לוקליזציה וכימות יחסית של פחמן בתאים עם Multispectral הדמיה תזרים cytometry

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לספק שיטה ננו-מטרולוגית לניטור וכימות הספיגה התאית של ננו-צינורות פחמן במספר תאים רלוונטי סטטיסטית. זה מושג על ידי טיפול ראשון בתאים בננו-צינורות פחמן הניתנים לפיזור מים, הנכנסים לתאים באופן תלוי ריכוז. ננו-צינורות פחמן אלה מסומנים בסופו של דבר בסמן פלואורסצנטי.

לאחר הקיבוע, כל תא מצולם בשדה הבהיר, בשדה הכהה ובתעלות פלואורסצנטיות של זרימת הדמיה רב-ספקטרלית. ציטומטר. כדי לדמיין את התפלגות ננו-צינורות הפחמן ואת רמת ספיגת האור, האור המפוזר והפלואורסצנטי, תיוג צינורות הננו משרה בכל תא על בסיס פיקסל אחר פיקסל. בסופו של דבר, ספיגת האור הפנימית ופיזור בתוך התאים מאפשרת לוקליזציה וכימות של ננו-צינורות הפחמן.

כך ששיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות חדשות בתחומי הננו-טוקסיקולוגיה והננו-רפואה, כגון ההשפעה והגורל של חומרים מבוססי פחמן בתאים חיים, וגם פוטנציאל הפוטנציאל של ננו-צינורות פחמן כמערכת העברת תרופות התחל על ידי פיזור ננו-צינורות הפחמן המחוברים בסופו של דבר לתווית פלואורסצנטית במי תרבית תאים. לאחר מכן סוניקט את הננו-צינורות בסוניקט מי אמבטיה ב-20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, יש לדלל את הננו-צינוריות בריכוזים של 0, 10, 20 ו-50 מיקרוגרם למיליליטר במדיום שלם, ולאחר מכן לדגור שני מיליליטר מכל דילול עם התאים המעניינים בצלחת של 1 25 סנטימטר רבוע לכל דילול ב-37 מעלות צלזיוס לאחר 20 שעות, להסיר את מדיום הדגירה מכל צלחת ולשטוף את התאים המסומנים בצינור ננו פחמן עם PBS.

לאחר הכביסה, טריפסין מסתכל על התאים בכל צלחת ולאחר מכן משהה אותם מחדש במדיום DMEM מלא. לאחר מכן, העבירו כל דגימה לצינורות בז בודדים של 15 מיליליטר, ולאחר מכן סובבו את התאים למשך חמש דקות ב-200 פעמים G וטמפרטורת החדר. השעו מחדש כל כדור ב-4% פרה-פורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר הקיבוע, סובב את התאים שוב כלפי מטה והשהה מחדש כל דגימה גלולה ב-15 כפול 10 עד התאים החמישיים ב-150 מיקרוליטר של PBS. לאחר מכן סנן את הדגימות דרך מסננות רשת בודדות של 50 מיקרון כדי לקבל תמונות של התאים עם זרם תמונה. ציטומטר זרימת הדמיה רב-ספקטרלית.

ראשית, בחר הגדלה מותאמת ולאחר מכן דוגמאות תמונה מעניינות. השתמש בלייזר של 685 ננומטר כדי לצלם שדה כהה ולהגדיר את ציטומטר הזרימה. ערוץ מספר שש לאיסוף פליטת השדה האפל במעבר פס של 745 עד 800 ננומטר.

דמיין את הדגימות בערוצי השדה הבהיר מספר אחד ומספר שש לניתוח תמונה. ראשית, צור תרשים נקודות לפי פרמטרי עם יחס גובה-רוחב לפי גובה לעומת שטח התא. זה מאפשר להבחין בין התאים הבודדים שיש להם שטח סטנדרטי ויחס גובה-רוחב קרוב לאחד מהאירועים הרב-תאיים, שיש להם שטח גדול ויחס גובה-רוחב קטן, והפסולת שמציגה שטח קטן במיוחד.

