Name: שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: למדו כיצד לכמת פטריות פתוגניות בשיתוף עם תאי מארח באמצעות ציטומטריית תמונה. שיטה זו מציעה חלופה מהירה ויעילה למניית יחידות יוצרות מושבות CFU במחקר פתוגנזה פטרייתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. זיהום של המקרופאגים עם ח&#39; capsulatum, ג אלביקנס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 שעות לפני ההדבקה, מקרופאגים זרעים בצפיפות רצויה ב24 גם צלחות. בפרוטוקול זה, צפיפות של 3.0 x 10 5 תאים / גם הייתה בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תאים פטרייתיים בצמיחת יומן שלב בריבוי רצוי של זיהום (משרד הפנים). פרוטוקול זה יכול להכיל מגוון של משרד הפנים (0.2-5.0). להדבקת RAW264.7 מקרופאגים עם ח&#39; capsulatum, השתמשנו במשרד פנים של 0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 1.5 שעות כדי לאפשר לphagocytosis, לשטוף מקרופאגים שלוש פעמים עם PBS להסיר פטריות תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של מספר רצוי של שעות לפני ניתוח מדגם. במשרד פנים נמוך (0.2 בניסוי שלנו), תאי macrophage נגועים להישאר קיימא במשך כמה ימים, וניתן לנתח דגימות בערך כל 12-24 שעות. </li></ol> 2. תמוגה מקרופאג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את פטריות מתאי macrophage, להסיר תקשורת, לשטוף 3 פעמים עם PBS, ולהוסיף 0.5 מיליליטר מים סטריליים. בתנאים אלה, יהיו lyse מקרופאגים ותאי פטריות יישארו ללא שינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר lysate לצינור סטרילי, לשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 20 lysate μl לצינור נפרד, ולאחר מכן להוסיף פתרון PI 20 AO / μl. להמשיך ישירות לשלב 5: &quot;לדוגמא הכנה לניתוח cytometric תמונה&quot; </li></ol> 3. ציפוי CFU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע דילול של פי עשרה מlysates (משלב 2.3) בתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת μl 100 של דילול כל, בשני עותקים, על צלחות HMM-agarose. דגירה צלחות בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 7-8 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור ידני מושבות על צלחות מוצגות מינימום של 100 ועד למקסימום של 1,000 מושבות נפרדות. </li></ol> 4. ויזואליזציה של פטריות בתוך המקרופאגים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מקרופאגים חיים, לשטוף תאים 3 פעמים עם PBS. הוסף 0.5 מ&quot;ל PBS ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר מקרופאגים מבארות תרבית רקמה, בעדינות פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים. העבר את הנוזל לצינור סטרילי, לשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 20 מדגם μl לצינור נפרד, ולאחר מכן להוסיף פתרון PI 20 AO / μl. להמשיך ישירות לשלב 5: &quot;לדוגמא הכנה לניתוח cytometric תמונה&quot;. </li></ol> 5. לדוגמא הכנה לניתוח cytometric תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מדגם היעד ביסודיות ולאחר מכן להעביר 20 μl של דגימה לתוך תא ספירת תאים חד פעמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים להתיישב בחדר למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס לספור קאמרית לcytometer התמונה. </li></ol> 6. התקנת מכשיר Cellometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מודולים אופטיים הקרינה: VB-535-402 ו-VB-660-502 למערכת ולוודא שהם נעולים במקום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VB-535-402 (עירור ב 475 ננומטר, פליטה ב 535 ננומטר) משמש לacridine כתום וגילוי ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VB-660-502 (excitatiב540 ננומטר, פליטה ב 660 ננומטר) משמשת לזיהוי יודיד propidium. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל cytometer התמונה ולפתוח את התוכנה הנלווית. </li></ol> 7. התקנת תוכנת Cellometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את &quot;סוג assay&quot; הקבוע מראש ו&quot; סוג סלולרי &quot;בתפריט הנפתח Assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכדאיות, assay הוא מותאם לacridine כתום וזיהוי יודיד propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של זיהום קנדידה אלביקנס, assay מתוכנן לגילוי ה-GFP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;אפשרויות&quot; בחלק העליון ולחץ על &quot;תמונת רקע לקחת&quot;, ולאפשר את הפעולה כדי להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;תמונה בהירה שדה תצוגה מקדימה&quot;. </li></ol> 8. הליך רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המדגם קאמרי המוכן לcytometer התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפתור הפוקוס ולהתאים את הפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם אחת בפוקוס, לחץ על &quot;רוזן&quot;, ולאפשר את פעולת רכישת התמונה כדי להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמוve חדר ספירה חד פעמי ולהשליך כראוי. </li></ol> 9. ניתוח נתוני תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז ומדידת כדאיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהספירה הושלמה, הריכוז ויכולת הקיום של תאי המטרה מוצגים בדף התוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;יצוא&quot; כדי לייצא את הנתונים לFCS Express 4 לניתוח אוכלוסיית תאי ה-GFP בניסוי זיהום קנדידה אלביקנס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח FCS אקספרס של תאים נגועים בקנדידה אלביקנס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את קובץ &quot;. NXDAT&quot; לFCS Express 4 ועלילה את התוצאות ביסטוגרמה פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שער אוכלוסיית תא ליסטוגרמה כדי לקבוע את אחוזי האוכלוסייה של תאים נגועים בקנדידה אלביקנס. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Vet.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li>
<li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li>
<li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+yeast%3A+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li>
<li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li>
<li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis%2C+mitochondrial+potential%2C+and+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li>
<li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li>
<li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micro.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1%2C+a+conserved+transcriptional+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li>
<li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li>
</ol>

