פסיבציה משטח ללימודי חלבון מולקולה בודדת

המטרה הכוללת של הליך זה היא להניב משטח שקופיות קוורץ באיכות מעולה. זה מושג על ידי ניקוי ראשון של שקופיות קוורץ קדוחות וכיסוי החלקות במים ואצטון. לאחר מכן השקופית נחרטת באשלגן הידרוקסיד ובתמיסת הפיראנה כדי לשפר את איכות המשטח.

לאחר מכן, השקופיות והחלקות הכיסוי מתפקדות עם קבוצות אמין ואחריהם שני סבבים של משטח באמצעות פולימר כדי להפוך את משטח הזכוכית לאינרטי. השלב האחרון הוא להרכיב את התא המיקרופלואידי מהמגלשה ולכסות את החלקה כשהמשטחים המצופים בפוליאתילן גליקול או פגילטים פונים זה לזה. בסופו של דבר, אסטרטגיה חדשה של טיפול במשטח עם מולקולות יתד על פני שני סבבים משפרת באופן ניכר את איכות הפסיבציה כפי שנצפתה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של מולקולה בודדת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו או הטכניקות הקיימות כגון ציפוי פולימרי לאחר תחריט תחמוצת אשלגן הוא שטכניקה זו מבטיחה איכות מעולה. אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש לבצע טיפולי שירות מרובים. המקדחה להתחיל, הקוורץ שקופיות כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

נקו את השקופיות על ידי הנחת השקופיות בצנצנת מכתים מזכוכית. בדרך כלל ניתן להניח חמש עד 15 שקופיות בצנצנת אחת. לאחר מכן שטפו את המגלשות במי UE לאחר חזרה על השטיפה שלוש פעמים, סוניקציה של המגלשות במי UE למשך חמש דקות כדי להסיר לכלוך, השליכו את המים ושטפו את המגלשות שלוש פעמים נוספות במי UE.

לאחר מכן, החלף את מי ה-UE באצטון וסוניקציה של השקופיות באצטון למשך 20 דקות או יותר, השליך את האצטון ושטוף את השקופיות במי Milli Q כדי להסיר שאריות אצטון. לאחר מכן, החליפו את המים באשלגן הידרוקסיד מולארי אחד והפכו את המגלשות לסוניקציה למשך 20 דקות או יותר. תחריט מוגזם ישפר את איכות המשטח, אך יכניס שריטות שעלולות להפריע להדמיה פלואורסצנטית.

שטפו את השקופיות במי Milli Q שלוש פעמים כדי להסיר עקבות של אשלגן הידרוקסיד לביצוע תחריט פיראנה. העבירו את השקופיות למחזיק שקופיות של דוראן או למחזיק טפלון בהתאמה אישית, והניחו אותן בכוס ליטר אחד שנמצאת במכסה מנוע כימי. מלאו את הכוס ב -450 מיליליטר חומצה גופרתית.

לאחר מכן הוסף 150 מיליליטר מי חמצן ליחס של שלושה לאחד בין חומצה גופרתית למי חמצן. מערבבים את התמיסה לערבוב נכון ומשאירים את הכוס ללא הפרעה למשך 20 דקות. הוציאו את השקופיות מתמיסת הפיראנה והכניסו אותן למחזיק שקופיות המכיל מיליו מים.

בינתיים, השליכו את תמיסת הפיראנה לבקבוק פסולת ייעודי ברגע שהיא מגיעה לטמפרטורת החדר, שטפו את המגלשות שלוש פעמים במי UE לאחר ניקוי החלקת הכיסוי. החלף את מי ה- UE בכלים המכתימים במתנול. שמור את השקופיות והכיסוי מחליק במתנול.

בינתיים, הכינו את תמיסת אי האמינו על ידי שפיכת 100 מיליליטר מתנול לבקבוק. לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר חומצה אצטית ושלושה מיליליטר של שלושה אמינו פרופיל, טרימתיל, ומערבבים בעדינות על ידי ניעור. החלף את המתנול בכלי הצביעה המכילים את השקופיות והכיסוי מחליק בתערובת תגובת סילואי האמינו.

