תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר
10 בספטמבר 2013
פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד את התכונות הסינפטיות והריגוש של דגי זברה עובריים בפה התאים שלהם. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של עובר דג הזברה כדי לחשוף את פני הגחון של המוח האחורי. השלב השני הוא למקם את התכשיר המנותח על השלב של מיקרוסקופ מהדק טלאי, ולזהות את הפה בתאים שלהם.
התיקון הבא. הדק על תאי M באמצעות מצב ההקלטה המתאים ורשום פעילות סינפטית ומאפייני ריגוש. השלב האחרון הוא ניתוח הנתונים המוקלטים כדי לברר תכונות סינפטיות או ריגוש.
בסופו של דבר, הידוק טלאים מתאים אלה משמש להצגת התכונות של קולטנים סינפטיים באורגניזם מתפתח. בדרך כלל, לאנשים חדשים בשיטה זו יהיו שני תחומי קושי עיקריים. הראשון הוא הנתיחה.
המבנה השני של סצנת ההופעות יכול להיות מאתגר. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כשהחלטתי לעבוד על תכשיר דג זברה שבו המוח האחורי מחובר לחוט השדרה, מה שמדגים את ההליך יהיה בוראם רוי, דוקטורנט לתואר שני במעבדה שלי, התחל את ההליך הזה על ידי הכנת צלחת הניתוח המרופדת בסארד. ראשית, תקן את הדסקיות למגלשה עם שומן.
לאחר מכן הוסף זרוע נוזלית למרכז מכונת הכביסה. הסארד בדרך כלל מתרפא בן לילה ויוצר מיטה עגולה קטנה על מגלשת הזכוכית, שהופכת לבסיס צלחת הניתוח. לאחר הנחת פתק כיסוי על המגלשה, הנח את המגלשה בתא ההקלטה כדי לשמש כבסיס לדיסקציה.
לאחר מכן, הכינו את הפתרונות הנדרשים. יש להשאיר את התמיסות החוץ-תאיות בטמפרטורת החדר ואילו את הפתרונות התוך-תאיים יש לשמור על סטריליות. ניתן גם להוסיף 0.1% רופף לצהוב לתמיסה התוך-תאית, כך שניתן יהיה לבצע הדמיה של מורפולוגיה של תאי M בסוף הניסוי כדי לאשר את זהות התא.
לאחר מכן, יש לגדל את עוברי דגי הזברה מסוג בר במי ביצים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס ולאסוף ולשלב על פי הפרסום הקודם. לצורך דיסקציה, העבירו את העוברים לצלחת החיתוך המשמשת גם כתא ההקלטה. לאחר מכן הרדימו אותם למשך שבע עד 10 דקות.
בתמיסת מלח הרדמה המתקרבת מאוד למי מלח פיזיולוגיים, ניתן לקבוע אם הם מורדמים כראוי על ידי בחינת התגובה לצביטה עדינה בזנב. לאחר מכן, הצמד את העוברים דרך ה-no accord ואל צלחת קו ההגנה של SIL עם חוט טונגסטן בגודל 0.001 אינץ' תחת מיקרוסקופ מנתח עם הגדלה של פי 25. כוונן את ההגדלה בטווח החיתוך ל-40 עד 50 x כדי לבצע את החיתוך.
כעת, הסר את הלסת, העיניים והמוח הקדמי באמצעות זוג מלקחיים עדינים. קלף בעדינות את המוח האחורי הרחק מחוט הצומת הבסיסי על ידי עבודה זהירה של המלקחיים בין חוט הצומת למוח. לאחר מכן הפוך בעדינות את המוח האחורי כך שמשטח הגחון יפנה כלפי מעלה.
מיקום זה מספק גישה טובה לתאי M, הנמצאים בדרך כלל בטווח של 5 עד 10 מיקרומטר משטח הגחון בעוברים צעירים ו-20 עד 50 מיקרומטר בזחלים מבוגרים. לאחר מכן, העבר בזהירות את ההכנה להגדרת ההקלטה שבה ניתן לבצע את ניסוי מהדק התיקון. תאי M מוצגים עם ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות, אם כי ניתן להשתמש גם באופני הדמיה אחרים כדי להתכונן להידוק טלאי.
