Name: השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: למד השתלת תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית. שיטה זו מאפשרת חקר התחדשות עצבית ושיקום תפקוד הקול באמצעות לרינגוסקופיה ואלקטרומיוגרפיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר אדיר (עוזרו במגורים aux Insuffisants Respiratoires) וFondation de l&#39;Avenir על תמיכה הכספית ולד&quot;ר פאני Barnabé-היידר לעריכת כתב היד.

1. תרבויות עיקריות של חוש הריח וחוש ריח רירית נורות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך בינוני, ל50 מיליליטר, על ידי הוספת 44 מיליליטר של סידן ללא השתנה Dulbecco של נשר / הבינוני של בשר חזיר F12 (DMEM/F12), בתוספת 5 מיליליטר של סרום שור העוברי (FBS) ו 1 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 75 סנטימטר 2 צלוחיות עם פולי-L-ליזין (50 מיקרוגרם / מיליליטר, 1.5 מיקרוגרם / 2 סנטימטר), 1 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את צלוחיות עם PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את צלוחיות מצופים במקרר למשך שבוע עד 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שיטה של ​​המתת חסד חייבת להיות מאושרת מראש על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים ושימושו של המוסד ובוצעה על ידי טכנאי מוסמך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חולדות מולדות כגון חולדות פישר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי העכברוש אושר לנכנס הרדמה עמוקה עם pentobarbital נתרן או צורות אחרות של זריקות הרדמה כגון קטמין / xylazine, לערוף אותו וrסר העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הגולגולת מהקדמית לחלק האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את טיפול לקיחת OB, כדי למנוע את קרומי המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו החולדה, פתח sagittaly חלל האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את OM לטפל כדי למנוע את הרירית של דרך הנשימה. שים לב שהאפיתל OM יכול להיות מזוהה בקלות על ידי הצבע הצהבהב שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקולים נוספים מפורטים על נתיחה של OM ניתן למצוא בקודם <a href="https://www.jove.com/video/2762/isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans">J. Vis. Exp.</a> פרסום 13. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח OB בפתרון של האנק שנאגרו מלח (HBSS) המכיל טריפסין 0.1% 45 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח OM בHBSS המכיל 0.05% collagenase 45 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק עיכול אנזימטי על ידי הוספת 2 מיליליטר של מדיום חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם מדיום וצנטריפוגות XG 300 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות Triturate של 2מיליליטר של מדיום באמצעות פיפטה P1000 עד השעיה תא הומוגנית מתקבלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים בצלוחיות Precoated (5-10 x 10 6 תאים / בקבוק) עם 25 מיליליטר של מדיום חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ותרבות התאים ב37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מחצית בינונית כל 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 6-8 ימים במבחנה, לבדוק את חלקם של p75 בתאים חיוביים על דגימות תאים קטנות, הניח להיות OECs במכרסמים, על ידי cytometry זרימה או על ידי immunocytochemistry. לניתוחים אלו, ניתן ללמוד סמנים אחרים כגון GFAP וS100β. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תזרים cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים כמתואר ב&quot; השתלה סלולרית &quot;(סעיף 2.2 בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אותם עם p75 נוגדן ראשוני (1:100) במהלך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 2 מיליליטר של PBS-EDTA ו צנטריפוגות XG 300 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם נוגדנים משני אנטי עכבר PE מצומדות במהלך 15דקות ב 4 ° C בחושך (1:200). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 2 מיליליטר של PBS-EDTA ו צנטריפוגות XG 300 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 500 μl של PBS-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח 10-30 x 10 3 תאים עם זרימת cytometer. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח Immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים ב6 צלחות היטב precoated ל48 שעות כפי שתואר ב&quot; תרבות &quot;(סעיף 1.1.2 להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם PFA 4% ל15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם PBS / טריטון X100 (0.1%) ל15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם נוגדנים ראשוניים (1:200): p75, S100β וGFAP הלילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם הנוגדנים משני (1:500) בשעה 1 ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם Hoechst 10 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תיוג GFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמישה ימים לפני ההשתלה, להדביק תרבויות OB וOM לילה עם וקטור lentiviral מחסה GFP המשופר (ריבוי של זיהום: 20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני צ&#39;ק השתלה על מדגמים קטנים השיעור של תאי GFP חיוביים על ידי זרימת cytometry כפי שתואר לעיל ב&quot; תרבות &quot;(סעיף 1.1). </li></ol></li></ol> 2. כירורגיה והשתלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקה עצב חוזרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניסויים עם בעלי חיים חייבים להיות מאושרים מראש על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים ושימושו של המוסד ובוצעו על ידי טכנאי מוסמך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני החיטוי ניתוח כל המכשירים ולשמור על סטריליות בכל הניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברוש בזריקת