בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ולסמן נויטרופילים ממוח עצם של עכבר לצורך מחקרי תפקוד וניסויי העברה מאמצת (adoptive transfer). פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי איסוף תאי מח עצם מעצמות הירך (femurs) והשוק (tibia) של העכבר. בשלב השני, תאי הדם האדומים עוברים ליזיס אוסמוטי על ידי השעיה רצופית בתמיסות נתרן כלוריד בריכוזים של 0.2% ו-1.6% בהת odpowiedה.

בשלב הבא, מבודדים את הנויטרופילים באמצעות סבוב צנטריפוגה במדרג צפיפות. בשלב הסופי, מסמנים את הנויטרופילים באמצעות צבעי cell tracker. לבסוף, ניתן להשתמש בציטומטריה של זרימה כדי לקבוע את מספר הנויטרופילים שהועברו באופן אדופטיבי וגויסו לרקמות שונות של העכבר.

היתרון העיקרי של בידוד נויטרופילים של עכבר ממח העצם על פני דם או פריטונאום, הוא שניתן להשיג ממח העצם מספר גדול של תאים, המספיק למחקרים פונקציונליים המשכיים ולניסויי העברה אדופטיבית (adoptive transfer), הן במצב בסיסי (steady state) והן לאחר זיהום. היתרון שבשימוש בטכניקת סבוב בגרדיאנט (gradient centrifugation) לבידוד נויטרופילים של עכבר על פני ברירה אימונו-מגנטית או מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), הוא שהשיטה מהירה, חסכונית ומונעת סימון של הנויטרופילים בנוגדנים שעלולים להוביל להפעלת הנויטרופילים. את הפרוצדורה תדגים מוּקָה סוואמי (Muca Swami), טכנאית מהמעבדה שלי, לאחר ריסוס עכבר שעבר הרדמה עם 70% ethanol.

בצעו חתך באזור מרכז הבטן בעור החיה ולאחר מכן הסירו את רקמת העור מהחלק הדיסטלי של החיה, כולל הגפיים התחתונות. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לגזור את השרירים מהגפיים האחוריות של החיה ובצעו פריקה זהירה של ה-ACE beum ממפרק הירך, תוך הימנעות משבירה של ראש הפמור. לאחר מכן, השתמשו במספריים ובסקלפל כדי להסיר את השרירים שנותרו מהפמור ומהטיביה.

הפרידו את עצמות הרגליים במפרק הברך, תוך הקפדה לא לשבור את קצות העצמות, ולאחר מכן הניחו את העצמות בצלחת פטרי המכילה RPMI 1 6 4 oh קר מאוד. הוסיפו FBS ואנטיביוטיקה. העבירו את הצלחת למCבט תרביות רקמה ואז סטריליזרו את החלק החיצוני של כל עצם בעזרת 70% ethanol בצלחת פטרי חדשה.

לאחר כ-10 עד 15 שניות, שטפו את האתנול מפני השטח של כל עצם באמצעות שלושה שטיפות עוקבות ב-PBS סטרילי קר במקרר. לאחר מכן, חתכו והניחו את האפיפיזה (epiphysis) מכל אחת מהעצמות בתוך צלחת פטרי סטרילית חדשה. בשלב הבא, חברו מחט במידה של 25 gauge למזרק של 12 cc מלא ב-10 milliliters של RPMI.

הוסיפו FBS ו-EDTA. לאחר מכן, שטפו את תאי מחול השריד משני קצותי הציר של כל זוג פמור-טיביה אל תוך מבחנת Falcon עם מכסה הברגה בנפח 50 מיליליטר, שצוידה במסנן של 100 מיקרומטר להסרת כל התאים. גרדו את פני השטח הפנימיים של העצמות בעזרת קצה המחט.

כאשר העצמות נראות מלובנות, סימן שהתאים הוסרו באופן מספיק. כעת השתמשו בסכין מנתחים כדי לחתוך את האפיפיזות (קצות העצם) לחתיכות קטנות בגודל 0.5 עד 1 mm, ולאחר מכן השתמשו בקצה האחורי של טיפ פיפטה BioPure של 2.5 mL כדי למעוך אותן דרך מסנן של 100 µm. לאחר סבוב של התאים שנאספו למשך שבע דקות ב-427 ×g ובטמפרטורה של 4 °C, שטפו את תאי הדם האדומים ב-20 mL של 0.2% sodium chloride למשך כ-20 שניות.

