינמיקת ביטוי הגנים in vivo של חיידקי S tyrian הגדלים בתוך גידולים. תחילה במודל סרטן קסנוגרפט של עכבר, חיידקים מוזרקים תוך ורידי על ידי וריד הזנב. חיידקים מתיישבים בגידול וגדלים באופן אקספוננציאלי בזמן שביטוי הגנים מומחש באמצעות מדווחים זוהרים.

הדמיית ביולומינסנציה של בעלי חיים שלמים מתבצעת באמצעות מערכת הדמיית ספקטרום IVUS. במשך 24 עד 48 שעות נלקח מהלך זמן של תמונות IVUS. סדרת תמונות זו נמצאת בקורלציה עם ספירת מושבות שנוצרו על ידי הומוגניזציה וציפוי גידולים.

יחד נתונים אלה מאפשרים לנו למדוד כמותית את ביטוי הגנים ודינמיקת האוכלוסייה של חיידקים ממוקדי גידול in vivo במעבר הכנת תאים בזמן אמת, קווי תאים באמצעות טכניקות תרבית תאים סטנדרטיות. בניסוי זה, השתמשנו בתאים ברוטו של שמונה תאים לשטף מטרה של 80 עד 100% קציר וספירת תאים על המו, ציטומטר, רסוס, השעיה ופנול אדום ללא DMEM בריכוז יעד של חמישה פעמים 10 לשבעת התאים למיליליטר, או כ-200 מיקרוליטר לבקבוק. הוסף מטריג'ל גורם גדילה מופחת של 15% ושמור את תרחיף התאים על קרח עד להשתלת גידול

אנס הרדימה עכברים עירומים נקבות בנות ארבעה שבועות באמצעות פלואור 3%. טען את התאים 100 מיקרוליטר לכל גידול במזרק טחנה אחת וחבר מחט בגודל 27 וחצי לכל אחד משני אתרי הזרקה דו-צדדיים באגף האחורי. הרם את העור בעדינות בעזרת מלקחיים כדי ליצור אוהל ולהזריק תאים בבסיס.

הקפד לא לחדור עמוק מדי לייצור דם. השתמש בפינצטה כדי להסיר בעדינות את המזרק מבלי להתיז. עקוב אחר צמיחת הגידול מדי יום במשך 10 עד 20 יום עד שמגיעים לקוטר הגידול של שניים עד ארבעה מילימטרים.

הכנת חיידקים, התחל תרבית לילה של חיידקים במדיה של שלושה מיל LB בתוספת אנטיביוטיקה מציר מקפיא מינוס 80 או צלחת קירור. בניסוי זה השתמשנו בזן הצמיגים ELH ארבע וחצי בבוקר. מדללים את התרבית מ-1 עד 100 ל-lb מסונן וגדלים ל-OD 600 של 0.4 עד 0.6.

יש לסובב ולשטוף שלוש פעמים במי מלח עם פוספט ולהשעות מחדש ב-OD 600 סופי של 0.1 או בערך פעם אחת 10 לשבעת התאים למיל. הזרקת חיידקים, הרדמת בעלי חיים ומיקום כשהזנב מצביע לכיוון היד הדומיננטית שלך. אתר את וריד הזנב והרחיב באמצעות מים חמים או מנורת חום.

טען את החיידקים 100 מיקרוליטר לעכבר במזרק של מיל וכופף את השבב קצת פחות מ-90 מעלות. יישר את קצה המזרק עם וריד הזנב, חדור לעומק רדוד ללא התנגדות והזריק חיידקים. שימו לב לתזוזה של זרימת הדם להזרקה מוצלחת.

המתן כ-12 עד 18 שעות לפני ההדמיה להתרחשות קולוניזציה. הדמיית עכבר מרדימה בעלי חיים בתא האינדוקציה. לאחר מכן הנח כל עכבר על פלטפורמת ההדמיה.

שמור על מיקום מדויק כדי להבטיח תוצאות כמותיות בין נקודות זמן, צלם בעלי חיים באמצעות מערכת ההדמיה Ibis Spectrum. אם מצלמים יותר מבעל חיים אחד, מקמו מחסומי אור ביניהם כדי למנוע דיסקציה של בעלי חיים בתאורה צולבת, והחזיקו את הגידול בפינצטה. הסר את העור בתנועת מספריים הפוכה.

