Name: בידוד של נוירונים חושיים של Aplysia californica להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למדו בידוד נוירונים חושיים מ-Aplysia californica לתיעוד זרמי יונים בטכניקת patch clamp. שיטה זו מאפשרת חקר תהליכי למידה וזיכרון ברמת התא הבודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מומן על ידי NIH P40 OD010952, קרן Korein, אוניברסיטת מיאמי המלגה לSLC ואחוות Maytag לATK. המחברים תודה להכיר את צוות של המשאבים הלאומי לAplysia, כמו גם לורן Simonitis וחנה פק, שסיפק micrographs לדמות.

1. הכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, לשקול ולהרדים בעלי חיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 30 ק&quot;ג חיה G-1. הרדימי במחזורי 5-10 בעלי חיים של 1:1 מי ים: MgCl איזוטוני. 6 שעות 2 0 במשך שעה 1 עם אוורור כגון משאבת אוויר אקווריום חשמלית עם airstone המצורף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדאי להכין ציוד לנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מגש חיתוך נקי עם סיכות ישרות מנירוסטה, כגון סיכות בד. להרכיב כמה צלחות פטרי המכילות מי ים מלאכותי (ASW; ראה לוחות 1 ו -3) + פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש מיקרוסקופ חשמל נמוך מוכן. יש מכשירי חיתוך נקיים מוכנים, כגון האף מצולעים ומלקחי כירורגיות בסדר, ובסדר ומספריים כירורגיות גדולים. לרסס את המכשירים עם 70% אלכוהול isopropol לפני השימוש ולאפשר לו להתייבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי החיים עמדו על מגש לנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדת חיה צד למטה הגחון במגש לנתיחה. בעלי חיים פיןדרך קצוות של קיר גוף וגבולות parapodial, אך להימנע מזנב וראש, כדי לחשוף את פני השטח הגבי וחריץ איברי המין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המשטח הגבי במים ברז קרים והאיטי בריצה. החל זרם אור של 70% אלכוהול isopropol מבקבוק לחיץ לאורך חריץ איברי המין ועל החלק העליון של הראש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את החתך הראשוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ כוח נמוך (ראה טבלה 2) ובא לידי ביטוי באור כדי לראות את הנקודה שבה חריץ המין נובע ממרווח הקליפה הקדמי, מתיחות להחזיק עם מלקחיים מצולע האף קיפול של רקמה בצד השמאל של מקור זה, תוך חיתוך רדוד חור לאורך כל הדרך החלק, האזור השטוח של קיר גוף רק בצד ימין של חריץ איברי המין עם מספריים בזווית משובחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemolymph יש לשים לב לשפוך מהחור, לעתים נושא עימה גנגליון בטן והבטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב את החתך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים גדולים כדי להרחיב את החתך דואר anteriorly לנקודה בין rhinophores, תוך משיכת כלפי מעלה עם הלהב התחתון, כדי למנוע גניבת ציוד המעיים. האיברים הפנימיים יקויימו לשפוך מתוך החתך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגרעינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את המגש ולמקד את המיקרוסקופ באזור הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים נקיים ומספריים עדינים, הסר את גרעיני הראש על ידי ניתוק בנקודה אחת את העצבים היוצרים את גרעיני הראש לתוך טבעת סביב הוושט כדי להסיר צדר-דוושה ומוחות גרעיני כקבוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גנגליון buccal ששומר על צד הגחון של הוושט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גנגליון הבטן על ידי חיתוך 4 connectives העצב גדול שהנושא מגנגליון זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הגרעינים של עניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך גרעיני ראש בנפרד, ומשאיר באורך של connectives מחובר זה לזה גנגליון של עניין ששווה לפחות הקוטר של גנגליון, זה יהיה לעכב אנזים יתר מערכת העיכולשל התאים של עניין בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים את כל גנגליון היעד באמצעות 2 שטיפות של ASW + P / S, נע בין שטיפות עם מלקחיים נקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מיקוד תאי PVC, השאר את hemiganglion צדר הזכות צמודה לhemiganglion הדוושה הימנית, ובאופן דומה לעזוב את hemiganglion צדר השמאלי מחובר לhemiganglion הדוושה השמאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך הגרעינים לא רצויים ושאר בעלי החיים על פי נוהג מקובל במחקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enzymatically לעכל את הגרעינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל גנגליון, להכין 1 מ&quot;ל של תמיסת אנזים בהיקף של 3.75 מ&quot;ג dispase, hyaluronidase 1 מ&quot;ג ו0.3 גרם collagenase הסוג XI לכל מ&quot;ל של ASW + P / S בצינור פוליפרופילן חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום נשטף הגרעינים בפתרון אנזים ולצרף את הכובע בחוזקה. מניחים את הצינור על צידו על שייקר סיבובי (ראה טבלה 2) במהירות איטית לשעה 13-5 בלילה כ 23 מעלות צלזיוס (טמפרטורת חדר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכןמנות התרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני microdissection (יום 2), להכין מנות התרבות במכסת מנוע בתרבית רקמת פולי-D-ליזין (PDL) מצופים. הוסף ~ 0.5 מ&quot;ל PDL (0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מים סטריליים) למרכז צלחת 35 מ&quot;מ ל~ 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את PDL 3x עם מים סטריליים. לאפשר לו להתייבש. UV-לעקר את הצלחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 בודד תאי עצב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מרכז 35 מנות מ&quot;מ שהיו PDL מצופה וUV מעוקר עם כ 0.5 מ&quot;ל של ASW + P / S כדי ליצור אי של מדיה בתוך הצלחת אחרת היבשה. ניתן לעשות זאת על הספסל, מחוץ למכסת מנוע בתרבית הרקמה. צלחת אחת צריכה להיות מוכנה לכל אשכול של תאים שמקורם hemiganglion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש צלחת לנתיחה בקוטר 100 מ&quot;מ מוכן שנעשתה על ידי sylgard ציפוי וריפוי משטח 5 מ&quot;מ עמוק נתיחה, לבוש עם סיכות לנתיחה קנס של כמה מידות כדי לשמש כסיכות ובדיקות (ראה טבלה 3). יש לשטוף את המנה הזו עם 70% אלכוהול isopropol, ולאחר מכן עם ASW + P / S, ולבסוף Fill עם ASW + P / S. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן microdissection של הגרעינים מעוכל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התמיסה המכילה אנזים צדר-הדוושה וbuccal הגרעינים מתעכלים לתוך הצלחת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ כנגד משטח שחור תחת אור מוחזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ברקמת החיבור המצורפת, להצמיד כל צד הגבי hemiganglion צדר-דוושה למעלה. הרקמות תהיה רכות ולא סובלניים של מתיחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissect נוירונים PVC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 2 זוגות של מלקחיים עדינים נקיים, ומחזיק את סיכת נתיחת קנס בזוג אחד של מלקחיים כמו בדיקה, לבודד את תאי PVC מhemiganglion פלאורלי. אנזים עיכול יהיה הוסר או שבורה מנדן רקמת חיבור המכסה את אשכול PVC, אך התאים ידבק אחד לשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הבדיקה לנתק את התאים הללו מחיבור דוושת פלאורלי 18, אז תן אשכול סתיו התא לחלק התחתון של הנתיחהמנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הנוירונים לצלחת התרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את אשכול התא לצלחת תרבות 35 מ&quot;מ שהוכנה על ידי בעדינות מתחנף האשכול לתוך קצה מעט אש מלוטשת חד פעמית זכוכית פיפטה פסטר, ולאחר מכן מחלק אותו לאט לתוך האי התקשורת בצלחת התרבות, להיות זהיר, כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך פיפטה. חזור על בידוד של אשכול PVC של hemiganglion האחרים והמקום לתוך צלחת תרבות נפרדת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissect ולהעביר נוירונים BSC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד את צד הגחון גנגליון buccal למעלה, בזהירות כדי לא לפגוע בתאים של עניין. חזור על שלב 1.12 עם 2 צבירי תאי BSC של גנגליון buccal 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של נוירונים PVC וBSC יהיה לייצר 4 מנות התרבות המכילות צבירי נוירונים המכילות: 2 מנות אשכולות BSC ו -2 מנות המכילים צבירי PVC. מחק את שאר הגרעינים ומניחים בצד הצלחת לנתיחה 100 מ&quot;מ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissociate את צבירי התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת תרבות המכילה תאים על הבמה של מיקרוסקופ כוח הנמוך ולהסיר את הכיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את אשכול PVC בעדינות על ידי מצליף את תחתית צלחת התרבות בסמוך לאשכול התא עם סיכת נתיחת קנס שנערכה במלקחיים. מצליף הוא לחפור את הקצה של הסיכה לתוך הפלסטיק של תחתית הצלחת כאילו מנסה לחפור את כתם מפלסטיק. כאשר חיכוך עם הפלסטיק משחרר את נקודת הסיכה, גל כלי הקשה מופק באמצעות המדיום שמפרק הגוש הסמוך של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנועות 05-10 מאי תהיה צורך כמעט לנתק את התאים לחלוטין, אבל עדיף להשאיר את האשכולות קטנים של תאים ולא לקפיציים יותר מדי פן ייהרסו את התאים על ידי צרופה מכאני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלפת מכסים ולחזור עם מנות התרבות אחרות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן תרביות תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מנות התרבות המכילות איי תקשורת במרכזים שלהם עם תאים ניתק לתוךמיכל גדול המאפשר זרימת אוויר, כגון צלחת 25 מ&quot;מ x 150 סיבוב פטרי פלסטיק, ומניח את המנה הזו בסט חממה עד 17 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקין בתא צלחת פתוחה של מים כמקור ללחות. לעזוב ללא הפרעה בין לילה. התאים ידבק בציפוי פולי-D-ליזין במרכז הצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות תרבות מבול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, בעדינות להציף את המנות עם 2.5 מ&quot;ל של ASW + P / S. לבחון וספירת התאים באמצעות מיקרוסקופ תרבית תאים הפוך. חנות ב17 ° C החממה. </li></ol></li></ol> 2. Electrophysiology השיטה היא תיקון סטנדרטי הידוק שתואר בטקסטים רבים (למשל סאקמן ונהר, 1995) 16. פרוטוקול זה יעבוד על תאי ≤ קיבול 100 PF, או תאים &lt;קוטר 60 מיקרומטר בימים 3 ו 4 לפרוטוקול. תאים ללא תהליכים הם אופטימליים להקלטה. Considerat המיוחד הבאיונים להחיל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לאכלס תאים גדולים יותר עם הגדרת התצורה במגבר 200B Axopatch מוגדר β = 0.1. הפעלה של זרמים גדולים מאוד עלולה לגרום לתאים כדי להימלט מהדק מתח. פתרונות ASW תחליף לתוכן מלח (לדוגמה: חלק של NaCl להחליף עם כלוריד N-methy-D-glucamine בלתי חדיר) עשויים לשמש כדי להפחית את כל משרעת נוכחית תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pipettes תיקון ורוסיליקט מלא סיבים משך על חולץ פיפטה וbackfilled אמצע הדרך עם פתרון תאי (ICS) בהיקף של 450 מ&quot;מ KCl ומלחים אחרים (ראה טבלת מס &#39;1) הם מתאים, וצריך להיות התנגדות של כ 0.5-1 MOhms. אם בידוד של זרמים יוניים ספציפיים הוא רצוי, למשל, Na + זרמים יכולים להיות מוחלפות בהיעדר זרמי K, K + בפתרון זה עם יונים אחרים כגון מדעי המחשב +. Cl - החלפה של מעגלים משולבים עם אניון impermeant גם אם מוצדק ICS טבעי יותר הוא רצוי9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הם חזקים עם&gt; 1 הקלטות ארוכות-HR אפשריים בטמפרטורת חדר. הקלטה היא אופטימלית בימים 3 ו -4 לפרוטוקול, המקביל ל 24-48 שעות בתרבות. לאחר 48 שעות יש קושי להרכיב חותמות gigaOhm, אולי בגלל הפירוט של glycocalyx על פני התא, ובעיות שנגרמו על ידי מהדק חלל תולדת תהליך. התאים שימושיים, עם זאת, ללימודים שאינם תיקון מהדק, כגון רעלים, שיכולים להתבצע ב&lt; 14 ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASW ופתרונות אחרים כדי להימכר מכשיר הפתרון האכיל את כוח הכבידה, כמו גם פתרון תאי, צריכים להיות מסוננים באמצעות מזרק רכוב 0.2 מיקרומטר Acrodisk מסנן (לוח 3) לחסל את החלקיקים קטנים שמפריעים להיווצרות חותם gigaOhm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחתת רגישות מתרחשת בעת שימוש באגוניסטים כגון D-Aspartate (D-ASP), ולכן ~ 1-2 דקות בין יישומים של אגוניסטים מומלץ. לעומת זאת, potentiation הוא נצפה לעתים קרובות עם appli חזר מהירקטיון של אגוניסטים כגון L-גלוטמט (L-Glu). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אגוניסט זרמים הופעלו כגון L-Glu ניתן ללמוד על ידי יישום אגוניסטים עם פיפטה Picospritzer. פיפטה זה משך את אותו הדבר כמו פיפטה את התיקון והוא מכיל אגוניסט בASW. כאשר קצה פיפטה זו ממוקם מתחת לצינור היציאה של מכשיר הפתרון האכיל את כוח הכבידה, ובזווית של ° 45 מצינור יצוא (איור 2F), אגוניסט יהיה שטף במהירות מתא, והפחתת הרגישות תהיה ממוזער. פיפטה אגוניסט צריכה ליצור זווית של 90 מעלות או יותר יחסית לפיפטה את התיקון. </li></ol>

