Name: Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: למדו מיקרו-הזרקה סטריאוטקטית של וקטורים ויראליים המביעים Cre recombinase כדי לחקור את תפקידם של גנים בהעדפות מקום מותנות קוקאין בעכברים. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של מנגנוני התמכרות ותגמול במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לאנני לי ומורין בירן על עזרתם בהקמת פרוטוקול העדפת המקום המותנה הממושך.

כל ההליכים מתבצעים בהתאם לטיפול Weill Cornell Medical College בבעלי החיים המוסדי וכללי ועדת שימוש. 1. הכנה והתקנה עבור משלוח Stereotaxic של וקטורים ויראליים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מכשיר, ספוגית סטרילית, או יד לובשת כפפה סטרילית מזוהם באים במגע עם משטח שאינו סטריליים, לבטל או לעקר מחדש את המכשיר באמצעות מעקר חרוז חם, לבטל או לשנות את ספוגית לכפפות סטריליות חדשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב כלוב עכבר עם מצעים על גוש חום כדי לחמם להחלמה שלאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מכונת גילוח חשמלית לגילוח הראש ואתנול ויוד לחיטוי הקרקפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את סורגי אוזן ולהחזיק את הפה של stereotax עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק המילטון 5 μl, לצייר עד 5 μl של וקטור ויראלי (1 x 10 6 / μl חלקיקים נגיפיים) ולהקים בבעל מזרק בstereotax. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרית חימום במיקרוגל או להפוך כרית חשמלית עלמקום שני בstereotax. לכסות עם כרית סופגת נקיות כדי להפחית את הסיכון לכוויות. צג טמפרטורת גוף עכבר (שבין 97-99.5 מעלות פרנהייט) בתדירות גבוהה לאורך כל הליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק עכבר (במשקל של בין 22-35 g) בתערובת של קטמין (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג) וxylazine (20 מ&quot;ג / ק&quot;ג). ברגע שעכבר הוא מורדם, קצה זנב קמצוץ כדי לבדוק את הרפלקסים של העכבר ושים לב כל תנועה או תגובה על מנת להבטיח שהעכבר הוא מורדם כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הראש בין אוזניים ועיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את הראש מגולח עם לסירוגין applicators כותנה סטריליים אתנול ויוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר למשטח מחומם בstereotax. </li></ol> 2. Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללבוש כפפות סטריליות במהלך הניתוח. אם כפפות מזוהמות בכל נקודה על ידי נגיעה משטחים שאינם סטריליים, לשנות את הכפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בר שן אפס קשקשים ואוזן בר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר שיניים בבר שן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורג בפרצופו. אם נענוע או מהלך זיףment יצוין, בכל עת, לנהל חיסון דחף IP (~ 0.05 סמ&quot;ק) מתערובת של קטמין (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג) וxylazine (20 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורג בברים אוזניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמן את העיניים עם PuraLube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקרקפת פתוחה לממש מאחורי אוזניים עם אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפים בולדוג מקום בפינות של הקרקפת כדי לקלף את העור מהגולגולת. גבחת ומבדה צריכה להיות גלויה לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תפר בטוח מגבחת למבדה מיושרת ישר. אם התפר הוא מיצוב להסתגל עקום של הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו כדי לוודא שכל ההגדרות בstereotax הם התביית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מחט קצה במקום בגבחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את כל הקואורדינטות עבור שניהם גבחת ולמבדה. זה כולל קואורדינטות גב / הגחון, המדיאלי / לרוחב וקדמית / אחורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הראש עד שקואורדינטות הגחון לגבחת ומבדה נמצאות ב0.02 מ&quot;מ של כל אחד אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמיושר, מגבחת הולכים מדיאלית החוצה לקואורדינטות המדיאלי / רוחב (מ &#39;/ ל&#39;). לוודאהצדדים ימני והשמאליים מיושרים בתוך 0.02 מ&quot;מ של כל אחד אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצה מחט מחדש מרכז בגבחת ומשם לנוע בכיוון הקדמי / אחורי (/ P) כדי לתאם הקדמי / אחורי הרצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מחט צורך, זווית בכיוון אחד ולוודא stereotax נעול. לצאת לM / L לתאם השמאלי (+ / - 1.52) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את עמדת הגחון של החלק העליון של הגולגולת להשתמש כהפניה לאחר הקידוח הוא קדח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח קידוח באמצעות מקדח סטרילי בקואורדינטות הרצויה. בדקו שהמחט יכולה להיכנס ללא הפרעה דרך הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את המחט לקואורדינטות הגחון הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוא הגיע לתאם, לטבול 0.015 מ&quot;מ מתחת ל~ 10 שניות כדי ליצור כיס קטן לוקטור ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את הנפח הרצוי של וקטור ויראלי בשיעור של 0.1 ~ μl / דקה. לחכות 3 דקות לוקטור ויראלי לנטרל לחלוטין. הרם את קצה מחט מ&quot;מ 0.015 ולחכות 2 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">טובלים את המחט (אם עושה זריקות זווית) בכיוון ההפוך. שוב, להקליט את מיקום הגחון כהתייחסות לחלק העליון של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותם השלבים כמו בצד הראשון להזריק וקטור ויראלי בצד השני (אם עושה זריקות דו צדדיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שעוות עצם לשני החורים כדי לאטום אותם באמצעות סוף העץ של קצה מוליך כותנה סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את הקרקפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בלוק עצבי לאזור הפגוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העכבר מstereotax ומקום בכלוב בחום לחסום חימם להתאושש במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקוב אחר סימנים של כאב, כולל: ירידה בפעילות כללית או חוסר מנוחה, ירידה בצריכת מזון ומים או ניקוד מוגבר. יכולות להינתן פעמיים ביום במשך שבוע במידת צורך לכאב - עצירות (0.2 מ&quot;ג / ק&quot;ג 0.05). חלופות מקובלות כוללות: meperidine (20-60 מ&quot;ג / ק&quot;ג), סחרחורת (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג), nalbuphine (4-8 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li></ol> 3. העדפות מקום אוויר: Acquisition, הכחדה, והחזרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי מקום לחדר המרכזי של מנגנון העדפת מקום השלוש קאמרי (מד Associates Inc, סנט אלבנס, ורמונט, ארה&quot;ב) לתקופה של 60 שניות הרגלה עם דלתות סגורות הגיליוטינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התרגלות, דלתות הגיליוטינה פתוחות ולאפשר חיפושי עכברים ללא כל 3 התאים ל1,200 שניות, עם זמן מושקע בכל תא שהוקלט באמצעות התוכנה הרביעית MedPC (מד Associates, Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצאת עכברים לתאי מיזוג המבוססים על הביצועים שלהם במהלך המבחן מראש. באמצעות עיצוב, תרופות צמד מוטות במהלך 3 ימים שלאחר מכן עם התא שהיה הכי פחות מועדף במבחן מראש תחילת המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימי מיזוג 3 הבאים, להזריק עכברים עם קוקאין (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג; IP) במהלך ישיבת הבוקר ולהגביל אותם בחדר שהוקצה להם ל1,200 שניות מייד לאחר ההזרקה. להחזיר עכברים לכלובים בביתם לאחר הפגישה. לאחר 4 שעות, להזריק עכברים עם מי מלח (0.01 מ&quot;ל / גרםמשקל גוף) ולהגביל אותם לתא ההפוך למושב 1,200 שניות אחר הצהריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק לרכישה, עכברי מקום בתא המרכזי עם דלתות הגיליוטינה נסגרו לתקופה התרגלות שנייה 60. הגיליוטינה דלתות פתוחות ולאפשר חקירה ללא תשלום עבור 1,200 שניות, עם זמן מושקע בכל התאים שתועדו על ידי התוכנה הרביעית MedPC (מד Associates, Inc). חישוב העדפה על ידי הפחתת כמות הזמן שבילתה בתא מלוחים לזווג מכמות הזמן שבילתה בתא קוק לזווג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכבות את העדפת המקום, תחשוף עכברים לשני מפגשי 20 דקות של חיפושים חופשיים יומי באותו המנגנון, מופרדים על ידי לפחות 2 שעות, 24 שעות לאחר תחילת המבחן לרכישה. שוב המשך זמן בכל התאים צריך להיות מוקלט וסדר הגודל של CPP הראשוני צריך להיות בהשוואה לזה של כל מושב הכחדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אם עכברים כיבו את העדפת תוצאת משימוש בסמים על ידי בחינת האם העדפת נקובקאמרי ticular על פני יומיים רצופים הכחדה הוא נמוך באופן משמעותי בהשוואה לציון העדפת הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר עכברים עם מנה תחול בקוקאין (5 או 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג; IP) ולחשוף מחדש למנגנון המאפשר חקירה החופשית ולהקליט את משך זמן בכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל פתרון המתת חסד Euthasol (150 מ&quot;ג / ק&quot;ג). Transcardially perfuse עכברים עם paraformaldehyde 4% (PFA) ולבצע בדיקה היסטולוגית כדי לאמת את מיקום microinjection נכון. </li></ol>

<ol><li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+neurobiology+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+on+Addictions%22%5BJournal%5D)">Molecular neurobiology of addiction.</a> American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).</li>
<li>Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroplasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system+and+cocaine+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction.</a> British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).</li>
<li>Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. S., Badiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+induction+or+expression+of+psychostimulant+sensitization+by+the+circumstances+surrounding+drug+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modulation of the induction or expression of psychostimulant sensitization by the circumstances surrounding drug administration.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (2), (1998).</li>
<li>Tzschentke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reward+with+the+conditioned+place+preference+%28CPP%29+paradigm%3A+update+of+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade.</a> Addiction Biology. 12 (3-4), (2007).</li>
<li>Mueller, D., Stewart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+conditioned+place+preference%3A+reinstatement+by+priming+injections+of+cocaine+after+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction.</a> Behavioural Brain Research. 115 (1), (2000).</li>