לאחר מכן, עצרו את הליזיס באמצעות 20 milliliters של 1.6% sodium chloride, סבבו את התאים בצנטריפוגה ולאחר מכן השעיקו מחדש את המשקע ב-RPMI 1 6 4 oh מועשר עם FBS ו-EDTA. ספרו את התאים, ולאחר סבוב נוסף בצנטריפוגה, השעיקו מחדש את המשקע השטוף בריכוז של עד 100 times 10 to the six תאים ל-one milliliter של PBS סטרילי קר בטמפרטורה של קרח. כעת, העבירו three milliliters של his opaque 1 1 1 9 בטמפרטורה של 18 to 26 degree Celsius לתוך פרועת קונית של 15 milliliter, ולאחר מכן הוסיפו באיטיות שכבה של three milliliters בטמפרטורה של 18 to 26 degree Celsius.

השתמשו ב-Ficoll 1 0 7 7. כדי למנוע ערבוב של שתי הדנסימויות מיד לאחר ההכנה, שפכו בזהירות את תרחיף תאי מחול השגרה מעל ה-Ficoll 1 0 7 7. צנטריגו את מדרג הדנסימות למשך 30 דקות ב-834 ×g וב-25 °C ללא בלימה, ולאחר מכן אספו את הנויטרופילים בממשק שבין שכבות ה-Ficoll 1 1 1 9 וה-1 0 7 7. לאחר שטיפה כפולה של הנויטרופילים שנאספו ב-RPMI 1 6 4 0 עם FBS ואנטיביוטיקה, השביו את התאים בריכוז של 5 × 10⁶ תאים למיליליטר ב-PBS שחומם מראש ל-37 °C.

לאחר ספירת התאים, שמרו אליקוט קטן מכל דגימה ניסויית כדי לקבוע את הטוהר והחיוניות באמצעות ציטומטריית זרימה, ולאחר מכן סמנו את הנויטרופילים שנותרו באמצעות צבע מעקב לתאים (cell tracker dye) בריכוז סופי של 5 µM למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C באמבט מים נערה בחשיכה. לבסוף, שטפו את התאים פעמיים ב-RPMI 1640 קר מאוד, מועשר ב-FBS ואנטיביוטיקה, כדי למנוע זיהום צולב של הצבע לפני ערבוב אוכלוסיות הנויטרופילים המסומנות באופן דיפרנציאלי לצורך מחקרי אישוב תחרותי (competitive repopulation) בהמשך; בלוח זה מוצגים תרשימי ציטומטריית זרימה מייצגים של נויטרופילים מבודדים ממוח העצם בשיטת הפרדה במדרג צפיפות מעכבר C57BL/6 שאינו מזוהם. השערה (gating) ראשונית ששימשה עבור תאי מוח העצם שנאספו מהממשק של Histopaque 1119 ו-Histopaque 1077.

באמצעות שימוש בפיזור קדימה ופיזור הצידה (forward and side scatter) הוכח כי הנויטרופילים שהופרדו במדרג צפיפות הם בטוהר של מעל 90% ובחיוניות של מעל 95% למשך ארבע שעות לפחות לאחר העברה אדופטיבית. ניתן לעקוב אחר נויטרופילים המסומנים ב-DIA באמצעות ציטומטריית זרימה ברקמות שונות של עכברים. לדוגמה, בדם, במח עצם ובכליות של עכבר C 57 black six נגוע ב-candida המקבל, כפי שמוצג בניסוי זה על ידי סינון (gating) של תאים חיים מסוג CD 45 LY six G CD 11 B, ניתן להבחין בין נויטרופילים נ representatives שהועברו אדופטיבית ומסומנים ב-C-M-T-M-R לבין הנויטרופילים המקומיים של העכבר המקבל, שאינם מסומנים ב-C-M-T-M-R ו-PE, על סמך ביטוי ה-PE שלהם.

לאחר רכישת המיומנות, בידוד וסימון של נויטרופילים ממוח העצם של עכבר יכולים להסתיים בתוך שלוש שעות.