השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להציג מודל של השתלת תאים המבוסס על שימוש בתאי ריח ותאי מעטפת (sheathing cells) במודל של פגיעה בעצב הלרינגיאל. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע חיתוך ואנסטומוזיס של העצב הלרינגיאל החוזר. לאחר מכן, מושתלים תאי ריח ותאי מעטפת שהופקו מרירית האף או מבצולות הריח.

לאחר מכן, חודשיים עד שלושה חודשים לאחר הניתוח, בעלי החיים נבחנים באמצעות לרינגוסקופיה ואלקטרומיוגרפיה. לבסוף, העצב הלרינגיאלי חוזר (recurrent laryngeal nerve) מבודל לצורך מחקרים היסטולוגיים. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות שתאים ריחניים ותאי מעטפת משפרים את הצמיחה מחדש של אקסונים בעצב הלרינגיאלי חוזר ואת ההחלמה התפקודית של מיתרי הקול, כפי שנמדד באמצעות לרינגוסקופיה, אלקטרומיוגרפיה ומדידות היסטולוגיות.

שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בתחום של פגיעות בעצבים פריפריים הכוללות את מדידת הצמיחה האקסונלית ואת היכולת לכמת את התפקודיות של ההחלמה. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, שכן אנסטומוזיס חוזר של עצבי ה-lal דורש מיומנויות מיקרו-כירורגיות. לאחר יצירת תרביות ראשוניות של בולבי ריח (OB) או רירית אפיתלית של האף (OM) המסומנות ב-GFP, כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב, יש להכין את הציוד לניתוח באמצעות עיקור באוטוקלאב של כל המכשירים.

לאחר הרדמת החולדה באמצעות הזרקה תוך-פעטנית של ketamine ו-chlorpromazine, יש לוודא את רמת הסדציה על ידי ביצוע צביטה באצבע. גלחו את אזור הניתוח והשכיבו את החולדה במנח גב (dorsal decubitus), וחטאו את העור באמצעות שטיפות לסירוגין של אלכוהול ותמיסת Betadine. לאחר מכן, הכינו סביבת ניתוח סטרילית והקפידו על נהלי סטריליזציה לאורך כל הניתוח.

השתמש בסקאלפל כדי לבצע חתך עורי צווארי מדיאלי באורך שני סנטימטרים. לאחר מכן, בהמשך לקו הלבן המדיאלי, בצע חתך אנכי של השרירים מתחת לבלבלה (infra hyoid muscles) באמצעות רטרקטור אורתוסטטי בין השרירים. חשוף את הלרינקס ולאחר מכן את העצב הלרינגיאלי החוזר או ה-RLN.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ כירורגי, השתמש במספרי מיקרו כדי לחתוך את העצב באופן מלא בגובה טבעת הקנה השביעית עם תפר נקודתי אחד מסוג 11 T. בצע אנסטומוזיס כדי לבצע דנרובציה של הלרינקס רגע לפני ההשתלה. השתמש ב-0.05%trypsin EDTA כדי להסיר את תאי ה-OB וה-OM מהצלחות.

לאחר מכן, כדי לעצור את העיכול, הוסף חמישה מיליליטר של מצע חמים לאחר סבוב של התאים בצנטריפוגה ב-432 G למשך חמש דקות. השתמש ב-hemocytometer כדי לספור את התאים וכוונן את ריכוז התאים במודל זה לבין 1.2 ושישה כפול 10⁶ תאים ב-30 µL של D-M-E-M-F 12 בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה. הכן יחס של 1:2 בין תאים לגורמי גדילה ו-reduced matrigel, והנח על קרח ממש לפני השתלה.

הוציאו את המבחנה מהקרח והחזיקו אותה כדי לחמם את התערובת. בעזרת פיפטה, הניחו את תמיסת ה-matrigel התאית על אתר האנסטומוזיס והמתינו שהתערובת תתרכב באופן עצמי על העצב הפגוע לאחר שהיא תתקבע. השתמשו בתפרי 4-0 כדי לסגור את השרירים ואת העור.

הניחו את החולדה בכלוב אינדיבידואלי והשאירו אותה תחת מנורת חימום למשך 24 שעות. ניתן משככי כאבים במהלך חמישה הימים הבאים, בערך חודשיים לאחר הניתוח, לאחר הרדמה. עבור חולדות כפי שתוארו קודם לכן בסרטון זה, השתמשו בצביטה בבוהן כדי לאשר את רמת הסדציה.