את ליאו Li-יינג צ&#39;אן וParadis בנימין הכותבים הם עובדי Nexcelom Bioscience LLC.

cytometry התמונה מאפשרת למשתמש ללכוד תמונות באיכות גבוהות, ובאמצעות תוכנה מיוחדת, לבצע כימות מהירה של תאים. אתגר אחד פוטנציאל לאימוץ cytometry תמונה בתחום פתוגנזה של חיידקים הוא שהחיידקים שנספרו נמצאים באוכלוסייה מעורבת של תאים, כולל תאי מארח יונקים. כאן, אנו מראים כי cytometry תמונה יכולה לשמש לכימות של שמרים פתוגניים קיימא במהלך הזיהום במקרופאג מבחנה. אמונה את מגמות המתודולוגיה שלנו לא רק משחזרת בצמיחת פטרייתי ואת כדאיות שבנצפתה במהלך מבחני זיהום מקרופאג חו...

מחקרים של פטריות פתוגניים בשיתוף עם המארחים ו / או תאי מארח שלהם לעתים קרובות דורשים כימות של תאים פטרייתיים קיימא לאורך זמן או כמובן בתנאי זיהום שונים. ספירה של יחידות מושבה להרכיב (CFU) היא השיטה הסטנדרטית שבו מספר התאים פטרייתיים קיימא כבר נמדד, לעומת זאת, טכניקה זו יש כמה חסרונות ומגבלות. ראשית, הרבה מיני פטריות הם בצמיחה איטית. צמיחה של מושבות גלויות על תקשורת מוצקה יכולה לקחת 1-2 שבועות, להאט את קצב המחקר באופן משמעותי. שנית, מניפולציה של דגימות במהלך ציפוי CFU היא תהליך מייגע, שכן כמה דילולים חייבים להיות מצופה על מנת להבטיח מספר מנייה של מושבות. שלישית, מספר CFU הוא בדרך כלל נמוך יותר ממספר אורגניזמים קיימא מצופים בגלל יעילות הציפוי היא גם מתחת ל -100%. לדוגמה, ביעילות ציפוי לcapsulatum Histoplasma הפתוגן פטרייתי דימורפית יכולה להיות גבוהה ככל 90%, אך באופן שגרתי הן נמוכות כמו30% והם נמוכים אף יותר (10%) לdimorph brasiliensis הקשור פטרייתי Paracoccidioides 1, 2. ציפוי יעיל לקנדידה אלביקנס כפוף גם לשונות 3. לבסוף, ניתוח CFU מהווה רק תאי חיים ופעילים המסוגלים חלוקת ביסוס צמיחה על תקשורת מוצקה, ואילו במצבים רבים, זה יהיה שימושי כדי לקבוע את הנוכחות והריכוז של תאים מתים שאינם פעילים ו / או חילוף חומרים. בעבר, שיטות תזרים cytometric לכימות של כמה מיני פטריות פתוגניים תוארה 4-6. עם זאת, בשל בעיות בלימת biosafety מעורבות עם השימוש בפתוגנים BSL3 ברמת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2) או על cytometers זרימה משותף, האימוץ של טכניקה זו היה מוגבל. כמו cytometry הזרימה, cytometry התמונה הוא שיטה רגישה ומהירה של תא כימות. עם זאת, ניתן לבצע cytometry תמונה בכל חלק של העלות עם תוצאות דומות 7 -11. כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע cytometry תמונה של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח. אנו מדגימים את השיטות שלנו