התחל במשיכת כמה פיפטות CLA טלאי עם זכוכית סיליקט בו דקת דופן. במשיכה אופקית קוטר קצה הפיפטה הוא כ-0.2 עד 0.4 מיקרומטר לאחר ליטוש אש לקצה חלק, ואורך השוק המתחדד הוא כארבעה מילימטרים. מלאו את קצה הפיפטה בתמיסה תוך-תאית על ידי טבילת הקצה בנוזל התוך תאי.
לאחר מכן הכנס מחט מזרק לתוך הפיפטה והוציא בעדינות את התמיסה התוך תאית מהמזרק. כדי לסיים את מילוי הפיפטה, חבר את הפיפטה לשלב ראש המגבר במערך האלקטרופיזיולוגיה, חשוב לשמור על שלב הראש בזווית של כ-45 מעלות לציר האופקי מכיוון שהדבר מבטיח זווית כניסה לפיפטה המתאימה להיווצרות אטמים עמידים במיוחד עם הפה בתא שלהם ממש לפני שהפיפטה יורדת לתמיסת האמבטיה, הפעל כמות קטנה של לחץ חיובי על הפיפטה כדי להפחית את הסיכוי לחסימת הקצה. המשך להתקרב לתא M עם כמות קטנה של לחץ חיובי בפיפטה.
הלחץ החיובי דוחף בעדינות את התא מצד לצד, וכאשר הוא ממוקם מיד מעל התא יוצר גומה קטנה על קרום התא. כעת השאירו את הפיפטה במקומה למשך מספר שניות כדי לנקות בעדינות את פני התא כך שניתן יהיה ליצור אטימה חזקה בין הפיפטה לקרום. לאחר מכן שחרר את הלחץ החיובי בפיפטה כדי להפעיל את האיטום.
כמות קטנה של לחץ שלילי יחד עם פוטנציאל פיפטה שלילי מביאה להיווצרות אטמי ג'יגה תוך מספר שניות. לאחר מכן, שנה את פוטנציאל ההחזקה במגבר למינוס 60 מילי-וולט. קרע את קרום התא בסדרה של פולסים קצרים של יניקה.
לאחר מכן רשום מיד את פוטנציאל הממברנה ומזער את חפצי הקיבול. לפצות על קיבול התא והתנגדות הגישה ב-70 עד 85% יש לנטר את התנגדות הגישה כל 30 שניות עד דקה, ואם יש שינוי של 20% או יותר, לבטל את הניסוי. לאחר שהניסוי הסתיים ונרכשו מספיק נתונים, הקריבו את העובר על ידי הסרת המוח האחורי בעזרת זוג מלקחיים.
איור זה מציג את ההקלטות המייצגות של זרמי קולטני A MPA ו-NMDA מעוררים שהתקבלו מ-48 עוברי HPF. להלן ה- PSCs הספונטניים של A MPA ME שנרשמו מתא M בפוטנציאל החזקה של מינוס 60 מילי-וולט. וזה ה-PSCs הממוצעים של ME.
להלן ה-PSCs הספונטניים A MPA ו-NMDA me שנרשמו מתא M בפוטנציאל החזקה של 40 מילי-וולט. וזה ממוצע ME PSCs גלוטמט ME PSCs תועדו בנוכחות TTX מיקרומולרי אחד כדי לחסום פוטנציאל פעולה של חמישה מיקרומולרים מחמירים תשע ו-100 מיקרומולרי ריטוקסין לחסימת התרחשות גליצין ו-G. להלן ה-MI PSCs הספונטניים שנרשמו מתא M בפוטנציאל החזקה של מינוס 60 מילי-וולט.
וה-MI PSCs הממוצעים של MI PSCs תועדו בנוכחות TTX מיקרו-מולרי אחד כדי לחסום פוטנציאל פעולה. חומצה כימרית מילי-מולרית אחת לחסימת פעילות קולטני גלוטמט ו-10 מיקרו-מולרית על ידי צ'ינג לחסימת התרחשות GABA. אלו הם פוטנציאל הפעולה שנרשמו מתא M בתא הספציפי הזה.