הנח את החולדה בשכיבה על הגב לפני הכנסת וידאו-לרינגוסקופ בזווית של 30 מעלות. כוון את הלרינגוסקופ כדי להשיג את המבט הטוב ביותר על הלרינקס, במטרה לשחזר את אותו מבט עבור כל הקלטה. קבע את נקודות הציון האנטומיות, כגון הקומיסורה האחורית, מיתר הקול הימני בנקודת חיבורו לאפופיזיס הווקאליס של ה-OID, ומיתר הקול השמאלי בנקודת חיבורו לאפופיזיס הווקאליס של ה-OID.

הקליטו את תנועות מיתרי הקול על ידי בחירת שלוש רצפים של פתיחה (abduction) מקסימלית וסגירה (adduction) מקסימלית רצופות. כדי לנתח את תפקוד הלרינקס, קבעו את התנועה הזוויתית המוחלטת על ידי מדידת ההפרש בין התנועה של פתיחה מקסימלית לסגירה מקסימלית של מיתרי הקול. קבעו את הניקוד הדינמי על ידי מדידת אמפליטודת התנועה ואת הניקוד התפקודי על ידי מדידת הסינקינזיס ותנועות פרדוקסליות לצורך ביצוע אלקטרומיוגרפיה.

מקמו אלקטרודה על שריר ההמסטרינג (hamstring) של החולדה לאחר חשיפת הלרינקס והטרכאה כפי שהודגם עבור אנסטומוזיס של העצב החוזר. חשפו את הסחוס הקריקותרואידי. לאחר מכן, באמצעות מספרי מיקרו, פתחו את הסחוס הקריקותרואידי כדי לחשוף את השריר הקריקותרואידי האחורי (PCA).

החדירו אלקטרודת מחט מונופולרית אל השריר כאשר בעל החיים תחת הנשמה ספונטנית. השתמשו במערכת רכישה כדי להקליט את הפעילות החשמלית של שריר ה-PCA. נתחו את הפעילות השרירית במונחים של עושר וסנכרון עם הנשימה על ידי הקצאת ציון איכותני מאפס עד שלוש באמצעות הסולם הבא.

אפס שווה לרישום שלא נבדק ללא עלייה במהלך השאיפה. אחד שווה לרישום קצבי עם שאיפה עולה, אך רישום דל, שניים שווה לרישום קצבי עם פעילות עשירה יותר, ושלושה שווה לרישום קצבי עשיר מאוד היוצר דפוס התאבכות הדומה לפעילות מכוונת מקסימלית.

בשלב הבא, כדי למנוע פגיעה ב-RLN בשל גודלו הקטן, חשוף את עצב הוואגוס (vagus nerve), לאחר מכן חבר אלקטרודה ובצע גרייה באתר זה. רשום את זמן ההשהיה (latency) ואת משך הפוטנציאל בשריר ה-PCA. לבסוף, לאחר הרדמה של בעל החיים באמצעות מינון יתר של פנטובארביטל תחת מיקרוסקופ, אתר את האנסטומוזיס, תפר והסר את הקטע הדיסטלי של ה-RLN שבין האנסטומוזיס ללרינקס.

בצע ניתוח היסטולוגי בהתאם לפרוטוקול הטקסט המוצג כאן לאחר השתלה של תאים מתרביות ראשוניות של רירית האף; פקעות הריח הן דוגמאות לעקבות EMG שהתקבלו בשריר ה-PCA במהלך נשימה. בעלי חיים מקבוצת הביקורת הראו פעילות שרירית חשמלית עשירה עם עלייה במהלך השאיפה, דבר שלא נראה בקבוצת ה-Rerated. באיור זה, ניתוחים היסטולוגיים של ה-RLN באמצעות צביעת toluidine blue מראים פרופילים טיפוסיים של סיבים מבעלי חיים נורמליים, כאלו שעברו ר-אינרבציה וכאלו שעברו השתלה.

מדידה זו מאפשרת כימות של מספר הסיבים המיאליניים, הגודל הממוצע של הסיבים והעובי הממוצע של המיאלין כפי שמוצג כאן. להשלמת האנליזות ההיסטולוגיות, בוצע מעקב אחר תאים חיוביים ל-GFP לאחר השתלה תוך-עצבית בעצב הסיאטיק.

אתר זה נבחר במקום ה-RLN מכיוון שגודלו הקטן של ה-RLN מונע השתלה תוך-עצבית. ניתן לבצע אנסטומוזיס של ה-recurrent laryngeal nerve תוך 15 דקות אם הפעולה מבוצעת כראוי לאחר פיתוחו. טכניקות אלו סללו את הדרך עבור חוקרים בתחום פגיעות העצבים ההיקפיים לבחון את השימוש בהשתלת תאים במודל של חולדה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השתלת תאים במודל של פגיעה חוזרת בעצב הבלתי רשמי (recurrent nerve), ותדעו להעריך את ההחלמה התפקודית של מיתרי הקול באמצעות אלקטרומיוגרפיה, אנדוסקופיה מעבדתית ומדידות היסטולוגיות.