באמצעות שני פתוגנים פטרייתי אדם: capsulatum Histoplasma וקנדידה אלביקנס ח&#39;. capsulatum הוא פתוגן פטרייתי דימורפית שגורם למחלות בדרכי הנשימה, בבני אדם, שהוא גדל שמרי ניצנים וכמשכפל בתוך מקרופאגים מכתשיים קנדידה אלביקנס הוא מין commensal אדם שלעתים גורם לקנדידה.. אנו מראים כי cytometry התמונה מאפשרת כימות מהירה של שמרים אלה, יחד עם יכולת הדמיה.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI Solution</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CSK-0102</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירה חד פעמי</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">< חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Software</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

מחקרים של מנגנוני פתוגנזה הסלולר של שמרים פתוגניים כגון קנדידה אלביקנס, capsulatum Histoplasma, וneoformans Cryptococcus להעסיק זיהום של מארחים יונקים או תאים מארחים (כלומר מקרופאגים) ואחריו כימות שמרים באמצעות מושבה להרכיב יחידת ניתוח או cytometry זרימה בדרך כלל. בעוד ספירת יחידת המושבה להרכיב כבר את השיטה הנפוצה ביותר בתחום, יש לו טכניקה זו חסרונות ומגבלות, כולל צמיחה איטית של כמה מיני פטריות על תקשורת מוצקה ויעילות ציפוי נמוכה ו / או משתנה, וזה מדאיג במיוחד כאשר משווה צמיחה של זני הבר מסוג והמוטציה. cytometry הזרימה יכול לספק מידע כמותי לגבי כדאיות שמרים מהיר, לעומת זאת, האימוץ של גילוי תזרים cytometric לשמרים פתוגניים היה מוגבל למספר סיבות מעשיות הכולל עלות הגבוהה שלה ושיקולי biosafety. הנה, אנחנו מדגימים מבוססי תמונההמתודולוגיה cytometric באמצעות חזון Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) לכימות של שמרים פתוגניים קיימא בשיתוף התרבות עם מקרופאגים. המחקרים שלנו להתמקד בזיהוי של שני פתוגנים פטרייתי אדם: capsulatum Histoplasma וקנדידה אלביקנס ח&#39;. capsulatum colonizes מקרופאגים מכתשיים ידי שכפול בתוך phagosome מקרופאג, והנה, אנו כמותית להעריך את הצמיחה של ה שמרי capsulatum ב264.7 מקרופאגים RAW באמצעות acridine כתום / מכתים יודיד propidium בשילוב עם cytometry תמונה. השיטה שלנו בנאמנות מגמות צמיחה כפי שהיא נמדדת על ידי משחזרת מושבה מסורתית ויצרה ספירת יחידה, אבל עם רגישות מוגברת באופן משמעותי. בנוסף, אנו ישירות להעריך זיהום של מקרופאגים לחיות עם זן ה-GFP-לבטא של ג אלביקנס. המתודולוגיה שלנו מציעה אמצעי מהיר, מדויק וחסכוני לאיתור וכימות של פתוגנים פטרייתי אדם חשובים בשנינות העמותהתאי מארח h.