גירוי סף SRA של 0.48 ננו אמפר עורר מספר פוטנציאל פעולה, אך גירוי לסף מביא רק לייצור פוטנציאל פעולה יחיד. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתקן רשומת מהדק מתאי M ונוירונים אחרים בעמוד השדרה הרשתית בעוברי דג הזברה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה להקלטת פעילות חשמלית מנוירוני מאותנר (Mauthner neurons) וממספר תאי רשת-ספיינל (reticulospinal cells) בעוברים של דג זברה, באמצעות הכנה של מוח וחבל שדרה שלמים. הטכניקה מאפשרת ניתוח של זרמים סינפטיים, פעילות של תעלות תלויות-מתח ופוטנציאלי פעולה בנוירונים בשלבי התפתחותם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- עוברים של דגי זברה הם בעלי ערך רב לחקר ההתפתחות הנוירונלית.
- נוירוני מאותנר (Mauthner neurons) ממלאים תפקיד קריטי בתגובת המילוט.
- טכניקות patch clamp חיוניות לחקירת תכונות סינפטיות.
- הבנת הפעילות הסינפטית חיונית להשגת תובנות על מעגלים עצביים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה אמינה לתיעוד פעילות עצבית בעוברים של דגי זברה.
- בדיקת זרמים סינפטיים מעוררים ומעכבים בנוירונים מרכזיים.
- ניתוח תכונותיהם של רצפטורים סינפטיים במהלך ההתפתחות העוברית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח של עוברי zebrafish כדי לחשוף את המוח האחורי.
- שימוש במיקרוסקופיית patch clamp להקלטה מנוירוני Mauthner.
- שימוש בתמיסות ספציפיות עבור הסביבות התוך-תאיות והחוץ-תאיות.
- ניתוח נתונים לקביעת תכונות סינפטיות ותכונות עירור.
תוצאות עיקריות
- הקלטות מוצלחות של זרמים סינפטיים מעוררים ומעכבים.
- אפיון של פעילות תעלות תלויות-מתח בנוירונים בהתפתחות.
- זיהוי תכונות של רצפטורים סינפטיים בעוברים של דגי זברפיש.
- הדגמת יעילות השיטה למחקרים אלקטרופיזיולוגיים עתידיים.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה לחקר פעילות נוירונלית בעוברים של זב נהר (zebrafish).
- התובנות שיתקבלו עשויות לשפר את ההבנה של ההתפתחות העצבית.
- גישה זו עשויה להקל על מחקרים עתידיים של מנגנונים סינפטיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקלטת Patch clamp מתאי Mauthner של דגי זברה עובריים מאפשרת מדידה ישירה של תפקוד קולטנים סינפטיים במערכת עצבים של חרפתני בשלב ההתפתחות. גישה זו תומכת בתיקוף יעדים (target validation) על ידי אספקת נתונים כמותיים על תמסורת עצבית מעוררת ומעכבת במהלך חלונות קריטיים של התפתחות נוירולוגית. הכנה של מוח וחבל שדרה שלם משמרת את המעגלים המקוריים, ובכך מגבירה את רמת הוודאות החזויה במחקרים מכניסטיים של פלסטיות סינפטית ופרמקולוגיה של קולטנים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידה של זרמים עירורי המתווכים על ידי AMPA ו-NMDA וזרמים מעכבים המתווכים על ידי GABA/glycine בתאי Mauthner בשלבי התפתחות.
- ערך תפעולי: מתן אפשרות להפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תיקוף פונקציונלי של ביטוי ופעילות רצפטורים סינפטיים בהקשר תאי טבעי.
- ערך מדעי: תמיכה בביטחון ניבוי על ידי מעקב אחר התפתחות סינפטית ברמת התא הבודד על פני דגימות שונות, ובכך הפחתת השונות בפרשנויות מכניסטיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור שלבי עבודה המשכיים, על ידי קביעת ערכי בסיס לאמפליטודות וקינטיקה של זרמים סינפטיים בנוירונים עובריים.
- ערך תפעולי: טיפול בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובשחזוריות באמצעות פרוטוקולים עקביים של דיסקציה, הקלטה ואנליזה השומרים על קשרים סינפטיים תפקודיים.
