מוות של תאים הקשורים מיטוזה חריגה נצפה על ידי ההדמיה Confocal בתאי סרטן חיים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את ההשפעה הציטוטוקסית של נגזרת הפילנטראן PJ 34 במהלך המיטוזה בתאי סרטן אנושיים מרובי מרכזים (multicenter somal). מטרה זו מושגת על ידי סימון הסנטרוזומים באמצעות GFP gamma tubulin והסומסומים באמצעות H two B read באמצעות טרנספקציה. מטרת הטרנספקציה היא לאפשר מעקב אחר נדידה והצטברות של סנטרוזומים וסידור של כרומוסומים במהלך המיטוזה בתאי סרטן חיים מרובי מרכזים.

כשלב שני, חלק מהתאים שעברו טרנספקציה נחשפו ל-PJ 34, מולקולה הפועלת כחומר לפינוי צנטרוזומים עודפים. לאחר מכן, תאי סרטן חיים שעברו טרנספקציה נסרקו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי ללכוד אירועים במהלך המיטוזה הקשורים לנדירת הצנטרוזומים והכרומוזומים. סידור מחדש או צבירה של תמונות רצופיות שהתקבלו מראים את השפעות הפינוי והציטוטוקסיות של הטיפול ב-PJ 34 בתאי סרטן במהלך המיטוזה, בהתבסס על דימות קונפוקלי של תאים חיים.

ההשלכות של טכניקה זו פונות לעבר טיפול ממוקד בסרטן שימגר באופן בלעדי תאי סרטן אוטוזומליים במהלך מיטוזה. את הטכניקה זו ידגימו השותפים שלנו, ד"ר Asher Castillo מהמרכז למחקר הסרטן במרכז הרפואי שיבא, וד"ר Leonid middleman מיחידת ההדמיה של בית הספר לרפואה סאקו באוניברסיטת תל אביב. כדי להכין תאי סרטן שד MDAMB 231 להדמיה קונפוקלית חיה, זרעו 2×10⁵ תאים בצלחות תרבית עם תחתית זכוכית מצופות Poly-D-Lysine בקוטר 35 מילימטר, ב-2 ליטר של מצע גידול מלא, והדגרימו ב-5% CO₂ בטמפרטורה של 37°C.

תרבית התאים מוכנה לטרנספקציה כאשר היא מגיעה למסף (confluence) של 60% עד 70%. התאים יעברו טרנספקציה עם שני פלסמידים, האחד מקודד ל-gamma tubulin, GFP לזיהוי פלואורסצנטי של סנטרוזומים, והשני מקודד ל-histone red לזיהוי פלואורסצנטי של כרומוזומים. הטרנספקציה תבוצע באמצעות ריאגנט הטרנספקציה הליפוזומלי jet PI, בהתאם לפרוטוקול היצרן. שטפו את התאים פעם אחת עם PBS ולאחר מכן החליפו את מצע התאים בשני מיליליטרים של DMEM חם ללא תוספות. הוסיפו בעדינות את תערובת הטרנספקציה לתאים ב-DMEM והחזירו את התאים לאינקובטור למשך שמונה שעות.

החליפו את ה-DMEM בשני מיליליטר של מצע מלא והדגירו את התאים באינקובטור למשך 24 שעות. לאחר הטרנספקציה, החליפו את המצע בשני מיליליטר של מצע מלא המכיל 20 micromolar PGA 34.

דגרו את התאים למשך 18 שעות נוספות לפני ביצוע דימות קונפוקאלי חי. להלן הפרמטרים הטכניים של הגדרות סורק הדימות הקונפוקאלי החי. מצב סריקה XYZT, חור סיכה (pinhole) airy 1.00, זום 3.5, רזולוציה של שמונה ביטים, לייזר DPSS 561 nanometers, לייזר ארגון נראה 488 nanometers, לייזר הליום-ניאון נראה 633 nanometers.

עדשה אובייקטיבית H-C-X-P-L-A-P-O-C-S בעוצמה של 63 פעמים, 1.40 Oil UV עם מפתח נומרי 1.4. מהירות סריקה של 700 hertz ומקדם שבירה של 1.52. העבירו את התאים לדימיון קונפוקאלי חי למשך 16 שעות לפחות בתא דימיון, תוך שמירה על התאים ב-5% carbon dioxide ובטמפרטורה של 37 °C.

את יעילות התעתוק (transfection) יבחנו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התחילו את הפרוצדורה על ידי זריעה של 2×10⁵ תאי MDA MB 231 בפלטה בעלת שישה בארות, כאשר בכל בארה כיסוכית אחת, ב-2 mL של מצע גידול מלא.