תנועה כאשר רוב העור הופרד הסר את הגידול במלואו באמצעות פינצטה. הנח את האיברים וצינורות מיקרו צנטריפוגה שקולים מראש. מכיוון שהמסה של צינורות אלה יכולה להשתנות באופן משמעותי, חשוב לשקול אותם מראש לקבלת תוצאות כמותיות.

כימות התפלגות ביולוגית של חיידקים עבור כל נקודת זמן, כריתה ושקלול של הגידולים, הוספת 500 מיקרוליטר PBS בתוספת 15% גליצרול והומוגניזציה באמצעות קרע ברקמה, מייצרת דילול סדרתי וצלחת לספירת מושבות חיידקים תוצאות מייצגות. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מסוגלים לייצר נתונים על הצמיחה in vivo ודינמיקת ביטוי הגנים של חיידקים ממוקדי גידול. זרימת העבודה הכוללת מסוכמת כאן.

בשלב הראשון, הזרקנו חיידקים וצילמנו את החיה באמצעות ivus כדי למדוד את ביטוי הגנים עם זוהר כמדווח. לאחר מכן, בשלב השני, כרתנו, הומוגניזציה וציפינו גידולים לספירת מושבות כדי לקבוע את מספר החיידקים הגדלים בגידול. ביולומינסנציה הנוצרת על ידי זני חיידקים מודגמת באמצעות עלייה באות IVUS עם מינון מוזרק עם מינון קולוניזציה מינימלי בסביבות חמש פעמים 10 עד חמש בכל המקרים עקב הנחתות.

החיידקים או גידולים שהתיישבו באופן ספציפי או לא מצליחים לגדול באופן משמעותי בעכברים האות מכומת באמצעות יחידות קרינה כדי לנרמל את זמן החשיפה או ערכים אופייניים מעל 10 עד שש ומעלה מעידים על קולוניזציה לזיהום נתון האות גדל עם הזמן מעל 24 עד 48 שעות. שיא ההופעה הוא בסביבות 36 שעות לאחר ההזרקה כאן, אך התזמון עשוי להשתנות בהתאם לזן ולפלסמיד בו נעשה שימוש. הקפד למקם את העכבר בדיוק באותו אופן בכל פעם כדי להבטיח תוצאות כמותיות בסדרת הניסויים הבאה.

התפלגות ביולוגית של חיידקים מכומתת כדי למדוד את צמיחת החיידקים לאורך זמן באיברים שונים, חיידקים וגידולים ברי קיימא מכומתים על ידי כריתה והומוגניזציה של הגידול וציפוי הדילול הסדרתי שלו. ניתן לכמת איברים אחרים. באופן דומה, כאן השתמשנו בטחול מכיוון שיחס הטחול של הגידול הוא מדד אופייני לספציפיות חיידקים לאחר חישוב גב באמצעות גורם הדילול.

הספירות האלה מאפשרות לנו למדוד את אוכלוסיית החיידקים הספציפית לאורך זמן. משמאל, אנו יכולים לראות את מספר החיידקים גדל בהתמדה לאורך כל הניסוי. עם זמן הכפלה בין שעה לשלוש שעות, נמוך משמעותית מאשר בניסויי תרבית אצווה.

סביר להניח שהסיבה לכך היא התנאים התזונתיים הגרועים במיקרו-סביבת הגידול. מימין, כימתנו את יחס הטחול של הגידול וראינו שהוא עולה לאורך הניסוי. מטרת הניסויים הללו היא לנטר כמותית את הדינמיקה של גדילה וביטוי גנים של חיידקים וסביבות גידול באמצעות הדמיית IVUS וטכניקות ספירת מושבות.

הראינו שניתן לאפיין אוכלוסיות של חיידקים in vivo בסביבות גידול. בעתיד, ניתן יהיה לתכנן ולהנדס תוכניות ביטוי גנים מורכבות יותר לבניית מערכות אספקה טיפוליות מתוחכמות בחיידקים.