<ol><li>Buttner, N., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+modulation+of+a+hyperpolarization-activated+Cl%28-%29+current+in+Aplysia+sensory+neurons+by+SCP%28B%29+and+FMRFamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide.</a> J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).</li>
<li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).</li>
<li>Carlson, S. L., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).</li>
<li>Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Behav%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).</li>
<li>Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Na%2B+and+Ca2%2B+currents+in+bag+cells+of+sexually+immature+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).</li>
<li>Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+D-Aspartate+ion+currents+in+the+Aplysia+nervous+system+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging.</a> Br. Res. 1343, 28-36 (2010).</li>
<li>Glansman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+in+Aplysia%3A+The+Cheshire+Cat+of+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).</li>
<li>Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cellular+Mechanism+of+Classical+Conditioning+in+Aplysia%3A+Activity-Dependent+Amplification+of+Presynaptic+Facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%2C+New%22%5BJournal%5D)">A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation.</a> Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).</li>
<li>Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acetylcholine+on+ventrocaudal+sensory+neurons+in+the+pleural+ganglia+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia.</a> Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Cellular+basis+of+behavior%22">Cellular basis of behavior</a>. , W.H. Freeman. New York. (1976).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialog+between+nerves+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li>
<li>Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+correlates+of+habituation+and+habituation+of+the+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).</li>
<li>Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+an+Aplysia+bag-cell+neuron+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+A+and+a+protein+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase.</a> J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).</li>
<li>R, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transcriptome+of+Aplysia%3A+neuronal+compartments+and+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry.</a> Cell. 127, 1453-1467 (2006).</li>
<li>Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+underlying+developmental+regulation+of+repetitive+firing+in+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).</li>
<li>Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+Ca2%2B+current+contributes+to+a+prolonged+depolarization+in+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).</li>
<li>Schacher, S., Proshansky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+regeneration+by+Aplysia+neurons+in+dissociated+cell+culture%3A+modulation+by+Aplysia+hemolymph+and+the+presence+of+the+initial+axonal+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment.</a> J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).</li>
<li>Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoafferent+neurons+innervating+tail+of+Aplysia.+I.+Response+properties+and+synaptic+connections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections.</a> J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).</li>
<li>Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Ca%282%2B%29-sensitive+nonspecific+cation+channel+underlying+prolonged+repetitive+firing+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons.</a> J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).</li>
<li>White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+regulates+a+vesicular+class+of+calcium+channels+in+the+bag+cell+neurons+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).</li>
<li>Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+a+calcium-sensitive+nonspecific+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+and+phosphatase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J. Vis. Exp. (28), e1355(2009).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