36 שעות לאחר הטרנספקציה. הסר את המצע מכל באער לאחר שטיפת התאים שעברו טרנספקציה ומוצמדים לכיסוי זכוכית (cover slip) באמצעות PBS. קבע את התאים על ידי דגירה בתמיסה קרה של מתנול ואצטון ביחס של אחד לאחד למשך שבע דקות בטמפרטורה של 20- °C.

לאחר שבע דקות, שאבו את תמיסת הקיבוע והניחו לזכוכית הכיסוי עם התאים המורכבים להתייבש במנדף כימי למשך 30 דקות. לאחר מכן, מרחו רכיב Prolonged Gold anti-fade עם DPI והניחו לזכוכית הכיסוי להתייבש בחושך למשך שש שעות. בחנו את השקף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וחשבו את אחוז התאים שעברו טרנספקציה עם אותות אדומים וירוקים.

מתוך כלל אוכלוסיית התאים, אחוז הטרנספקציה הרצוי הוא כ-20 עד 40% כאשר סופרים 100 עד 200 תאים. כדי להתחיל בהליך זה, זרקו 2×10⁵ תאי סרטן שד מדגם MDA-MB-231 על לבישי זכוכית בתוך פלטה בעלת שישה בארות ב-2 mL של מצע מלא. הוסיפו PJ 34 למצע והדגרימו את התאים למשך התקופה הנדרשת.

עם סיום תקופת הדגירה, שטפו את לוחות הכיסוי פעם אחת עם PBS וקבעו את התאים על ידי דגירה בתמיסה של מתנול ואצטון קרים (בטמפרטורת קרח) ביחס של אחד ለአחד למשך שבע דקות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאבו את תמיסת הקיבוע והניחו ללוחות הכיסוי להתייבש במC-hood למשך 30 דקות. שטפו את לוחות הכיסוי פעם אחת עם PBST כדי להגמיש את ממברנות התאים, ולאחר מכן חסמו את התאים עם 10% נסיקת חמור נורמלית ב-PBST למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

הכינו את תערובת הנוגדנים הראשונה על ידי הוספת נוגדנים ראשוניים נגד tubulin ונגד gamma tubulin לתמיסת החסימה וערבוב במכשיר vortex. לאחר מכן, טפטפו 100 µL מתערובת הנוגדנים עבור כל כיסוי זכוכית (coverslip) על מכסה של פלטה בעלת שש בארות. הפכו את כיסוי הזכוכית והניחו אותו בעדינות על טיפת הנוגדנים; דגרו למשך שעתיים.

הוסיפו בטמפרטורת החדר. פעולה זו תצבע את כישורי הבלתי נתיעים (spindles) ואת הסנטרוזומים. החזירו את לוחות הכיסוי לבארים ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBST.

לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדנים המשניים, LOR 488 ו-LOR 568, במינון של טיפה אחת לכל זכוכית כיסוי על גבי מכסה של פלטת שישה באריים. הניחו את זכוכית הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על טיפות הנוגדנים, והדרימו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחשכה. עם סיום ההדגרה עם הנוגדנים המשניים, החזירו את זכוכיות הכיסוי לבאריים ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBST.

לבסוף, הרכיבו את זכוכיות הכיסוי באמצעות רכיב gold anti fade של Prolong, והדגירו ללילה בטמפרטורת החדר בחשכה לייבוש, לפני הדמיית התאים המקובעים במיקרוסקופיה קונפוקלית. PJ 34 הוא פנטה-רודין יציב הממיס במים, אשר נצפה בעבר כמי שממיג באופן בלעדי תאי סרטן בעלי מרכזסומים מרובים, מבלי לפגוע בתאים נורמליים העוברים מיטוזה עם שני מרכזסומים וכישורים ביפוקאליים. במחקר זה, נבדקה הפעילות הציטוטוקסית של PJ 34 באמצעות תאי סרטן שד אנושיים חיים מסוג M-D-A-M-B 231, אשר מאופיינים בשכיחות גבוהה של מרכזסומים נוספים.

התאים עברו טרנספקציה עם gamma tubulin GFP לסמן של מוקדי gamma tubulin ו-histone H two B red לסמן של כרומוזומים. סריקה של תאי M-D-A-M-B 231 למשך 16 שעות לפחות באמצעות דימוי קונפוקאלי חשפה צבירה ביפוקאלית של סנטרוזומים המייצגת צבירה ביפוקאלית של סנטרוזומים עודפים ברוב התאים במטופזה, כפי שמוצג בסרטוני הווידאו הבאים. סרטון זה מציג תא חי שנבחר באופן אקראי במהלך מיטוזה, כאשר הסנטרוזומים מסומנים בירוק על ידי gamma tubulin.

