שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת שמרים פתוגניים בשילוב עם תאים מארחים מבלי לצפות יחידות יוצרות מושבה. ראשית, הדביקו את תאי המקרופאגים עם קפסולציית H או תאי שמרים אלביקנס C צובעים את תאי המקרופאגים הנגועים בתפוז איין ופרופידיום יודיד כדי להדגיש תאי שמרים ברי קיימא. לאחר מכן, באמצעות ציטומטר הדמיה, צלם סדרה של תמונות ונתח את פרמטרי הגודל והצורה כדי לספור במדויק את תאי השמרים.

ניתן להשתמש ביעילות בתוצאות מציטומטריית תמונה כדי לכמת שמרים פתוגניים בשיתוף עם תאים מארחים. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כאשר ערכתי מחקר בתחום הפתוגנזה הפטרייתית, שבו הייתי צריך לספור שוב ושוב יחידות יוצרות מושבה לכימות קפסולת היסטופלזמה הפטרייה הפתוגנית. היתרון העיקרי של ציטומטריית תמונה על פני השיטה הסטנדרטית של ספירת CFU הוא המהירות המוגברת שלה מכיוון שהיא מבטלת את השלבים עתירי העבודה והזמן של ציפוי, דגירה וספירת דילולים סדרתיים מרובים של CFU כאשר משווים גידול של זנים מסוג בר וזנים מוטנטיים בתוך תאים מארחים.

שיטה זו מבטלת את ההטיה הפוטנציאלית הנוצרת על ידי יכולות שונות ליזום צמיחה איכותית על מדיה מוצקה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיות מאותגרים על ידי ציטומטריית התמונה. מכשור ותוכנה.

התחל את ההליך על ידי תרבית המקרופאגים בצפיפות הרצויה. ב-24 צלחות באר מוסיפים את תאי הפטרייה בצמיחה בשלב היומן, ואז דוגרים למשך 90 דקות כדי לאפשר פגוציטוזיס. לאחר מכן, שטפו את המקרופאגים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הדגירה של הפטריות החוץ-תאיות לנקודות הזמן שהוגדרו בניסוי לפני ניתוח הדגימה בריבוי נמוך של זיהום, תאי המקרופאגים הנגועים נשארים ברי קיימא במשך מספר ימים, וניתן לנתח דגימות בערך כל 12 עד 24 שעות.

לאחר שלוש שטיפות עם PBS, הוסף 0.5 מיליליטר מים סטריליים לתאי המקרופאגים הנגועים. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחרר את הפטריות מתאי המקרופאגים. לאחר מכן קצרו את הליזאט לצינור סטרילי ושמרו על קרח.

העבירו 20 מיקרוליטר מהליזאט לצינור נפרד. הוסף 20 מיקרוליטר תמיסת יודיד פרופידיום כתומה לניתוח ציטומטרי מיידי של תמונה. בצע דילול פי עשרה של הליזטים במדיה.

לאחר מכן צלחת 100 מיקרוליטר מכל דילול בשכפול. על צלחות HMM aros. דגרו את הצלחות בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שבעה עד שמונה ימים.

ספור ידנית מושבות על הצלחות, ומציג מינימום של 100 ומקסימום 1000 מושבות נפרדות. כדי לאסוף את המקרופאגים החיים, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן מוסיפים 0.5 מיליליטר PBS ודוגרים למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את המקרופאגים מבארות תרבית רקמות על ידי פיפטינג עדין. מעבירים את הנוזל לצינור סטרילי ושומרים על קרח. כדי להגדיר את מכשיר מד התאוצה, הכנס את מודולי האופטיקה הקרינה למערכת וודא שהם נעולים במקומם.

הפעל את ציטומטר התמונה בתפריט הנפתח של הבדיקה של התוכנה. בחר את סוג הבדיקה וסוג התא שנקבעו מראש עבור כדאיות. הבדיקה מותאמת לזיהוי כתום ופרופידיום יודיד לזיהוי זיהום קנדידה אלביקנס.

הבדיקה מותאמת לזיהוי GFP. כעת פתח את לשונית האפשרויות ולחץ על צלם תמונת רקע לאחר השלמת הפעולה, לחץ על תצוגה מקדימה תמונת שדה בהיר למדידת כדאיות OPI. מערבבים 20 מיקרוליטר דגימה עם 20 מיקרוליטר של A OPI ופיפטה לתוך תא הנהלת חשבונות לשיעור זיהום קנדידה אלביקנס.

מערבבים היטב את הדגימה ומכניסים אותה ישירות לתא הספירה. לאחר שהתאים התיישבו בתא, הכנס את תא הספירה לתוך ציטומטר התמונה לרכישת תמונה. הבא את הדגימה למיקוד ולאחר מכן לחץ על ספירה.

לאחר השלמת פעולת רכישת התמונה, הסר את תא הספירה החד פעמי והשליך אותו כראוי. עבור מדידת OPI, תוצאות הריכוז והכדאיות מוצגות בדף תוצאות הספירה כדי לקבוע את שיעור ההדבקה בקנדידה אלביקנס. לאחר קבלת תוצאות הספירה, לחץ על ייצוא.

לאחר מכן שלח את הנתונים ל-FCS express four לניתוח אוכלוסיית התאים של GFP. ב-FCS express, ייבא את קובץ הנתונים והתווה את התוצאות בהיסטוגרמה פלואורסצנטית. לאחר מכן, החל שער אוכלוסיית תאים על ההיסטוגרמה כדי לקבוע את אחוזי האוכלוסייה של תאים נגועים בקנדידה אלביקנס.

ניסוי זה עוקב אחר צמיחה של תאי מקרופאגים הנגועים בשמרי hcaps Lotum בנקודות זמן מוגדרות. הדגימות מוכתמות ומנותחות על ידי ציטומטריה מבוססת תמונה. תאי השמרים המשוחררים ממקרופאגים שרוכים מזוהים על ידי תוכנת הראייה של סוטר.

כאן, המספר המוחלט של שמרים חיים שזוהו גדול משמרים המסוגלים להיווצר מושבה על תווך מוצק. נתונים אלה מדגישים את נוכחותם של מספר משמעותי של תאים ברי קיימא, אך לא ניתנים לגידול. מקרופאגים אלה שמקורם במח עצם נדבקו בתאי שמרים אלביקניים C המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק תחת שליטת מקדם A DH one.

ריבוי זיהומים שנע בין 0.1 ל-10 הביא לעלייה מצטברת בעוצמת ה-GFP בתוך מקרופאגים נגועים, כמו גם לאחוז הכולל של מקרופאגים נגועים לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך דקות ספורות לכל דגימה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגדיר את הפרמטרים כך שרק תאים פטרייתיים שאינם תאים מארחים ייספרו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בציטומטריית תמונה כדי לכמת שמרים פתוגניים בשיתוף עם תאים מארחים. אל תשכח שעבודה עם פטריות פתוגניות עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן ללבוש ציוד מגן אישי ולעקוב אחר נהלי פינוי פסולת ביולוגית נאותים.