טכניקות דיסוציאציה מתוארות כאן יניבו תרבויות נוירון חושיות המכילות 50-100 נוירונים בודדים וביניהם מספר קטן של תאי גליה ובלתי מזוהים אחרים. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם זמן הגרעינים יישארו בפתרון אנזים, והמצליף, ניתוק מצבירי התאים מתעכלים להתפרק האשכול לתוך תאים בודדים. אנזים עיכול (שלב 1.8) חייב להיות מותאם בטמפרטורה זמינה. בשעה 23 ° C עם רעד איטי, 13 שעות מספיקות לעיכול של BSC אשכולות while15 שעות היא אופטימלית עבור אשכולות PVC. תשואות נמוכות בתא צלחת התרבות ניתן לייחס לזמן...

רכיכת opistobranch הימית, Aplysia, כבר מודל הנוירוביולוגי שימושי במשך עשורים רבים. הוא ידוע בעיקר כמודל של התרגלות והתניה קלסית 7, 8. מחקרים על למידה וזיכרון במודל זה זכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 2000 לאריק ר &#39;קנדל, בפרס הוא משותף עם Arvid Carlsson ופול גרינגרד 10. מחקרים שכלל הקלטות חשמל מהכנות מופחתות, שבו אלמנטים של מערכת העצבים של חסר חוליות זה הם גזורים מבעלי החיים עם עצבים ושרירים עזבו מצורף, סייעו להבהיר את התפקידים של נוירונים בודדים בAplysia. זיהוי של מנגנונים מולקולריים מדויקים המהווים למידה בAplysia עם זאת, לעתים קרובות מועסק טכניקה אחרת, לטווח ארוך שיתוף תרבויות של נוירון חושי וmotoneuron, השיגה אחד אחד מבעלי החיים תורמים בודדים ואפשרו ליצירת סינפסה בצלחת תרבות 21 . אנחנו ואחרים 1, 3, 6, 14, 15, 16, ניצלו את הקלות שבי זיהה יכולים להיות ממוקדים נוירונים במודל זה, כמו גם הסיבולת שלהם בניסויים לטווח ארוך כדי להפוך את תרבויות טווח קצרות ניתקות של צבירי נוירונים להלכה הומוגניות שבו אנחנו לומדים זרמים יוניים תחת מהדק מתח בתצורת תיקון המהדק. נוירונים רבים Aplysia לעמוד לסיבובים חוזרים ונשנים של תיקון הידוק כדי לאפשר זמן למניפולציות ניסיוני לטווח ארוך. הטכניקה שימושית לתאי עצב, כגון תאי neurosecretory השקית של גנגליון הבטן, ואת עצב סנסורי של גרעיני צדר וbuccal דיסוציאציה שאנו מתארים כאן, אבל לא לתאי עצב גדולים מאוד&gt; קוטר 60 מיקרומטר, כגון L7 או R2 של גנגליון הבטן. אנחנו לא מעסיקים Aplysia סרום בתרבויות שלנו, בניגוד לשיתוף התרבויות חושי motoneuron המתוארת במקום אחר. רוב הנוירונים שהושגו באמצעות הליך זה יהיו ללא תהליכים עבור tאז הוא ראשון 48 שעות בתרבות, בהנחיית שלמה הקלטת מתח תא, אלא יצמח ולפרט אקסונים ותהליכים אחרים למשך כ 14 ימים לפני שמת ממחסור בחומרים מזין ו / או גורמי גדילה. טכניקה זו מייצרת תרבויות העיקריות של 50-100 נוירונים לכל צלחת מאזורים שתועדו פיסיולוגיים של גרעיני buccal וצדר. פרוטוקול זה שימושי לחוקרים לומדים היבטים של פיזיולוגיה של תא בודד בניסויים הדורשים ניסיון רב משכפל לכל בעלי חיים. הוא מייצר זוג תואם של תרבויות בשל ההפרדה האנטומי של תאי המטרה לhemiganglia ימין ועל שמאל, ומאפשר שתועלת ממחקרי הטיפול מתאים ותרבויות בקרה. פרוטוקול מטרות מצרר buccal S (BSC) הנוירונים של גנגליון buccal ופלאורלי ventrocaudal (PVC) הנוירונים של גנגליון פלאורלי. תאים אלה הם גודל מתאים לכל הקלטות מתח תא וRobus התצוגהתגובות glutamatergic t. המתודולוגיה דנה מתאימה לרוב הגרעינים במערכת העצבים Aplysia.