intraperitoneal של קטמין הידרוכלוריד (12.5 מ&quot;ג / קילוגרם) וhydrochloride chlorpromazine (0.625 מ&quot;ג / קילוגרם). להעריך את הלימות של הרדמה על ידי קמצוץ הבוהן לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה בפחסה הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך 2 סנטימטר אנכי בינוני צוואר הרחם עורית עם אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך אנכי של שרירי infrahyoid הבאים הקו הלבן המדיאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הגרון באמצעות מפשק autostatic בין שרירי infrahyoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את RLN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת שליטה מיקרוסקופית, חתך את העצב באופן מלא עם microscissors ברמה של טבעת קנה הנשימה השביעית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע השקה באמצעות נקודה אחת של 11.0 תפר תחת שליטה מיקרוסקופית. ניתוח זה מוביל לdenervation מנוע ספציפית של הגרון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתלה סלולרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני ההשתלה, להסיר את התאים מהמנות באמצעות 0.05% EDTA טריפסין למשך 5 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק עיכול אנזימטי על ידי הוספת 2 מיליליטר של מדיום חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG 300 3 דקות. </li><li&gt; תחת מיקרוסקופ לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהתאים את הריכוז הסלולרי על פי פרוטוקול ספציפי. במודל זה, ריכוזים רצויים היו בין 1.2-6 x 10 6 תאים ב30 μl של DMEM/F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות הכנה סלולרית עם 1:02 תמהיל (30 ו60 μl בניסוי זה) של ליטר DMEM/F12-Matrige ב1.5 צינור מיליליטר לפני השתלה ולמקם אותו על קרח. כדי למנוע תופעות לא ספציפיות, השתמש בגורם גדילה המופחת Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני ההשתלה להחזיק את הצינור ביד שלך לכמה שניות כדי לחמם את תערובת Matrigel בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדיח את התמהיל באתר ההשקה באמצעות פיפטה ולחכות עד עצמי מרכיב התערובת על העצב נפגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את השרירים ועור עם תפר 4.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בית החולדות בנפרד ולשמור תחת מנורת חימום ל24 שעות. </li></ol></li></ol> 3. הערכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Laryngoscopy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי חולדות על ידי intraperitהזרקת אוניל של קטמין הידרוכלוריד (12.5 מ&quot;ג / קילוגרם) וhydrochloride chlorpromazine (0.625 מ&quot;ג / קילוגרם). חולדות אשר מורדמים עם קמצוץ הבוהן לפני שתמשיך עם פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה בפחסה הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס 30 ° videolaryngoscope מותאמים למספק את התצוגה הטובה ביותר של הגרון. לקבוע ציוני דרך אנטומיים לשחזר את אותה תצוגה עבור כל הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את תנועות מייתרי קול באמצעות videolaryngoscope (5-10 רצפים / בעלי החיים). לכל חיה לבחור שלושה רצפים של הסתמכות מקסימלי רצופה וחטיפה מקסימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פונקצית גרון באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. לקבוע תנועה זוויתית מוחלטת על ידי מדידת ההבדל בין התנועה של חטיפה מקסימלי והסתמכות מקסימלי של מיתרי קול. לקבוע ציון דינמי על ידי מדידת משרעת התנועה. לקבוע ציון תפקודי על ידי מדידת synkinesis ותנועות paradoxal. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (EMG) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; מקם אלקטרודה על שרירי מיתר הברך של החולדה לבידוד חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הגרון ואת קנה הנשימה על ידי פתיחת עור ובשרירים כפי שתואר לעיל ב&quot; השקה חוזרת עצבים &quot;(סעיף 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את סחוס cricothyroid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את סחוס cricothyroid לחשוף cricoarytenoid האחורי שריר (PCA) באמצעות microscissors. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את האלקטרודה monopolar מחט (38 x 0.45 מ&quot;מ) בשריר PCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט את הפעילות השרירית החשמלית של השרירים PCA באמצעות מערכת רכישה במהלך אוורור ספונטני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הפעילות השרירית במונחים של עושר וסנכרון עם הנשימה. כדי לנתח EMGs, להקצות ציון איכותי 0-3 באמצעות הסולם הבא: 0: מעקב לא מחורזות, ללא עלייה בהשראה, 1: בחרוזים התחקות עם שאיפה גוברת, אך התחקות עלובה (אב עצבים), 2: בחרוזים התחקות עם פעילות עשירה יותר, 3: בחרוזים מעקב, עשיר מאוד, המהווה iדפוס nterference, בדומה לפעילות מכוונת מקסימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את העצב התועה למדידת משך השהיה ופוטנציאלי. העצב התועה נבחר כאתר של גירוי בגלל RLN יכול להינזק במהלך הגירוי בשל גודלו הקטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרות את העצב התועה עם אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט אותות חשמליים בשריר PCA. למדוד Latency ומשך פוטנציאלי. אם אפשר להשתמש במודול רכישה להקליט פעילות שרירית, מיסות ומשך פוטנציאל כגון מערכת Powerlab. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את בעלי החיים באמצעות מנת יתר pentobarbital. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגדם הדיסטלי של RLN תחת שליטה מיקרוסקופית. החלק הדיסטלי של RLN מוגדר כחלק בין ההשקה וגרון. שים לב כי ניתן למצוא באתר ההשקה מספר שבועות לאחר הניתוח, כי התפר 11.0 הוא תפר nonabsorbable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החלק הדיסטלי של RLN בglutaraldehyde 2% עם פוספט 0.1 M(PH = 7.3) עבור 2 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון בזהירות את הדגימות לממש סעיפי העטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות במאגר פוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך במקטעים קטנים יותר (אורך מ&quot;מ 3-4) וpostfix ל60 דקות בטמפרטורת החדר בcacodylate 1% שנאגרו 4 oso ומיובש עם אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות אוריינט בתבניות סיליקון ומשובץ ברפים מורכב ב812 POLYBED, DDSA וMNA, שאליה התווסף 2% מהמאיץ BDMA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך סעיפי חצי דקים רוחביים (1μm העובי) באמצעות מערכת Ultramicrotomy Pyramitome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם עם 0.1% כחולים Toluidine ב1% tetraborate נתרן ל75 שניות ב70 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות RLN עם מערכת ניתוח ספירה. לספור את מספר הסיבים ולמדוד פרופילי סיבי עצב myelinated על ידי קביעת הגבול החיצוני ופנימי של מעטפת המיאלין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התאים להשתלה והשתלת התאים כפי שתוארו לעילב&quot; השתלה סלולרית &quot;(סעיף 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנליזה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את בעלי החיים באמצעות מנת יתר pentobarbital. שים לב שהקיבעון של בעלי החיים יכול להתבצע באמצעות הזרקת intracardiac של PFA 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סביב 2 סנטימטר של RLN. השתמש הפרוקסימלית וחלקים מרוחקים של RLN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מדגם RLN בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות Cut longitudinally באמצעות cryostat (10-20 מיקרומטר עבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות תאי GFP חיוביים. שים לב שהנוגדן אנטי-GFP ניתן להשתמש כדי להגדיל את פליטת הקרינה ולבצע costainings. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).</li>
<li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiling+of+olfactory+ensheathing+cells+from+olfactory+bulb+and+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa.</a> Glia. 58, 1570-1580 (1002).</li>
<li>Honore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+genetic+profiling+of+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+from+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb.</a> Glia. 60, 404-413 (2012).</li>
<li>Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+glia%3A+their+contribution+to+primary+olfactory+nervous+system+regeneration+and+their+regenerative+potential+following+transplantation+into+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.</a> Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).</li>
<li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li>
<li>Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+olfactory+ensheathing+cells+express+nerve+growth+factor%2C+brain-derived+neurotrophic+factor%2C+glia+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).</li>
<li>Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+nodal+formation+of+regenerated+peripheral+nerve+fibers+following+transplantation+of+acutely+prepared+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells.</a> Brain Res. 1125, 1-8 (2006).</li>
<li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+promotes+axonal+regeneration+and+functional+recovery+of+peripheral+nerve+lesion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats.</a> Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).</li>
<li>Guntinas-Lichius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+stimulates+the+collateral+sprouting+from+axotomized+adult+rat+facial+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons.</a> Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).</li>
<li>Makoukji, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+enhances+remyelination+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lithium enhances remyelination of peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).</li>
<li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+mucosa+and+bulb+origin+enhances+functional+recovery+after+peripheral+nerve+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion.</a> PloS one. 6, 22816 (2011).</li>
<li>Paviot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+laryngeal+motor+nerve+repair+is+greater+with+bulbar+than+with+mucosal+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells.</a> Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).</li>
<li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nasal+olfactory+stem+cells+from+rodents+or+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+of+purification+for+establishing+primary+cultures+of+ensheathing+cells+from+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb.</a> Glia. 34, 81-87 (2001).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Although+olfactory+ensheathing+cells+have+remarkable+potential+to+sustain+nerve+regeneration%2C+they+cannot+be+applied+to+a+severe+vagus+nerve+section%2Fresection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model.</a> Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הטכניקות שהוצגו כאן להפוך OECs מודל שימושי ללמוד השתלות סלולריות במודלים של פגיעה העצבית היקפיים. פרוטוקול תרבית התאים הוא פשוט יחסית ויכול להתבצע בקלות. מצד השני, פעולות כירורגיות, בסעיף / השקה מסוימת של RLN, דורשות ניסיון וחייבת להתבצע על ידי טכנאי מוסמך. ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה להדגיש גורמים חשובים להתמקד על מנת לקבל את התוצאות הטובות ביותר אפשריות. ראשית, בניתוק של OM, אנו ממליצים לנתיחה זהירה כדי להשיג...

