פסיבציה משטח ללימודי חלבון מולקולה בודדת

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק משטח של פרוסת קוורץ באיכות גבוהה. דבר זה מושג תחילה על ידי ניקוי של פרוסות קוורץ ומכסיים עם מים ואצטון. לאחר מכן, הפרוסה נחריטה באמצעות פוטסיום הידרוקסיד ותמיסת פיראנה כדי לשפר את איכות המשטח.

בשלב הבא, הזכוכיות ומכסי הזכוכית עוברים פונקציונליזציה באמצעות קבוצות אמין, ולאחר מכן שני סבבים של פסיבציה של הפנימה באמצעות פולימר כדי להפוך את פני השטח של הזכוכית לאינרטיים. השלב הסופי הוא הרכבת תא המיקרופלואידיקה מהזכוכית וממכסה הזכוכית, כאשר המשטחים המצופים ב-polyethylene glycol או המפגילציונלים (pegylated) פונים זה לזה. בסופו של דבר, אסטרטגיה חדשה של טיפול בפני השטח באמצעות מולקולות peg לאורך שני סבבים משפרת באופן ניכר את איכות הפסיבציה, כפי שנצפה במיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון ציפוי פולימרי לאחר תקיצה בתחמוצת אשלגן, הוא שטכניקה זו מבטיחה איכות מעולה. אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להתקשות בביצועה, שכן יש לבצע מספר טיפולי שירות. כדי להתחיל את הקידוח, יש להשתמש בשבבי קוורץ כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.

נקו את העגיות על ידי הנחתן בתוך צנצנת צביעה מזכוכית. בדרך כלל ניתן להניח בין חמש ל-15 עגיות בצנצנת אחת. לאחר מכן, שטפו את העגיות במי UE; חזרו על השטיפה שלוש פעמים, בצעו סוניקציה לעגיות במי UE למשך חמש דקות כדי להסיר לכלוך, השליכו את המים ושטפו את העגיות שלוש פעמים נוספות במי UE.

בשלב הבא, החליפו את מי ה-UE באצטון ובצעו סוניקציה לשקיות עם אצטון למשך 20 דקות או יותר, השליכו את האצטון ושטפו את השקיות במי Milli Q כדי להסיר שאריות אצטון. לאחר מכן, החליפו את המים בקוהידרוקסיד של האש בריכוז one molar ובצעו סוניקציה לשקיות למשך 20 דקות או יותר. תסריט יתר (etching) ישפר את איכות הפני השטח, אך יגרום לשריטות שעלולות להפריע לדימות פלואורסצנטי.

שטפו את השקופיות במים מזוקקים (Milli Q) שלוש פעמים כדי להסיר שאריות של אשלגן הידרוקסיד לפני ביצוע תכשיט פיראנה (piranha etching). העבירו את השקופיות למחזיק שקופיות מסוג Duran או למחזיק טפלון בהתאמה אישית, והניחו אותן בבכרור של לטר אחד הממוקם במנדף כימי. מלאו את הבכרור ב-450 milliliters של חומצה גופרתית.

לאחר מכן, הוסיפו 150 milliliters של מי חמצן כדי להגיע ליחס של שלושה לאחד בין חומצה גופרית למי חמצן. ערבבו את התמיסה כדי להבטיח ערבוב נאות והשאירו את הכלי ללא הפרעה למשך 20 דקות. הוציאו את השקופיות מתמיסת הפיראנה והניחו אותן במחזיק שקופיות המכיל millieu water.

בינתיים, יש להשליך את תמיסת הפירנחה לבקבוק פסולת ייעודי. לאחר שהשקופיות יגיעו לטמפרטורת החדר, שטוף אותן שלוש פעמים ב-UE water בהתאם לנוהל ניקוי לוחות כיסוי. החלף את ה-UE water בכלי הצביעה במתנול. השאר את השקופיות ואת לוחות הכיסוי במתנול.

במקביל, הכין את תמיסת האיסולציה של האמינו על ידי מזיגת 100 milliliters של methanol לתוך הבקבוק. לאחר מכן, הוסף five milliliters של acetic acid ושלושה milliliters של three amino propyl, trimethyl, וערבב בעדינות על ידי ניעור. החלף את ה-methanol בצלחות הצביעה המכילות את השקופיות ואת כיסויי הזכוכית בתערובת התגובה של ה-amino siloization.