<table><tbody><tr><td>מי ים מלאכותיים ASW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>מגוון</td> <td>(מ"מ): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6</td></tr><tr><td>תמיסה תוך-תאית</td><td>סיגמא</td><td>מגוונת</td> <td>(מ"מ): 450 KCl, 2.9 CaCl<תת>2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA ו-40 HEPES-KOH, pH 7.4</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין נוסף ל-ASW בשעה 1:100</td><td>Lonzo Walkersville, Inc.</td><td>17-603E</td><td>5,000 יחידות/מ"ל פניצילין בתוספת 5,000 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>Neutral dispase II</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10165859001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>היאלורונידאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-גלוטמט (L-GLU)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>49601-100G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-אספרטט (D-ASP)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11200-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N-מתיל-D-אספרטט (NMDA)</td><td>ביומול</td><td>100002-268</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-ASP</td><td>Sigma</td><td>A6683-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אלפא-אמינו-3-הידרוקסיל-5-מתיל-4-איזוקסזול-פרופיונית (AMPA)</td><td>Sigma</td><td>A6816-5MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטגוניסטים של L-Glu R</td><td></td><td>שונים שונים</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אגר</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קינורנט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>61250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>APV</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DL-2-אמינו-5-פוספונופנטנואית חומצה (אנטגוניסט NMDAR)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>VWRSP</td><td>BDH1133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>מגוון</td><td>25 גרם FeCl3 + 25 מ"ל HCl מרוכז + 50 מ"ל H2O</td></tr><tr><td>סיליקון סילגארד פולימר 2 חלקים</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYL184</td><td>מספק משטח פינ-אאוט לצלחות חיתוך קטנות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הגדלה זום 0-40x לנתיחות</td><td>Wild</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Techniquip 150 וואט סיבים אופטיים תאורה</td><td>מיקרואופטית של פלורידה</td><td>TQ FOI-150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>מערבל <td></td><td></td><td>אורביטלי RotoMix 50800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך של Nikon Diaphot עם מטרות 4x, 20x (אופציונלי) ו-40x</td><td>SR Research Ltd.</td><td>Eyelink II</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אוסצילוסקופ דיגיטלי Tektronix</td><td>SR Research Ltd.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pClamp 10 תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים</td> התקנים <td></td><td>מולקולריים</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מחשב עם מערכת הפעלה Windows XP ומעלה</td><td>פתרונות</td><td></td> מחשב <td>Thinkserver עם כוננים קשיחים במצב מוצק (80GB) וצגי רעש נמוכים</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה Flaming/Brown P87</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מגבר מהדק Axopatch 200B מבית Axon Instruments עם תחום קיזוז קיבוליות של 1-1000 pF; קדם-מגבר</td> התקנים <td>מולקולריים, Sunnyvale, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מכלול מחזיק אלקטרודות של Axon Instruments עבור Axopatch 200B קדם מגבר</td><td>התקנים מולקולריים, Sunnyvale, CA</td><td>CV203BU</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ממיר A/D Digidata 1200</td><td>התקנים מולקולריים, Sunnyvale, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פיקוספריצר, מופעל על ידי N2 מתכוונן ללחץ ומשך פרקר</td><td>האניפין, קליבלנד, אוהיו</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>שולחן בידוד רעידות TMC Micro-G</td><td>Ametek</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>כלוב</td><td></td><td></td> פאראדיי <td>ייצור מותאם אישית</td></tr><tr><td>Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators</td><td>Burleigh Instruments; Thorlabs</td><td></td><td>כיום PCS-5000; -סדרה 6000 + תושבות</td></tr><tr><td>מניפולטורים ידניים Narishige M-152 (למערכת זלוף ופיקוספריצר)</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>זכוכית פיפטה נימה, 1.5 מ"מ OD, קוטר פנימי 0.84 מ"מ -</td><td>WPI</td><td>1B150-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>אורך <td></td><td></td><td>3 אינץ'</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ag/AgCl חצי תא</td><td>WPI</td><td>EP4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, צינורות צנטריפוגה 35-2097 BD Falcon*</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים זוויתיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15006-09</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים משובחים של דומוסטר</td><td>כלי מדע משובחים</td><td>11295-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות בז 35 מ"מ</td><td>VWRSP</td><td>25382-064</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פלקון 150 x 25 מ"מ כלי תרבית רקמה; 1013</td><td>VWRSP</td><td>1013</td><td>ניתן גם להפוך לכלי חיתוך קטנים עם sylgard</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>WPI</td><td>SYL184</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מגש נתיחת בעלי חיים</td><td>שונים</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, 35-2097 BD Falcon</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>למערכת זלוף 6 קדחים המוזנת בכוח הכבידה</td></tr><tr><td>קליפסים מאלומיניום עם קצוות חור בורג</td> חנות <td></td><td>לחומרי בניין</td><td>למערכת זלוף</td></tr><tr><td>23 מחטים (נקודות כיבוי תיוק ידניות)</td> <td>VWRSP</td><td></td><td>למערכת זלוף</td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן 0.022 "מזהה x 0.042" OD; 427411</td><td>בקטון-דיקינסון</td><td></td><td>עבור מערכת זלוף</td></tr><tr><td>H-7 פיפטה מעמד / מחזיק למערך זלוף microcap</td><td>Narishige ארה"ב</td><td></td><td>למערכת זלוף</td></tr><tr>שסתומים <td></td><td></td><td>חד כיווניים</td><td>למערכת זלוף</td></tr><tr><td>Drummond Microcaps 1 &mu; l</td><td>VWRSP</td><td></td><td>למערכת זלוף</td></tr><tr><td>18 מחטי מד ליניקה (תייק נקודות)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן</td><td>קול פארמר</td><td>4.27436E+11</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סיכות חיתוך עדינות</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>26002-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות נימיים</td><td>Kimble 71900-100</td><td></td><td>מלוטשים באש ובצורת U בלהבת מבער בונסן וממולאים באגר 3% בחנות</td></tr> <tr><td></td><td>מלאכת</td> <td>חימר לדוגמנות</td> ECS<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מחזיק כלים לשלב מיקרוסקופ עם אמבט</td><td></td><td></td> קרקע מבודד <td>ייצור מותאם אישית</td></tr><tr><td>פיפטות פסטור</td><td>VWRSP</td><td>14672-412</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נורות פיפטה</td><td>VWRSP</td><td>53283-911</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מסנני מזרק Acrodisk</td><td>VWRSP</td><td>28144-040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>זכוכית נימה בורוסיליקט בקוטר 1.5 מ"מ בקוטר 1.5 מ"מ</td><td>WPI</td><td>1B150F-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>גליל חנקן בטוהר גבוה ווסת</td><td></td><td></td> מתפצל<td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">טבלאות 1-3. רשימות ריאגנטים, חומרים וציוד.</td></tr></tbody></table>