בסרטון השני, GFP משמש להצגת ארגון מחדש של כרומוזומים במהלך המיטוזה בתא M-D-A-M-B 231 שנבחר באקראי והעביר טרנספקציה של histone H two B red. סרטון שלישי זה מציג תא MDA MB 231 העובר מיטוזה, שבו מוקדי extra risomes מקובצים ודו-מוקדיים מסומנים בירוק וכרומוזומים מסומנים באדום. לעומת זאת, בכימרות של תאי M-D-A-M-B 231 שעברו טרנספקציה ודגרו עם 20 micromolar PJ 34, זוהו צנטרוזומים שאינם מקובצים וארגון לקוי של כרומוזומים, והמיטוזה בתאים אלו הסתיימה במות תאי, כפי שמתואר בסרטון זה.

תיעוד זה בזמן אמת של מוות תאי במהלך המיטוזה תומך במידה רבה במתאם חיובי שהוגדר בעבר בין מספר התאים הממאירים האנושיים עם כישורים רב-קוטביים במיטוזה לבין אחוז התאים המתים בתאים שדגרו עם PJ 34. מכיוון ש-PJ 34 פועל כמעכב חזק של PARP one, נבחנה האפשרות שעיכוב של PARP one גורם למוות תאי הקשור לכישלון מיטוטית. הפעילות הציטוטוקסית של ריכוזים עולים של PJ 34 נבדקה בפיברובלסטים עובריים של עכברים תקינים ובכאלה שחסרים PARP one, והתוצאות מוצגות כאן.

הגרף משמאל מציג את אחוז כישורי הבלת הרב-מוקדיים שחושבו בפיברובלסטים עובריים נורמליים של עכבר, המיוצגים על ידי הקו השחור, ובפיברובלסטים חסרי PARP 1, המיוצגים על ידי הקו האפור, אשר דגרו במשך 48 שעות עם PJ 34 בריכוזים המצוינים. אחוזים אלו חושבו מתוך סך של 20 כישורי בלת שזוהו בשלושה ניסויים שונים. הגרף מימין מציג את הישרדותם של פיברובלסטים עובריים נורמליים וחסרי PARP 1 של עכבר שדגרו במשך 72 שעות עם 20 µM.

הישרדות תאי PJ 34 נבחנה באמצעות מדידת ייצור ATP של התאים. מוצגים ערכי הממוצע של ארבע מדידות עבור כל סוג תא בשלושה ניסויים שונים. תוצאות אלו מראות כי PJ 34 גרם, באופן תלוי מינון, לסבבים מעוותים ולמוות תאי בפיברובלסטים עובריים של עכברים עם חסר ב-PARP one, אך לא בפיברובלסטים רגילים.

העובדה ש-PJ 34 חיסל תאים חסרי PARP one למרות חסרון ה-PARP one שלהם, והמתאם בין היווצרות כישורים מולטיפוקאליים לבין חיסול תאים בפיברובלסטים עובריים של עכבר חסרי PARP one שהודגרו עם PJ 34 בריכוזים הגבוהים מאלו הנדרשים לעיכוב PARP one, אינם עקביים עם קשר סיבתי בין פינוי סביבת הסנטרוזומים בפיברובלסטים עובריים של עכבר חסרי PARP one לבין עיכוב PARP one. תמונות קונפוקאליות אלו מציגות פיברובלסטים עובריים של עכבר תקינים וחסרי PARP one במצב של מיטוזה, מקובעים, חדירים ומסומנים אימונולוגית עבור alpha and gamma tubulin אשר סימנו את כישוריהם בירוק ואת הסנטרוזומים באדום, בהתאמה. כרומוזומים סומנו בכחול באמצעות ריאגנט DPI.

התאים הושארו ללא טיפול או הודגרו עם PJ 34 למשך 48 שעות בריכוזים המצוינים. מוקדי gamma tubulin לא מקובצים, כישול במערכות הצירים (spindles) ומות תאים נצפו בפיברובלסטים עובריים של עכבר עם חסר ב-PARP one שטופלו ב-PJ 34, אך לא בפיברובלסטים עובריים רגילים של עכבר שטופלו ב-PJ 34. חלק מתרביות התאים שנבחנו טופלו בשני מעכבי PARP one עוצמתיים שאינם בעלי מבנה ניקLינאי, BT 8 88 ו-G 0 1 4 6 9, המעכבים את הפעילות האנזימטית של PARP one.

מעכבי PARP one שנבדקו לא פגעו בפיברובלסטים עובריים נורמליים של עכברים בריכוזים המעכבים את פעילות PARP one. מעכבים אלו של PARP one לא השפיעו גם הם על התקבצות סנטרוזומים בפיברובלסטים עובריים של עכברים עם חסר ב-PARP one. תוצאות אלו מעידות כי הפעילות הציטוטוקסית של PJ 34 בתאים עם סנטרוזומים מרובים לא הייתה משותפת למעכבי PARP one עוצמתיים אחרים לאחר השליטה בשיטה.

ניתן להשתמש בטכניקה זו בסוגי תאים חיים אחרים למגוון מטרות.