לאחר השימוש בתמונות התאים כדי לוודא שהתאים הבודדים נבחרו כהלכה, הגדר עלילת נקודות דו-פרמטרית עבור תאים עם תווית ננו צינור פחמן עם ניגודיות גבוהה על ידי התוויית הניגודיות כנגד שיפוע השורש הממוצע הריבועי כדי לאפשר אי הכללה של השורש הנמוך, שיפוע ריבועי ממוצע, תאים לא ממוקדים בניגודיות נמוכה ובחירת התאים במישור הממוקד. לאחר מכן, השתמש בכלי איתור התכונה הטובה ביותר כדי לקבוע את הפרמטר המספק את ההפרדה הסטטיסטית הטובה ביותר בין התאים המסומנים לתאים שאינם מסומנים. לדוגמה, עבור ניסוי מייצג זה, תכונת אובייקט הפיקסל הממוצע היא המתאימה ביותר.

לאחר מכן שרטט פרמטר זה כנגד התדר המנורמל כדי לעקוב אחר היסטוגרמה לכימות הננו-צינוריות שנקלטו על ידי התאים בכל ריכוז ניסוי. כעת שרטט גרף דו-פרמטרי עבור אובייקט הפיקסל הממוצע בשדה בהיר לעומת העוצמה בשדה כהה. כדי לבדוק את המתאם בין שני הפרמטרים הללו, כימות צינורות ננו מוערך גם באמצעות יצירה על תמונות התא כאשר ננו-צינורות הפחמן מופיעים ככתמים כהים עזים בערוץ Brightfield, בחר טווח מוגבל של פיקסלים בעוצמה נמוכה, למשל, בין אפס ל-533 כדי ליצור את מסכת הסף, כזו שמתאימה בדיוק לננו-צינוריות הכהות כדי ליצור מסכה שנייה מסמלה שתיים להמחשת הננו-צינוריות שנראות בהירות בערוץ השדה האפל.

בחר טווח פיקסלים בעוצמה גבוהה. לדוגמה, טווח של 150 עד 4, 095 נבחר לניסוי זה. לאחר מכן השתמשו באזור ממסכת השדה הבהיר אחת או ממסכת השדה האפל שתיים, הגדירו תרשים נקודות כדי לכמת את ההפנמה היחסית של הננו-צינורות.

לדוגמה, שרטט את האזור בערוץ שש המתאים לשדה הכהה עם מסכה שתיים כנגד האזור בערוץ הראשון, המתאים לשדה הבהיר עם מסכה אחת. לאחר קביעת המתאם הליניארי בין מסכה אחת למסכה שתיים, דמיין את הננו-צינורות בתוך הציטופלזמה על ידי יצירת מסכה של התא כולו ולאחר מכן שחק את המסכה. כעת מסומן לשחוק M 0 1 7 על שבעה פיקסלים כדי לראות את פנים התא.

כדי לדמיין את ננו-צינורות הפחמן בתוך קרום התא, השתמש במשוואה הבוליאנית M אפס אחד ולא לשחוק את M 0 1 7. זוהי המסכה של התא כולו, שהופחתה מהחלק הפנימי של התא כדי ליצור מסכה של הממברנה רק כדי להעריך את הפיקסלים הכהים על הממברנה. מרחו את מסכת השדה הבהיר אחת על מסכת הממברנה.

החל את כל המסיכות הללו על תאים מרובים בו-זמנית כדי לאשר הבחנה בין הדגימות המסומנות לדגימות הלא מסומנות. לאחר מכן בחר את הפיקסלים השחורים על הממברנה עם כלי אזור התכונה כדי לכמת את ננו-צינורות הפחמן על קרום התא. לבסוף, להבחין בין ננו-צינורות הפחמן שהופנמו מאלה שנספגו על הממברנה.

עלילה, האזור השחור של הממברנה כנגד האזור השחור של התא כולו. לאחר שכל העלילות נוצרו עבור תנאי ניסוי אחד, צור תבנית דוח סטטיסטי. שמור את התבנית כקובץ A ST ואצווה את כל קבצי הנתונים.

מכשיר זרם התמונה מייצר מספר תמונות ברזולוציה גבוהה של כל תא בציטומטר הזרימה, כולל תעלות שדה בהיר, שדה כהה ופלואורסצנטי, כפי שמודגם כאן עם שלושה תאים שונים המסומנים בצינורות ננו. שכבות-העל של ערוצים אלה מוצגות גם כן. נוכחותם של ננו-צינורות פחמן גורמת לשינויים הן בניגודיות והן בשיפוע של תאים מסומנים בהשוואה לתאים ללא תווית.