מערכת ההרחה העיקרית מורכבת משני חלקים נפרדים: רירית ההרחה (OM) במערכת עצבים היקפית ונורת חוש הריח (OB) במערכת העצבים המרכזית. מערכת ההרחה העיקרית מאופיינת בקיבולת של נוירונים העיקרי חוש הריח (PON) עצמי לחדש לאורך כל חיים במינים יונקים. יכולת זו מתאפשרת בשל נוכחותם של תאי גזע עצביים בOM. צמיחת PON וצמיחה המחודשת מOM לOB היא הקלו על ידי תאים מיוחדים הנקראים תאי גליה ensheathing חוש ריח (OECs). OECs הם תאי רכס עצביים שיוצרים microenvironment נוח לנוירוגנזה של PON מOM לOB 1. ובכך, ניתן למצוא בOECs OM ובOB מהווים אוכלוסיות שונות של תאי 2,3. יש מאפיינים השונים של OECs מדענים הראשיים להשתמש בם להשתלות סלולריות בכמה פרדיגמות נגע מערכת עצבים 4. ואכן, גורמי גדילת תוצרת OECs, להפחית מפחידים גליה, יחסי ציבורצמיחה מחודשת אקסון אומוטה, והוא יכול באופן חופשי להתערבב עם 5,6 האסטרוציטים. עם זאת, רובם המכריע של מחקרים אלה מבוססים על פגיעה בחוט השדרה (SCI); כמה מהם השתמשו OECs לאחר פגיעה היקפית עצב (PNI) 7,8. למרות שמערכת העצבים ההיקפית יש לו יכולת מצוינת להתחדש לאחר פגיעה עצבית, חלקים שלמים לגרום לצמיחה מחודשת אקסון סוטה. ואכן, לאחר transections של פנים או עצבים בגרון החוזרים ונשנים (RLN) מלא אקסונים misrouted לגרום cocontractions שרירים הנקרא synkinesis. לכן זה הוא בעל חשיבות העיקרית להציע מודל של PNI לכמת לא רק לצמיחה מחודשת באקסון, אלא גם כדי להעריך את היעילות של התכווצויות שרירים. בספרות המודל הנפוץ ביותר המתואר מבוסס על 9,10 נגע עצב פנים. במודל זה, הערכות תפקודיות מבוססות על ההתאוששות של תנועות זיף 10. עם זאת, הוא מסובך כדי להדגים את היעילות של movements ולהיפלות תופעות cocontractions שרירים. אנו מציעים כאן מודל המבוסס על נגע RLN. מודל זה מאפשר ההערכה של לא רק לצמיחה מחודשת באקסון ותנועות של מיתרי קול, אלא גם את היעילות ואת הפונקציונליות של תנועות אלה לאחר השתלות סלולריות 11,12. פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד הליך לתרבות וההשתלה OECs במודל סעיף RLN / השקה מOM וOB ולהעריך בעלי חיים לאחר ניתוח.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>E3521T</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>E3387M</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>1152-8876</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>M3467Y</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>M3513P</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Merck</td><td>1.03256.0100</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Biovalley</td><td>00563-450</td><td></td></tr><tr><td>MNA</td><td>Biovalley</td><td>00886-450</td><td></td></tr><tr><td>BDMA</td><td>Biovalley</td><td>00141-100</td><td></td></tr><tr><td>Polybed 812</td><td>Biovalley</td><td>08791-500</td><td></td></tr><tr><td>PE נגד עכברים&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>550589</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR</td><td>BD Bioscience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti P75</td><td>Chemicon</td><td>MAB 365</td><td></td></tr><tr><td>11.0 Wire</td><td>Ethicon</td><td>FG 2881</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue&nbsp;</td><td>Ral Diagnostics</td><td>361590-0025</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>סיגמא</td><td>סיגמא 2-16PK</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar זרימה קולט</td><td>אדים מהיר יותר</td><td>BH-EN 2003 S</td><td></td></tr><tr><td>זרימה ציטומטר</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSקליבור</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videolaryngoscope</td><td>Karl Storz Endoskope</td><td>Telecam SL NLSC 20212120</td><td></td></tr><tr><td>מערכת רכישה</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab מערכת</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אולטרה-מיקרוטומיה פירמיטום&nbsp;</td>מערכת ניתוח תמונות <td>Leica</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Explora Nova</td><td>Mercator</td><td></td></tr></tbody></table>

השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

<html> תאי ensheathing חוש ריח (OECs) הם תאי רכס עצביים המאפשרים צמיחה וצמיחה מחודשת של תאי עצב ההרחה הראשוניים. ואכן, מערכת ההרחה העיקרית מאופיינת ביכולתה להצמיח נוירונים חדשים גם בבעלי חיים מבוגרים. יכולת מסוימת זה נובעת בחלקו את נוכחותו של OECs אשר ליצור microenvironment נוח לנוירוגנזה. מאפיין זה של OECs נוצל בעבר להשתלה סלולרית כגון במודלים של פגיעה בחוט השדרה. למרות שמערכת העצבים ההיקפית יש קיבולת גדולה יותר להתחדש לאחר פגיעה בעצב מאשר במערכת העצבים המרכזית, חלקים שלמים לגרום misrouting במהלך צמיחה מחודשת אקסון בפרט לאחר פנים של חיתוך רוחב עצב בגרון. באופן ספציפי, חתך מלא של העצב חוזר ונשנה בגרון (RLN) גורם לצמיחה מחודשת אקסון חריג וכתוצאה מכך synkinesis של מיתרי קול. בדגם הספציפי הזה, הראינו כי השתלת OECs יעילות מגבירה צמיחה מחודשת עצב. ve_content &quot;&gt; OECs הם היוו של כמה אוכלוסיות בהווה בשתי רירית ההרחה (OM-OECs) ונורות חוש הריח (OB-OECs). אנו מציגים כאן מודל של השתלה סלולרית המבוסס על השימוש באוכלוסיות שונות אלה של OECs ב מודל פציעת RLN. שימוש בפרדיגמה זו, תרבויות עיקריות של OB-OECs וOM-OECs הושתלו בMatrigel אחרי סעיף והשקה של RLN. חודשיים לאחר הניתוח, הערכנו בעלי חיים מושתלים בניתוחים משלימים הבוסס על videolaryngoscopy, (EMG) , ומחקרים היסטולוגית. ראשית, videolaryngoscopy אפשר לנו להעריך פונקציות בגרון, במיוחד תופעות cocontractions שרירים. לאחר מכן, EMG מנתח עושר וסנכרון של פעילות שרירית הפגין. לבסוף, מחקרים היסטולוגית מבוססים על כתמי כחולי toluidine אפשרו כימות של המספר והפרופיל של סיבי myelinated. בסך הכל, אנו מתארים כאן כיצד לבודד, התרבות, identify והשתלת OECs מOM וOB לאחר חתך השקה וכיצד להעריך ולנתח את היעילות של תאים מושתלים אלה על פונקציות לצמיחה מחודשת וגרון אקסון RLN.

איורים עם שליטה וreinnervated (סעיף / anastomosed) בעלי חיים שנבחרו כתוצאות יכולות להשתנות בהתאם להשתלות הסלולריות שבוצעו (OM, OB או OM + OB). תרבית תאים התאים לדבוק במהירות למשטח הפלסטיק והפכו הפרדה לנתחים מקבילים של תאים הנמצאים מוארכים או מתחדדים, משולשים, קוטביים, או ציר בצורה (1A ומספרים 1 ב &#39;). אחרי 8 ימים במבחנת זרימת cytometry הניתוח מראה את שיעור התאים חיוביים ...