אנחנו השתמשנו cytometer תמונת חזון Cellometer לפקח צמיחה של ה capsulatum בתאי macrophage. 264.7 תאי RAW היו נגועים בח&#39; תאי שמרי capsulatum ובנקודות זמן שונים, דגימות היו נתונים לצביעת AO / PI ואחרי ניתוח cytometric מבוסס תמונה. במקביל, דגימות נותחו על ידי ספירת CFU מסורתית. בכל נקודת זמן, דגימות הודגרו במים לlyse מקרופאגים, ותאי השמרים המשוחררים זוהו על ידי תוכנת חזון Cellometer (1A ו-1B דמויות). אנו רואים מגמות דומות מאוד בריכוז של ...

הנה, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בcytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח בתרבות. טכניקה זו יכולה לשמש כאלטרנטיבה לספירת CFU.

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת שמרים פתוגניים באסוציאציה עם תאי מאכסן ללא זריעה של יחידות יוצרות מושבות (colony forming units). ראשית, מדביקים את תאי המקרופאג בתאי שמרים של H capsulation או C albicans, ולאחר מכן צובעים את תאי המקרופאג המודבקים ב-aine orange ובפרופידיום יודיד כדי להדגיש תאי שמרים חיוניים. לאחר מכן, באמצעות ציטומטר דימוי (imaging cytometer), לוכדים סדרה של תמונות ומנתחים את פרמטרי הגודל והצורה כדי לספור במדויק את תאי השמרים.ניתן להשתמש ביעילות בתוצאות מציטומטריה של תמונות כדי לכמת שמרים פתוגניים בקשר עם תאי מאכסן. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה במהלך מחקר בתחום הפתוגנזה הפטרייתית, שבו נאלצתי לזרוע ולספור שוב ושוב יחידות יוצרות מושבות (CFU) לצורך כימות של הפטרייה הפתוגנית Histoplasma capsulatum. היתרון העיקרי של ציטומטריה של תמונות על פני השיטה הסטנדרטית של ספירת CFU הוא המהירות המוגברת, שכן היא מבטלת את השלבים התובעניים מבחינת עבודה וזמן של זריעה, דגירה וספירה של מספר דילולים סדרתיים של CFU בעת השוואת גדילה של זני בר וזנים מוטנטים בתוך תאי מאכסן.שיטה זו מבטלת את ההטיה הפוטנציאלית הנובעת מיכולות שונות ליצירת גדילה איכותית על מצעים מוצקים. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עשויים להתקשות עם הציוד, התוכנה והציטומטריית התמונה.התחל את הפרוצדורה על ידי גידול המקרופאגים בצפיפות הרצויה. בלוחות של 24 בארות, הוסף את תאי הפטרייה הנמצאים בשלב גדילה לוגריתמי, ולאחר מכן הדגר למשך 90 דקות כדי לאפשר פגוציטוזה. לאחר מכן, שטוף את המקרופאגים שלוש פעמים ב-PBS כדי להסיר את הפטריות החוץ-תאיות; הדגר עבור נקודות הזמן שהוגדרו בניסוי לפני ניתוח הדגימות. בריבוי זיהומים נמוך, תאי המקרופאגים המזוהמים נותרים חיוניים למשך מספר ימים, וניתן לנתח את הדגימות בערך כל 12 עד 24 שעות.לאחר שלושה שטיפות ב-PBS, הוסף 0.5 milliliters של מים סטריליים לתאי המקרופאג הזוהים. הדגר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחרר את הפטריות מתאי המקרופאג. לאחר מכן, אסוף את הליזט לשפופרת סטרילית ושמור על קרח.העבר 20 µL מהליזט למבחנה נפרדת. הוסף 20 µL של תמיסת aine orange propidium iodide לצורך ניתוח ציטומטרי מיידי. בצע דילול של פי עשרה של הליזטים במדיום.לאחר מכן, העבירו 100 µL מכל מהילה בדוכמיות (duplicate) לצלחות HMM agar. דגרו את הצלחות בתא לחות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך שבעה עד שמונה ימים.