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

יש חלזון הרכיכה הימי Aplysia californica היסטוריה מכובדת כמודל של תפקוד מערכת עצבים, עם משמעות מיוחדת במחקרים של למידה וזיכרון. ההכנות האופייניות למחקרים מסוג זה הן אלה שבי חושיים ונותרו ללא פגע motoneurons בבעלי חיים גזורים מינימאלי, או תרבות משותפת עצבית טכני משוכללת של חושי וmotoneurons פרט. פחות נפוץ היא ההכנה העצבית המבודדת שבו אשכולות קטנים של תאי עצב להלכה הומוגניות הם ניתקו לתוך תאים בודדים בתרבות בטווח קצרה. תאים מבודדים כאלה שימושיים לאפיון biophysical של זרמי יונים באמצעות טכניקות מהדק תיקון, ואפנון ממוקד של conductances אלה. פרוטוקול להכנת תרבויות כאלה מתואר. הפרוטוקול מנצל את עצב סנסורי glutamatergic בקלות לזיהוי של גרעיני צדר וbuccal, ומתאר את הניתוק שלהם ותחזוקה המינימאליתתרבות n במשך כמה ימים ללא סרום.

את מיקומם של תאי העצב התחושתיים בתוך הגרעינים שממוקדים בפרוטוקול זה, הנוירונים BSC ו-PVC מוצגים באיור 1. הנוירונים BSC נמצאים ב2 אשכולות סגלגלים סימטריים בצד הגחוני של גנגליון buccal, את פני השטח שפונה מגוש buccal בגנגליון שלם (איור 1 א). הנוירונים PVC יצירת צבירים דו צדדיים, בצורת V שמקיפים את פני השטח הגבי של גנגליון צדר לכיוון הציר המרכזי (איור 1). יש עצב סנסורי אלה יש את היתרון של מיקום סטריאוטיפי בתוך הגרעינים, למרות מקבץ ימי...

אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת הימית<em&gt; Aplysia</em&gt; אחרי הרדמה, הבידוד של תאי עצב לתרבות לטווח קצר, ברקמות ובהקלטות של זרמי יון תא בודדים באמצעות טכניקת מהדק התיקון.