תאי ensheathing חוש ריח (OECs) הם תאי רכס עצביים המאפשרים צמיחה של תאי עצב ההרחה הראשוניים. נכס ספציפי זה יכול לשמש להשתלת תאים. אנו מציגים כאן מודל של השתלה סלולרית המבוסס על השימוש בOECs במודל פציעת עצב בגרון.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להציג מודל של השתלת תאים המבוסס על שימוש בתאי ריח ותאי מעטפת (sheathing cells) במודל של פגיעה בעצב הלרינגיאל. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע חיתוך ואנסטומוזיס של העצב הלרינגיאל החוזר. לאחר מכן, מושתלים תאי ריח ותאי מעטפת שהופקו מרירית האף או מבצולות הריח.לאחר מכן, חודשיים עד שלושה חודשים לאחר הניתוח, בעלי החיים נבחנים באמצעות לרינגוסקופיה ואלקטרומיוגרפיה. לבסוף, העצב הלרינגיאלי חוזר (recurrent laryngeal nerve) מבודל לצורך מחקרים היסטולוגיים. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות שתאים ריחניים ותאי מעטפת משפרים את הצמיחה מחדש של אקסונים בעצב הלרינגיאלי חוזר ואת ההחלמה התפקודית של מיתרי הקול, כפי שנמדד באמצעות לרינגוסקופיה, אלקטרומיוגרפיה ומדידות היסטולוגיות.שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בתחום של פגיעות בעצבים פריפריים הכוללות את מדידת הצמיחה האקסונלית ואת היכולת לכמת את התפקודיות של ההחלמה. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, שכן אנסטומוזיס חוזר של עצבי ה-lal דורש מיומנויות מיקרו-כירורגיות. לאחר יצירת תרביות ראשוניות של בולבי ריח (OB) או רירית אפיתלית של האף (OM) המסומנות ב-GFP, כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב, יש להכין את הציוד לניתוח באמצעות עיקור באוטוקלאב של כל המכשירים.לאחר הרדמת החולדה באמצעות הזרקה תוך-פעטנית של ketamine ו-chlorpromazine, יש לוודא את רמת הסדציה על ידי ביצוע צביטה באצבע. גלחו את אזור הניתוח והשכיבו את החולדה במנח גב (dorsal decubitus), וחטאו את העור באמצעות שטיפות לסירוגין של אלכוהול ותמיסת Betadine. לאחר מכן, הכינו סביבת ניתוח סטרילית והקפידו על נהלי סטריליזציה לאורך כל הניתוח.השתמש בסקאלפל כדי לבצע חתך עורי צווארי מדיאלי באורך שני סנטימטרים. לאחר מכן, בהמשך לקו הלבן המדיאלי, בצע חתך אנכי של השרירים מתחת לבלבלה (infra hyoid muscles) באמצעות רטרקטור אורתוסטטי בין השרירים. חשוף את הלרינקס ולאחר מכן את העצב הלרינגיאלי החוזר או ה-RLN.לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ כירורגי, השתמש במספרי מיקרו כדי לחתוך את העצב באופן מלא בגובה טבעת הקנה השביעית עם תפר נקודתי אחד מסוג 11 T. בצע אנסטומוזיס כדי לבצע דנרובציה של הלרינקס רגע לפני ההשתלה. השתמש ב-0.05%trypsin EDTA כדי להסיר את תאי ה-OB וה-OM מהצלחות.לאחר מכן, כדי לעצור את העיכול, הוסף חמישה מיליליטר של מצע חמים לאחר סבוב של התאים בצנטריפוגה ב-432 G למשך חמש דקות. השתמש ב-hemocytometer כדי לספור את התאים וכוונן את ריכוז התאים במודל זה לבין 1.2 ושישה כפול 10⁶ תאים ב-30 µL של D-M-E-M-F 12 בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה. הכן יחס של 1:2 בין תאים לגורמי גדילה ו-reduced matrigel, והנח על קרח ממש לפני השתלה.הוציאו את המבחנה מהקרח והחזיקו אותה כדי לחמם את התערובת. בעזרת פיפטה, הניחו את תמיסת ה-matrigel התאית על אתר האנסטומוזיס והמתינו שהתערובת תתרכב באופן עצמי על העצב הפגוע לאחר שהיא תתקבע. השתמשו בתפרי 4-0 כדי לסגור את השרירים ואת העור.הניחו את החולדה בכלוב אינדיבידואלי והשאירו אותה תחת מנורת חימום למשך 24 שעות. ניתן משככי כאבים במהלך חמישה הימים הבאים, בערך חודשיים לאחר הניתוח, לאחר הרדמה. עבור חולדות כפי שתוארו קודם לכן בסרטון זה, השתמשו בצביטה בבוהן כדי לאשר את רמת הסדציה.