ספרו ידנית את המושבות על הצלחות, כך שיוצגו לפחות 100 ולכל היותר 1000 מושבות נפרדות. כדי לאסוף את המקרופגים החיים, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters של PBS והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.הסר את המקרופאגים מבחורי תרבית הרקמה באמצעות פיפוט עדין. העבר את הנוזל למבחנה סטרילית ושמור על קרח. כדי להכין את מכשיר האקסלרומטר, הכנס את מודולרי האופטיקה הפלואורסצנטית למערכת וודא שהם נעולים במקומם.הפעל את ציטומטר התמונה בתפריט הנפתח של הבדיקות (assay) בתוכנה. בחר את סוג הבדיקה והסוג התא המוגדרים מראש לבדיקת חיוניות (viability). הבדיקה עברה אופטימיזציה לזיהוי acridine orange ו-propidium iodide לצורך זיהוי זיהום ב-Candida albicans.הבדיקה מותאמת לזיהוי GFP. כעת פתחו את לשונית האפשרויות ולחצו על take background image. לאחר השלמת הפעולה, לחצו על preview brightfield image עבור מדידת חיוניות A OPI. ערבבו 20 µL של דגימה עם 20 µL של A OPI והעבירו בפיפט לתא ספירה לצורך קביעת שיעור הזיהום של *Candida albicans*.ערבבו היטב את הדגימה והעבירו אותה בפיפט ישירות לתא הספירה. לאחר שהתאים שקעו בתא, הכניסו את תא הספירה לציטומטר התמונה לצורך רכישת תמונה. הגדירו פוקוס לדגימה, ולאחר מכן לחצו על count.עם השלמת פעולת רכישת התמונה, הסר את תא הספירה החד-פעמי והשליכו אותו באופן 적ום. עבור מדידת A OPI, תוצאות הריכוז והחיוניות מוצגות בדף תוצאות הספירה כדי לקבוע את שיעור הזיהום ב-candida albicans. לאחר קבלת תוצאות הספירה, לחץ על export.לאחר מכן, העבירו את הנתונים ל-FCS express 4 לצורך ניתוח אוכלוסיות תאים של GFP. ב-FCS express, ייבאו את קובץ הנתונים והציגו את התוצאות בהיסטוגרמת פלואורסצנציה. לאחר מכן, החילו gate (שער) לאוכלוסיות תאים על ההיסטוגרמה כדי לקבוע את אחוזי האוכלוסיות של תאים שהודבקו ב-candida albicans.ניסוי זה עוקב אחר צמיחתם של תאי מקרופאג שהודבקו בשמרים מסוג hcaps Lotum בנקודות זמן מוגדרות. הדגימות נצבעות ומנותחות באמצעות ציטומטריית תמונה. תאי השמרים ששוחררו מהמקרופאגים המודבקים מזוהים על ידי תוכנת Soter vision.כאן, המספר המוחלט של תאי שמרים חיים שזוהו גבוה יותר ממספר השמרים המסוגלים ליצור מושבות על מצע מוצק. נתונים אלו מדגישים את נוכחותם של מספרים משמעותיים של תאים חיוניים, אך שאינם ניתנים לגידול בתרבית. מקרופאגים אלו, שהופקו ממח עצם, הוחדרו בתאי שמרים של *C. albicans* המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק תחת בקרתו של הקידום A DH one.ריבוי זיהומים (MOI) בטווח של 0.1 עד 10 הוביל לעליות הדרגתיות בעוצמת ה-GFP בתוך מקרופאגים מזוהמים, וכן באחוז הכולל של מקרופאגים מזוהמים. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה תוך דקות ספורות לדגימה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגדיר את הפרמטרים כך שרק תאי פטרייה ייספרו, ולא תאי המאחסן.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בציטומטריית תמונה לכימות שמרים פתוגניים בקשר עם תאי מאכסן. זכרו כי עבודה עם פטריות פתוגניות עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן יש להשתמש בציוד מיגון אישי ולפעול לפי נהלי הפינוי הנכונים של פסולת ביו-סיכונית.