- ערך מדעי: הדגשת המוכנות לסריקה ויכולת שימוש חוזר בפלטפורמה, על ידי מתן אפשרות לחזור לאותו סוג תא (Mauthner cell) במגוון דגימות לצורך מחקרי התפתחות סינפטית לאורכית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דיון ברלוונטיות למחלה ובסנכרון עם ביומרקרים תרגומיים, על ידי קישור מדידות זרם סינפטי לתהליכים של התפתחות עצבית הרלוונטיים למודלים של הפרעות נוירולוגיות.
- ערך תפעולי: תיאור הרצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות שימוש בעוברים של דגי זברפיש כמערכת רלוונטית למחלה עבור מחקרי מעורבות של מטרות (target engagement) בשלבים מוקדמים.
- ערך מדעי: התמקדות בערך של הפחתת סיכונים חזויה, באמצעות אפיון פעילות של תעלים תלויים-מתח ותכונות של קולטנים סינפטיים, המנחים סריקת תרכובות מבוססת-מנגנון.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, משלב הגילוי המוקדם ועד לזיהוי מוביל (Lead Identification), באמצעות אספקת מדדים אלקטרופיזיולוגיים המעניקים מידע על מעורבות המטרה (target engagement) ומנגנון הפעולה במערכות עצביות בשלבי התפתחות.
- ביולוגיה של תגליות: הסבירו כיצד השיטה תומכת בבדיקת היפותזות, הבהרת מסלולים או הפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי תיעוד תכונות סינפטיות ותכונות עירור של תאי Mauthner בתוך הכנה שלבמוח האחורי והחוט השדרה בשלמותם.
- סריקה: תארו את המוכנות של הבדיקה, את השחזוריות או את התוצאים הכמותיים, ככל שהמאמר תומך בכך, באמצעות מדידה של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ומעכבים, ספונטניים ומעוררים, תחת בידוד פרמקולוגי.
- אנליטיקה: הדגישו מדידות, קריאות או תוצרי סטטיסטיקה המסייעים לצוותים להשוות בין תנאים באמצעות ניתוח פוטנציאלי ממבנה, קיבול, התנגדות גישה, ואמפליטודות וקינטיקה של זרמים סינפטיים.
- מחקר תרגומי: קשרו את השיטה לרצף פרה-קליני או להתאמה של סמני ביולוגיים רק כאשר המקור תומך בכך, על ידי מתן אפשרות למחקר של התפתחות סינפטית במודל של בעלי חוליות בעל רלוונטיות להתפתחות עצבית אנושית.
- שימוש חוזר ארגוני: הגדירו את השיטה כבסיס ליכולת הניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, על ידי הדגשת היכולת לחזור לאותה הכנה של סוג תאי (תאי Mauthner) לאחר ההכנה לצורך ניתוח אורך עקבי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזואי, תיקוף מטרות, והפחתת עמימות מכניסטית בתפקוד קולטנים סינפטיים במהלך ההתפתחות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות שלבי ניתוח, הקלטה ואנליזה מוגדרים השומרים על קשרים סינפטיים שלמים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים, על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של השפעות תרכובות על עירור נוירונלי והעברה סינפטית בשלב ההתפתחות.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף וקבלת החלטות קידום מותאמות לסיכון, באמצעות נתונים כמותיים של זרמים סינפטיים המפחיתים את הסיכון במטרות המעורבות במסלולים של התפתחות נוירולוגית.
שיקולי יישום
- מומחיות מדעית נדרשת בנוירו-דיסקציה (ניתוח עצבי), אלקטרופיזיולוגיה בשיטת patch clamp ובידוד פרמקולוגי של זרמים סינפטיים.
- צרכי תשתית אנליטית וציוד, כולל מיקרוסקופ patch clamp, מגבר, מערכת פרפוזיה ואופטיקה של ניגודיות התערבות דיפרנציאלית (DIC).
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור שלבי התפתחות העוברים, טכניקת הדיסקציה וקריטריונים ליצירת seal, כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים בין הניסויים.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל עקב הבדלים בגודל הנוירונים, בנגישות להם ובהרכב הסינפטי בין דגי zebrafish עובריים לבין מנתחים של חולייתנים אחרים.
- מגבלות מעשיות המגובות בחומר המקור, כולל האתגר הטכני של הדיסקציה ויצירת gigaseal, במיוחד עבור חוקרים שאינם בקיאים בשיטה.