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד נוירונים תחושתיים בודדים של הפלגיה בתרבית לטווח קצר. לצורך מחקרי patch clamp, הדבר משיג תחילה על ידי דיסקציה של הגנגליונים המכילים תאים תחושתיים מבעל חיים הרדום. השלב השני הוא עיכול של הגנגליונים בתמיסת אנזימים למשך הלילה.בשלב הבא, מבודדים את הנוירונים התחושתיים הרלוונטיים מהגנגליונים שעברו עיכול. השלב הסופי הוא דיסוציאציה של צלחות התרבית שהוכנו, לצורך היצמדות למצע התרבית למשך לילה. לבסוף, נעשה שימוש בקיבוע מתח (voltage clamping) כדי לחקור את זרמי היונים המופעלים על ידי מתח ואגוניסטים המובעים בנוירונים אלו.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הקלטת תאים in situ, הוא שבידוד הנוירונים מאפשר שימוש בטכניקת voltage clamping באמצעות אלקטרודה בודדת. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי נעלמים מרכזיים בתחום הנוירוביולוגיה של התפוח, כגון זהותם של זרמי יונים המופעלים על ידי מוליכים עצביים המעורבים בלמידה ובזיכרון. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקשיים בשל רגישות הנוירונים לעיכול אנזימטי ולפיזור על מבקרי תרבית.הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר הבנו שזרמים גלוטמטרגיים מסוימים, החשובים ללמידה ולזיכרון, יפיקו תועלת מבידוד התאים שהשיטה זו מספקת. את הפרוצדורה ידגימו סטודנטים לתארים מתקדמים, Andy Kesel ו-Justin Greer. התחילו את הפרוצדורה על ידי הנחת בעל חיים בהרדמה כשצדו הגחוני פונה כלפי מטה במגש הניתוח.הנעס את בעל החיים דרך קצוות דופן הגוף והשוליים הפארא-פואליים, אך הימנע מהזנב והראש כדי לחשוף את הפני השמאליים של התעלה הגניטלית. לאחר מכן, שטוף את הפני השמאליים תחת זרימה איטית של מי ברז קרים. לאחר מכן, שפוך זרם קל של 70% isopropyl alcohol מבקבוק לחיצה לאורך התעלה הגניטלית ומעל ראש בעל החיים.כדי לבצע את החתך הראשוני, החזקו בחוזקה קיפול של רקמה משמאל לבסיס התלם הגניטלי (genital groove) באמצעות פינצטת rib nose, ובו-בזמן גזרו חור רדוד לכל עוביו של האזור החלק והשטוח של דופן הגוף, מימין לתלם הגניטלי, בעזרת מספריים זוויתיים עדינים. לאחר מכן, הרחיבו את החתך קדימה עד לנקודה שבין ה-ROF fours, תוך משיכה כלפי מעלה עם הלהב התחתון כדי למנוע פגיעה במעי. לבסוף, השתמשו בפינצטה נקייה ובמספריים עדינים כדי להסיר את גנגליית הראש על ידי חיתוך הנקודה שבה העצבים המרכיבים את גנגליית הראש הופכים לטבעת מסביב לוושט, וזאת כדי להסיר את הגנגליות הפלאורליות, הפטליות והמוחיות כקבוצה אחת.לאחר מכן, הסר את הגנגליון הפהי (buccal ganglion) הדבוק לצדו הגבני של הוושט. כדי לבודד את הגנגליונים הרלוונטיים, גזים את גנגליוני הראש בנפרד, תוך השארת מקטע של רקמה מחברת המחוברת לכל גנגליון רלוונטי, שאורכו שווה לפחות לקוטרו של הגנגליון. פעולה זו תעכב את האנזים ממספר עיכול יתר של התאים הרלוונטיים בשלב הבא.לאחר מכן, שטפו כל גנגליון מטרה פעמיים בצלחות המכילות מי ים מלאכותיים עם פניצילין סטריפטומייצין. אם המטרה היא תאי ה-PVC, השאירו את ה-right pleural hemi ganglion מחובר ל-right petal hemi ganglion, ובדומה לכך, השאירו את ה-left plural hemi ganglion מחובר ל-left petal hemi ganglion. לאחר מכן, הניחו את הגנגליונים השטופים בתמיסת האנזים וסגרו את הפקק היטב.לאחר מכן, הנח את המבחנה על צדה במנער מסתובב (rotary shaker) וכוון למהירות נמוכה למשך 13 עד 15 שעות במהלך הלילה בטמפרטורה של כ-23 degrees Celsius. בהליך זה, מלא את מרכז הצלחות בעלות קוטר 35 millimeter, שעברו ציפוי PDL ועיקור ב-UV, בכמות של כ-0.5 millimeter של מי מלח מלאכותיים ופניצילין סטריפטומייצין, כדי ליצור "אי" של מצע בתוך הצלחת. כדי להכין את המיקרו-דיסקציה של הגנגליונים שעברו עיכול, שפוך את תמיסת האנזים המכילה את הגנגליונים הפלאוראליים, הפדאליים והבוקאליים שעברו עיכול אל תוך צלחת הדיסקציה.בשלב הבא, הניחו את הצלחת עלבמתו של המיקרוסקופ על רקע שחור תחת תאורה מחזירה. לאחר מכן, בעזרת רקמת חיבור מצורפת, הצמידו בסיכות כל אחת מהחצאי-גנגליונים הפלורליים (pleural petal hemi ganglion) כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה; הרקמות יהיו רכות ולא יעמדו במתיחה. לאחר מכן, בודדו את תאי ה-PVC מחצי-גנגליון פלורלי באמצעות שני זוגות פינצטות, כאשר באחת מהן מחזיקים סיכת דיסקציה דקה המשמשת כגשש.השתמשו בProbe כדי להפריד תאים אלה מה-petal, plural, connective. לאחר מכן, הניחו לצביר התאים ליפול לתחתית כלי הדיסקציה. העבירו את צביר התאים לכלי תרבית של 35 מילימטר שהוכן מראש, על ידי שאיבה עדינה של הצביר לקצה של פיפטת פסטור מזכוכית חד-פעמית שעברה ליטוש באש.לאחר מכן, העבירו אותו באיטיות אל תוך אי של מדיום בתוך צלחת תרבית, תוך הקפדה להימנע מהחדרת בועות אוויר לפיפטה. חזרו על בידוד צבר ה-PVC של חצי הגנגליון השני והניחו אותו בצלחת תרבית נפרדת. כאן מוצגת פוטו-מיקרוגרפיה של צבר תאי ה-PVC הכתומים-כהים בצורת V של חצי הגנגליון הפלורלי הימני.על מנת לבצע דיסקציה של נוירוני ה-BSC, ראשית מקבעים את הגנגליון הבוקאלי (buccal ganglion) כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה, תוך הקפדה על זהירות כדי לא לפגוע בתאים המבוקשים. לאחר מכן, מבודדים את תאי ה-BSC באמצעות שני זוגות פינצטות, כאשר באחת מהן מחזיקים סיכת דיסקציה דקה המשמשת כגשש.בשלב הבא, השתמשו בפרובה כדי להפריד תאים אלו מהגנגליון הבוקאלי. לאחר מכן, הניחו לתאים לשקוע לתחתית צלחת הניתוח. מיקרוגרף זה מציג את מיקומם של התאים הגלוטמטריים של הגנגליון הבוקאלי.ניתן לזהות את נוירוני ה-BSC לפי צבעם הכתום כהה. בידוד נוירוני PVC ו-BSC מניב ארבעה כלי תרבית המכילים צבירי נוירונים. שתי צלחות המכילות צבירי BSC ושתי צלחות המכילות צבירי PVC.השליכו את שאר הגנגליונים והניחו בצד את צלחת הדיסקציה בגודל 100 מילימטר לצורך פירוק צבירי התאים. הניחו צלחת תרבית המכילה תאים על הבמה של המיקרוסקופ בעוצמה נמוכה והסירו את המכסה. הקפישו בעדינות את תחתית צלחת התרבית בסמוך לצביר התאים.באמצעות סיכת דיסקציה דקה המוחזקת בפינצטה, ייתכן שיהיה צורך ב-5 עד 10 נקישות כדי להפריד את התאים לחלוטין. לאחר מכן, חזור על הפעולה עם צלחות תרבית אחרות. בשלב הבא, מקם את צלחות התרבית המכילות איים של מדיום עם התאים המופרדים בתוך מכל גדול המאפשר זרימת אוויר, כגון צלחת פטרי פלסטית עגולה בקוטר 150 על 25 מילימטר.הניחו את הצלחת באינקובטור המכוון ל-17 °C. לאחר מכן, הניחו בתא צלחת פתוחה של מים כמקור ללחות והשאירו אותן ללא הפרעה למשך הלילה כדי לאפשר לתאים להיצמד לציפוי הפוליליזין במרכז הצלחת. למחרת, מלאו בעדינות את הצלחות ב-2.5 mL של מי מלח מלאכותיים ופניצילין סטריפטומייצין, ובחנו וספרו את התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך לתרביות תאים.כאן מוצגים נוירוני BSC חיים לאחר יום אחד בתרבית; תאי ה-BSC הם בדרך כלל גדולים יותר מתאי PVC, בגודל של 40 microns. כאן מוצג נוירון PVC חי לאחר שבוע בתרבית, המראה צמיחת שלוחות. כאן מוצג זרם עירור המועבר על ידי יוני נתרן בתגובה לפולס של AL glutamate, וכאן מוצג זרם בתגובה ל-D aspartate.הזרמים המופעלים על ידי NMDA הם בדרך כלל בעלי אמפליטודה קטנה יותר מאלו המופעלים על ידי האגוניסטים האחרים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להימנע מפגיעה בנוירונים במהלך הדיסוציאציה. יתרון אחד של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת שתי תרביות מכל גנגליון, כך שניתן להשתמש באחת כביקורת תואמת לתרבית הניסיונית.ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור תרביות ראשוניות של נוירונים מ-plegia או מבעלי חולרים ימיים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים נוירונים תחושתיים של plegia באמצעות עיכול אנזימטי של הגנגליון, ולאחריו דיסוציאציה זהירה של התאים המבוקשים.