לפיכך, יצירת עלילת נקודות דו-פרמטרית חשובה לבחירת תאי המיקוד. ניתן להבחין בין תאים לא ממוקדים בצהוב על ידי הניגודיות הנמוכה שלהם והשיפוע הריבועי הממוצע הנמוך שלהם ללא קשר לנוכחות או היעדר תיוג צינורות ננו. תאי מיקוד לא מסומנים מציגים גם ניגודיות נמוכה, אך מפגינים שורש גבוה, שיפוע ריבועי ממוצע כאשר תאי המיקוד מסומנים בננו-צינורות, עם זאת, התאים מפגינים פרופיל שיפוע ריבועי ממוצע בעל ניגודיות גבוהה, שורש נמוך.

ניתן להבחין בקלות בננו-צינורות פחמן מופנמים, במיוחד בערוץ ברייטפילד, שם הם מופיעים ככתמים כהים עזים, ששטחיהם גדלים עם ריכוז הננו-צינורות. כאשר מנתחים את אותות הפיקסלים הממוצעים של תמונות השדה הבהיר, ניתן לקבוע כימות יחסי של קליטת צינור הננו. לדוגמה, היסטוגרמות אלו מדגימות את העלייה המשמעותית בספיגת צינורות ננו המתרחשת עם כל עלייה בריכוז תיוג צינור הננו, כפי שמודגם כימות ננו שפופרת פחמן אפשרי גם באמצעות שימוש במסכות המיושמות על טווח מוגבל של פיקסלים כהים בתוך תמונת שדה בהיר, או בתוך הפיקסלים בעוצמה גבוהה בתוך השדה הכהה, המתאים לאזורים שבהם הננו-צינוריות נמצאות.

שרטוט השטח של המסכות הללו מאפשר כימות נוסף של ספיגת ננו שפופרת פחמן. בנוסף, ניתן להעריך את המתאם בין הכתמים בתמונות השדה הבהיר והכהה על ידי התוויית עוצמת השדה הכהה לעומת אות הפיקסלים הממוצע של השדה הבהיר, או על ידי התוויית שטח המסכה בתוך השדה הבהיר לעומת האזור בתוך השדה האפל. בשני האיורים הבאים מוצגים ניתוחים של ננו-צינורות הפחמן הממוקמים בתוך פנים התא.

התמונות הראשונות הללו מדגימות את המסכות השונות שנוצרו. שים לב שיש לבדוק באופן חזותי את החוסן של מסיכות הלוקליזציה בהתבסס על השחיקה של מסיכת התא המוגדרת כברירת מחדל באוסף התאים המסומנים בתווית וללא תווית. כפי שהודגם זה עתה בתרשים הנקודות הללו, השטח הכולל של הכתמים השחורים על קרום התא לעומת זה של התא כולו תווים כדי לקבוע את ציון ההפנמה.

עבור תאים שהודגרו במשך 20 שעות ב-37 מעלות צלזיוס לעומת תאים שהודגרו במשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס ב-4 מעלות צלזיוס, ננו-צינורות הפחמן נמצאים ברובם על הממברנה, ואילו ב-37 מעלות צלזיוס, ננו-צינורות הפחמן מופנמים ביותר מ-90% מהתאים. פלואורסצנציה של צינור ננו פחמן אינה אינדיקטור טוב להפנמת צינור ננו פחמן עקב מתאם נמוך מדי בין הכתמים הפלואורסצנטיים לכתמים בתוך ערוצי השדה הבהיר והכהה. ואכן, המתאם בין עוצמת הפיצי לפיקסל הממוצע של השדה הבהיר מצביע על מקדם מתאם פירסון של מינוס 0.2.

כפי שמודגם בתמונות אלה, האות הפלואורסצנטי אינו תואם באופן אמין לכתמים השחורים של השדה הבהיר, ננו-צינורות פחמן, כליאה וצבירה בתוך ליזוזומים תוך-תאיים שכיבו חלקית את האות הפלואורסצנטי. לעומת זאת, ננו-צינורות מפוזרים עשויים לתת אות פלואורסצנטי אמין יותר לאחר פיתוחו. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הננוטכנולוגיה והננו-רפואה לחקור את האינטראקציה של תאים חיים עם ננו-חומרים מבוססי פחמן או כל ננו-חומרים בעלי יכולת ספיגה ופיזור חיים גבוהים בשיטת ציטומטריה סטטיסטית בתפוקה גבוהה.