הנח את החולדה בשכיבה על הגב לפני הכנסת וידאו-לרינגוסקופ בזווית של 30 מעלות. כוון את הלרינגוסקופ כדי להשיג את המבט הטוב ביותר על הלרינקס, במטרה לשחזר את אותו מבט עבור כל הקלטה. קבע את נקודות הציון האנטומיות, כגון הקומיסורה האחורית, מיתר הקול הימני בנקודת חיבורו לאפופיזיס הווקאליס של ה-OID, ומיתר הקול השמאלי בנקודת חיבורו לאפופיזיס הווקאליס של ה-OID.הקליטו את תנועות מיתרי הקול על ידי בחירת שלוש רצפים של פתיחה (abduction) מקסימלית וסגירה (adduction) מקסימלית רצופות. כדי לנתח את תפקוד הלרינקס, קבעו את התנועה הזוויתית המוחלטת על ידי מדידת ההפרש בין התנועה של פתיחה מקסימלית לסגירה מקסימלית של מיתרי הקול. קבעו את הניקוד הדינמי על ידי מדידת אמפליטודת התנועה ואת הניקוד התפקודי על ידי מדידת הסינקינזיס ותנועות פרדוקסליות לצורך ביצוע אלקטרומיוגרפיה.מקמו אלקטרודה על שריר ההמסטרינג (hamstring) של החולדה לאחר חשיפת הלרינקס והטרכאה כפי שהודגם עבור אנסטומוזיס של העצב החוזר. חשפו את הסחוס הקריקותרואידי. לאחר מכן, באמצעות מספרי מיקרו, פתחו את הסחוס הקריקותרואידי כדי לחשוף את השריר הקריקותרואידי האחורי (PCA).החדירו אלקטרודת מחט מונופולרית אל השריר כאשר בעל החיים תחת הנשמה ספונטנית. השתמשו במערכת רכישה כדי להקליט את הפעילות החשמלית של שריר ה-PCA. נתחו את הפעילות השרירית במונחים של עושר וסנכרון עם הנשימה על ידי הקצאת ציון איכותני מאפס עד שלוש באמצעות הסולם הבא.אפס שווה לרישום שלא נבדק ללא עלייה במהלך השאיפה. אחד שווה לרישום קצבי עם שאיפה עולה, אך רישום דל, שניים שווה לרישום קצבי עם פעילות עשירה יותר, ושלושה שווה לרישום קצבי עשיר מאוד היוצר דפוס התאבכות הדומה לפעילות מכוונת מקסימלית.בשלב הבא, כדי למנוע פגיעה ב-RLN בשל גודלו הקטן, חשוף את עצב הוואגוס (vagus nerve), לאחר מכן חבר אלקטרודה ובצע גרייה באתר זה. רשום את זמן ההשהיה (latency) ואת משך הפוטנציאל בשריר ה-PCA. לבסוף, לאחר הרדמה של בעל החיים באמצעות מינון יתר של פנטובארביטל תחת מיקרוסקופ, אתר את האנסטומוזיס, תפר והסר את הקטע הדיסטלי של ה-RLN שבין האנסטומוזיס ללרינקס.בצע ניתוח היסטולוגי בהתאם לפרוטוקול הטקסט המוצג כאן לאחר השתלה של תאים מתרביות ראשוניות של רירית האף; פקעות הריח הן דוגמאות לעקבות EMG שהתקבלו בשריר ה-PCA במהלך נשימה. בעלי חיים מקבוצת הביקורת הראו פעילות שרירית חשמלית עשירה עם עלייה במהלך השאיפה, דבר שלא נראה בקבוצת ה-Rerated. באיור זה, ניתוחים היסטולוגיים של ה-RLN באמצעות צביעת toluidine blue מראים פרופילים טיפוסיים של סיבים מבעלי חיים נורמליים, כאלו שעברו ר-אינרבציה וכאלו שעברו השתלה.מדידה זו מאפשרת כימות של מספר הסיבים המיאליניים, הגודל הממוצע של הסיבים והעובי הממוצע של המיאלין כפי שמוצג כאן. להשלמת האנליזות ההיסטולוגיות, בוצע מעקב אחר תאים חיוביים ל-GFP לאחר השתלה תוך-עצבית בעצב הסיאטיק.אתר זה נבחר במקום ה-RLN מכיוון שגודלו הקטן של ה-RLN מונע השתלה תוך-עצבית. ניתן לבצע אנסטומוזיס של ה-recurrent laryngeal nerve תוך 15 דקות אם הפעולה מבוצעת כראוי לאחר פיתוחו. טכניקות אלו סללו את הדרך עבור חוקרים בתחום פגיעות העצבים ההיקפיים לבחון את השימוש בהשתלת תאים במודל של חולדה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השתלת תאים במודל של פגיעה חוזרת בעצב הבלתי רשמי (recurrent nerve), ותדעו להעריך את ההחלמה התפקודית של מיתרי הקול באמצעות אלקטרומיוגרפיה, אנדוסקופיה מעבדתית ומדידות היסטולוגיות.