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

הטכניקה מתוארת עבור השתלה...

אלקטרודה ייצור השרשה ב Aplysia californica עבור הקלטות רב ערוצי עצבית ושרירי ב, חיים שלמים חופשי מתנהג

אנו מראים כיצד שינויים בריכוז התאי החופשיים הסיד ויעילות הסינפטית ניתן לפקח במקביל בהכנה של...

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

אנו מתארים טכניקת extracellularly להקליט ולעורר מעצבים, שרירים, ונוירונים בודדים...

<em&gt; במבחנה</em&gt; הכנה להפקה והקלטה של ​​תוכניות רכב האכלה עם תנועות פיסיולוגיות<em&gt; Aplysia californica</em

ההכנה של פרוסות חריפות מוח מhippocampi המבודד, כמו גם את ההקלטות אלקטרו סימולטני של האסטרוציטים ונוירונים...

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

סרטון זה מדגים את ההליך למיפוי קשרים סינפטיים על ידי אבטחת פרוסת מוח, מיקום פיפטות להשגת תצורות של תאים שלמים, וגירוי נוירונים קדם-סינפטיים להקליט תגובות פוסט-סינפטיות, ובכך להבהיר קישוריות עצבית.

רישום מהדק טלאי זוגי של הקשרים העצביים בפרוסות מוח חריפות

בבעלי חיים עם נוירונים שזוהו גדולים...

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em&gt; Aplysia californica</em

חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

הקלטת זרמי Ca2+ בקרום הפנים של השחרור הפרה-סינפטי היא המפתח להבנה מדויקת של כניסת Ca2+ ושחרור נוירוטרנסמיטרים. אנו מציגים דיסוציאציה חריפה של חוט השדרה הצמד המניב אקסונים רשתית מבודדים פונקציונליים, המאפשרים הקלטה ישירות מקרום הפנים המשוחרר של מסופים פרה-סינפטיים בודדים.

החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

הקלטות מהדק טלאי ומילוי ביוציטין תוך-תאי בו זמנית של נוירונים מצומדים סינפטית בפרוסות מוח חריפות מאפשרים ניתוח מתואם של תכונותיהם המבניות והתפקודיות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השלבים הטכניים החיוניים של רישום אלקטרופיזיולוגי ממיקרו-מעגלים עצביים והניתוח המורפולוגי שלהם לאחר מכן.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

כאן, אנו מתארים את השלבים החיוניים להקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ זני הסובסטנציה gelatinosa (SG) נוירונים בתוך הפרוסה חוט שדרה במבחנה . שיטה זו מאפשרת את מאפייני קרום פנימי, הסינאפסית ואפיון מורפולוגי של ס ג נוירונים שילמדו.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

למדו בידוד נוירונים חושיים מ-Aplysia californica לתיעוד זרמי יונים בטכניקת patch clamp. שיטה זו מאפשרת חקר תהליכי למידה וזיכרון ברמת התא הבודד.

בידוד של נוירונים חושיים של

גלה סרטונים נוספים