דגירה במשך 20 עד 30 דקות במהלך הדגירה סוניקט פעם אחת למשך דקה. לאחר מכן, החלף את תגובת אי האמינו במתנול. לאחר מכן השליכו את המתנול והוסיפו תמיסת מתנול טרייה.

חזור על הליך זה שלוש פעמים לסיבוב הראשון של פני השטח בעזרת פולימר תחילה, יבש את השקופיות והכיסוי מחליק באמצעות גז חנקן. לאחר מכן הניחו אותם בקופסאות פיפטה נקיות מלאות חלקית במי מילי Q בצורה כזו שהצד, שצריך לעבור פגילה, פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הוסף 64 מיקרוליטר ממאגר התגובה הטרי שהוכן לתמיסת יתד מוכנה.

פפטו את התערובת למעלה ולמטה על מנת להתמוסס לחלוטין. ואז צנטריפוגה ב 16, 100 גרם למשך דקה. כדי להסיר בועות אוויר, זרוק 70 מיקרוליטר מתערובת הפגילציה על שקופית קוורץ מיובשת.

הניחו בעדינות פתק כיסוי מיובש מעל התמיסה, דגרו את המגלשות בסביבה חשוכה ולחה למשך שעתיים עד לילה כדי לאחסן את השקופיות והחלקות הכיסוי. פירק בזהירות את המגלשה ואת החלקת הכיסוי על ידי החלקת החלקת החלקת הכיסוי לצדו ושטיפתם במי UE לפני ייבושם בגז חנקן. הנח זוג שקופיות והחלקת כיסוי בצינור של 50 מיליליטר כך שהמשטחים הפגיליים פונים זה לזה.

סגור חלקית את הצינור ושואב אותו לפני מילויו בגז חנקן והברגת המכסה בחוזקה. אחסן אותו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. שלבים אלה מסייעים בשימור המשטח הפגיל למשך תקופה ארוכה.

בצע סיבוב שני של פגילציה כמתואר בפרוטוקול הטקסט מיד לפני השימוש בשקופית להרכבת תא מיקרופלואידי. הנח שקופית קוורץ על משטח ישר כשהצד הפגיליסט פונה כלפי מעלה. צור תעלה באלכסון על המשטח הפגיל על ידי הנחת סרט דביק דו צדדי מעל המגלשה.

ודא שהחורים ממוקמים במרכז התעלה. לאחר מכן הניחו בעדינות החלקת כיסוי פגיל על גבי כדי להשלים את החדר. כשהצד הפגיל פונה כלפי מטה.

אטום את החדר על ידי לחיצה על החלקת הכיסוי מעל האזורים שבהם מונח הסרט הדו-צדדי. עשו זאת בעדינות אך ביסודיות כך שהתא יהיה אטום למים. לבסוף, סגור את שולי החדר עם דבק אפוקסי.

המשך לשתק סטרפטווידין או נויט טראווין ולהוסיף מולקולות ביולוגיות ביוטיניות להדמיה של מולקולה בודדת כמתואר בפרוטוקול הטקסט, אם פני השטח בוצעו בהצלחה, ישנם פחות מ-10 חלבונים שאינם נספגים במיוחד לכל אזור הדמיה שנצפה. כאשר מתווסף לתא, חלבון אחד עד 10 ננו-מולרי המסומן באופן פלואורסצנטי, כאשר אחד משלבי הניקוי או התגובה לא בוצע כראוי, מספר החלבונים שאינם נספגים באופן ספציפי גדל משמעותית. לדוגמה, אם מדלגים על תחריט הפיראנה, נצפתה ספיגה לא ספציפית פי 100

האופי העליון של הפגילציה הכפולה מוצג כאן באופן בולט. אותות הרקע ממולקולות פלואורסצנטיות ותמיסה נצפו חלשים בהרבה כאשר נעשה שימוש בפגילציה כפולה כפי שמוצג בפאנל השמאלי. זה מצביע על כך שחלבונים נדחים בצורה יעילה יותר על ידי שכבת הפגיליזציה הכפולה.

לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. אל תשכח שעבודה עם AYA יכולה להיות אמצעי זהירות מסוכנים ביותר כגון כפפות מתאימות, משקפי מגן וסינר יש לנקוט תמיד בעת ביצוע הליך זה.