transplantation-olfactory-ensheathing-cells-to-evaluate-functional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פגיעה טראומתית בחוט השדרה משבש את התקשורת עם המוח. כדי לשחזר קישוריות איבד אנו מנצלים שתל העצב ההיקפיים לספק תשתית של סיבים התחדשות בשילוב עם גורמים neurotrophic מטריקס ו-ויסות אנזימים להסיר מולקולות המעכבות כדי לקדם את צמיחת למרחקים ארוכים.

שילוב העצבים ההיקפית השתלת ומטריקס אפנון לתקן את חוט השדרה עכברוש נפגעים

אנו מתארים כאן שיטה לביופסיה של רירית חוש הריח של העכברים וחללים האף האנושי. ביופסיות אלו יכולים לשמש גם לזיהוי חריגות מולקולרי במחלות מוח או בידוד multipotent גזע בוגרים לתאי כי יכול להיות מנוצל עבור השתלת תאים בבעלי חיים טראומה מוחית / מחלה.

בידוד באף גזע תאים חוש הריח של מכרסמים או בני אדם

סרטון וידאו זה מדגים את ההליך לבודד נוירונים של גנגליון רשתית (RGNs) מהרשתית של חולדה ולעבד אותם יחד עם תאי גליה (OEG). שיטה זו מאפשרת לחקור את הפוטנציאל הנוירו-רגנרטיבי של OEGs לאחר פגיעה עצבית.

טיפוח של נוירוני גנגליון ברשתית עם גליית מעטפת חוש הריח

מקור: Portela-Lomba, M., et. al. קוקולטורה של נוירונים של גנגליון רשתית של חולדה עם גליה מעטפת ריח, כמודל במבחנה של התחדשות אקסונלית בוגרת. J. Vis. exp. (2020). סרטון זה מדגים הדמיה וכימות של התחדשות אקסונלית בתאי עצב גנגליון רשתית של חולדות אקסוטומיות (RGNs) בתרבית משותפת עם תאי גליה עוטפים ריח אנושיים אימורטליים. RGNs הם בעלי תווית חיסונית, עם סומות אדומות ואקסונים ירוקים. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, ואחוז הנוירונים עם אינדקס התחדשות אקסוני ואקסונלי כומת באמצעות תוכנת...

הדמיה וכימות של התחדשות אקסונלית בנוירונים של גנגליון רשתית של חולדה

ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

מאמר זה מתאר שיטה להוספת צינור חלול בין גדמי חוט השדרה לאחר חיתוך מלא מילוי עם תאי שוואן (SCs), קרום המרתף להזרקה מטריקס על מנת לגשר, לקדם התחדשות האקסון על פני הפער.

השתלת של שוואן תאים בתוך תעלות PVDF-TrFE לגשר עכברוש Transected גדמי חוט השדרה כדי לקדם התחדשות האקסון על פני הפער

פרוטוקול זה מציג מודל חזק, לשחזור של כלי דם מרוכבים allotransplant (VCA) מכוון למחקר בו זמנית של אימונולוגיה והתאוששות תפקודית. הזמן שהושקע בטכניקה קפדנית בהשתלה אורתוטופית ירך ימין באמצע הירך האחורי עם תפורים ביד וסמיכות עצבית מניב את היכולת ללמוד התאוששות תפקודית.

לוקח את הצעד הבא: מודל השתלת גפיים אחוריות קופטציה עצבית כדי למקסם את ההתאוששות תפקודית בחולדה

אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.

Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים

במאמר זה, אנו מספקים שיטה ניתנת לשחזור ליצירה ותחזוקה של פרוסות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של חוט השדרה שהושתלו בתאי גזע עצביים כמודל ex vivo לבדיקת טיפולים תחליפיים תאיים.

תרבית פרוסה אורגנוטיפית של חוט השדרה של עכבר לטווח ארוך כפלטפורמה לאימות השתלת תאים בפגיעה בחוט השדרה

גרעיני גב שורש (DRG) הם מבנים המכילים את תאי העצב התחושתיים של מערכת עצבים ההיקפית. כאשר ניתק, הם יכולים להיות שיתוף תרבותי עם תאים כמו SC-המופק שומן גזע (ASC), מתן מודל רב ערך כדי ללמוד במבחנה התחדשות עצב וmyelination, מחקה את סביבת in vivo באתר הפציעה.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

למד השתלת תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית. שיטה זו מאפשרת חקר התחדשות עצבית ושיקום תפקוד הקול באמצעות לרינגוסקופיה ואלקטרומיוגרפיה.

השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית

גלה סרטונים נוספים