use-image-cytometry-for-quantification-pathogenic-fungi-association

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים שיטה לכימות הפאגוציטוזה של נבגי פטריות פתוגניים המסומנים בתווית FITC על ידי לויקוציטים אנושיים. נבגים פגוציטוזים מובחנים מנבגים הנצמדים לתאים באמצעות צביעה נגדית, ולאחר מכן ניתוח ציטומטרי של זרימה.

מדידה ציטומטרית של זרימה כמותית של פגוציטוזה של נבגים פטרייתיים על ידי פגוציטים אנושיים

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להעריך פעילות אנטי-פטרייתית של תאי מערכת חיסון אנושיים עיקריים בזמן אמת באמצעות נבגי כתב ניאון אספרגילוס בשיתוף עם מיקרוסקופ וידאו חי התאים cytometry זרימה. נתונים המופקים לספק תובנה אינטראקציות אספרגילוס cell- מארח כגון פעילות קוטלת פטריות, phagocytosis, נדידת תאים ועיכוב של גידול פטרייתי.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

כאן נתאר פרוטוקול כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאתי בעכברים עם aspergillosis פולשנית באמצעות כימות של כסף methanamine שונה של Gomori מכתים בסעיפים היסטולוגית. השימוש בשיטה זו הביאה תוצאות דומות עם פחות בעלי חיים לעומת הערכה של הנטל פטרייתי מאת PCR כמותי של ריאות פטרייתית דנ א.

כימות היסטולוגית כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאות ב Aspergillosis ניסיוני

נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

אנו מתארים פרוטוקול ניצול הקרינה היברידיזציה באתרו (דג) כדי להמחיש RNAs מרובים של הרפס בתוך תאים אנושיים נגועים ליקיה, או בהשעיה או חסיד. פרוטוקול זה כולל כימות של זריחה המייצרת יחס נוקלאוציטוסמטי וניתן להארכה להדמיה סימולטני של חלבונים מארחים ונגיליים עם immunofluorescence (IF).

פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV

מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש את הצורה של קנדידה אלביקנס תא ולוקליזציה במערכת העיכול היונקים.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואמינה כדי לכמת את phagocyציטוזה של אספגינוס באמצעות הפגוציטים הגוף האנושי באמצעות הזרימה cy, try ולהפלות את הפגוציטוזה של המחט מתוך הדבקה ללוקוציטים בלבד.

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

צבעי פלורסנט חיוניים הם כלים חיוניים לניתוח הדמיה של תא חי בביולוגיה מודרנית של תאים פטרייתיים. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט ידוע פחות ידועים עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-/אקסוציטוזה וקיר התא מורגנזה בפטריות filamentous.

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

אנו מציגים שיטה, המשתמשת בגישת ניתוח תמונות מבוססת שטח הניתנת להכללה כדי לזהות את ספירת התאים. ניתוח של אוכלוסיות תאים שונות ניצל את ההבדלים המשמעותיים בגובה התא ובמבנה בין סוגי תאים שונים בתוך אלגוריתם אדפטיבי.

אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים

למדו כיצד לכמת פטריות פתוגניות בשיתוף עם תאי מארח באמצעות ציטומטריית תמונה. שיטה זו מציעה חלופה מהירה ויעילה למניית יחידות יוצרות מושבות CFU במחקר פתוגנזה פטרייתית.

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

גלה סרטונים נוספים