דגרו למשך 20 עד 30 דקות, ובמהלך הדגירה בצעו סוניקציה אחת למשך דקה אחת. לאחר מכן, החליפו את תגובת האיסולציה של האמינו במתנול. לאחר מכן השליכו את המתנול והוסיפו תמיסת מתנול רעננה.

חזור על הליך זה שלוש פעמים עבור הסבב הראשון של פונקציונליזציה של הפנין באמצעות פולימר. ייבש את הזכוכיות ואת כיסויי הזכוכית באמצעות גז חנקן. לאחר מכן, הנח אותם בקופסאות פיפטות נקיות הממולאות בחלקן במי milli Q, באופן שבו הצד המיועד לפגילציה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הוסף 64 µL של תמיסת ריאקציה שהוכנה טרייה לתמיסת peg מוכנה.

בצעו פיפטור של התערובת למעלה ולמטה כדי להמיס אותה לחלוטין. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-16,100 G למשך דקה אחת. כדי להסיר בועות אוויר, טפטפו 70 µL של תערובת הפגילציה על עלית קוורץ יבשה.

הנח בעדינות זכוכית כיסוי יבשה מעל התמיסה, והדגר את השקופיות בסביבה חשוכה ולחה למשך שעתיים ועד ללילה כדי לאחסן את השקופיות וזכוכיות הכיסוי שעברו פגילציה. פרק בזהירות את השקופית ואת זכוכית הכיסוי על ידי החלקת זכוכית הכיסוי הצידה ושטיפתן במים מזוקקים (UE water) לפני ייבושן בגז חנקן. הנח זוג של שקופית וזכוכית כיסוי בתוך מבחנה של 50 milliliters כך שהמשטחים שעברו פגילציה פונים לכיוונים מנוגדים.

סגרו חלקית את המבחנה ובצעו ריקון (vacuum) לפני מילויה בגז חנקן והברגת המכסה בצורה הדוקה. אחסנו אותה בטמפרטורה של 20- °C. שלבים אלו מסייעים בשימור המשטח הפגילטורי למשך תקופה ממושכת.

בצע סבב שני של פגילציה (pegylation) כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט מיד לפני השימוש בשקופית להרכבת תא מיקרופלואידי. הנח שקופית קוורץ על משטח שטוח כאשר הצד שעבר פגילציה פונה כלפי מעלה. צור תעלה באלכסון על פני השטח שעברו פגילציה על ידי הצמדת סרט דבק דו-צדדי על השקופית.

ודאו שהחורים ממוקמים במרכז התעלה. לאחר מכן, הניחו בעדינות כיסוי זכוכית (cover slip) פגילאציה (pegylated) בחלק העליון להשלמת התא, כאשר הצד שעבר פגילאציה פונה כלפי מטה.

אטמו את התא על ידי לחיצת זכוכית הכיסוי מעל האזורים שבהם ממוקם הסרט דו-הדבקי. בצעו זאת בעדינות אך ביסודיות, כך שהתא יהיה אטום למים. לבסוף, סגרו את קצוות התא באמצעות דבק אפוקסי.

המשיכו לקיבוע של streptavidin או neutravidin והוסיפו מולקולות ביולוגיות הביוטיניליות לצורך דימוי של מולקולה בודדת כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב; אם הטיפול במשטח בוצע בהצלחה, ייראו פחות מ-10 חלבונים שנספגו באופן לא ספציפי לכל אזור דימוי שנצפה. כאשר מוסיפים לתא חלבון מסומן פלואורסצנטית בריכוז של 1 עד 10 nanomolar, במידה ואחד משלבי הניקוי או התגובה לא בוצע כראוי, מספר החלבונים שנספגו באופן לא ספציפי עולה באופן משמעותי. לדוגמה, אם מדלגים על תהליך התקיפה ב-piranha, נצפה ספיחה לא ספציפית גבוהה פי 100.

היתרון של הפגילציה הכפולה מודגם כאן בבירור. נצפה כי אותי הרקע מהמולקולות הפלואורסצנטיות ומהתמיסה היו חלשים הרבה יותר כאשר נעשה שימוש בפגילציה כפולה, כפי שמוצג בפאנל השמאלי. דבר זה מעיד על כך שחלבונים נדחים באופן יעיל יותר על ידי השכבה שעברה פגילציה כפולה.

לאחר שהטכניקה תשלט, ניתן לבצעה בארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. זכרו כי עבודה עם AYA עלולה להיות מסוכנת ביותר; יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון כפפות מתאימות, משקפי מגן וסינר בעת ביצוע הליך זה.