<li>Itzhak, Y., Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+conditioned+place+preference+in+mice%3A+Induction%2C+extinction+and+reinstatement+by+related+psychostimulants%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants.</a> Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).</li>
<li>Kreibich, A. S., Blendy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+response+element-binding+protein+is+required+for+stress+but+not+cocaine-induced+reinstatement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement.</a> Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).</li>
<li>Obrien, C. P., Childress, A. R., McLellan, T., Ehrman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+systematic+cue+exposure+with+standard+treatment+in+recovering+drug+dependent+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Addictive+Behaviors%22%5BJournal%5D)">Integrating systematic cue exposure with standard treatment in recovering drug dependent patients.</a> Addictive Behaviors. 15 (4), (1990).</li>
<li>O'Brien, C. P., Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+learning+model+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Research+publications+-+Association+for+Research+in+Nervous+and+Mental+Disease%22%5BJournal%5D)">A learning model of addiction.</a> Research publications - Association for Research in Nervous and Mental Disease. 70, (1992).</li>
<li>Stewart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+and+neural+mechanisms+of+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Psychological and neural mechanisms of relapse.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363 (1507), (2008).</li>
<li>Bueler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno+associated+viral+vectors+for+gene+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Adeno associated viral vectors for gene transfer and gene therapy.</a> Biological Chemistry. 380, (1999).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., McCown, T. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+by+adeno-associated+virus+vectors+into+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system.</a> Experimental Neurology. 144 (1), (1997).</li>
<li>Alexander, I. E., Russell, D. W., Spence, A. M., Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+gamma+irradiation+on+the+transduction+of+dividing+and+nondividing+cells+in+brain+and+muscle+of+rats+by+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effects of gamma irradiation on the transduction of dividing and nondividing cells in brain and muscle of rats by adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (7), (1996).</li>
<li>Schierberl, K., Hao, J., Tropea, T. F., Ra, S., Giordano, T. P., Xu, Q., Garraway, S. M., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Inturrisi, C. E., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%28v%291.2+L-Type+Ca2%2B+Channels+Mediate+Cocaine-Induced+GluA1+Trafficking+in+the+Nucleus+Accumbens%2C+a+Long-Term+Adaptation+Dependent+on+Ventral+Tegmental+Area+Ca%28v%291.3+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).</li>
<li>Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%28v%291.3+L-type+Ca2%2B+channels+mediate+long-term+adaptation+in+dopamine+D2L-mediated+GluA1+trafficking+in+the+dorsal+striatum+following+cocaine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure.</a> Channels. 6 (1), 11-17 (2012).</li>
<li>Nestler, E. J., Bergson, C. M., Gultart, X., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neural+gene+expression+in+opiate+and+cocaine+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22NIDA+Research+Monograph%22%5BJournal%5D)">Regulation of neural gene expression in opiate and cocaine addiction.</a> NIDA Research Monograph. 125, (1993).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction+and+the+brain%3A+The+neurobiology+of+compulsion+and+its+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Addiction and the brain: The neurobiology of compulsion and its persistence.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (10), (2001).</li>
<li>Lee, A. S., Ra, S., Rajadhyaksha, A. M., Britt, J. K., De Jesus-Cortes, H., Gonzales, K. L., Lee, A., Moosmang, S., Hofmann, F., Pieper, A. A., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+elimination+of+cacna1c+mediates+anxiety-like+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice.</a> Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).</li>
<li>Li, X., Wolf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+virus-infected+brain+regions+using+a+GFP-illuminating+flashlight+enables+accurate+and+rapid+dissection+for+biochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).</li>
<li>Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+Cre-recombinase+to+neurons+in+vivo+and+stable+transduction+of+neurons+using+adeno-associated+and+lentiviral+vectors+-+art.+no.+5%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors - art. no. 5.</a> BMC Neuroscience. 5, (2004).</li>
<li>Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+effectively+mediates+conditional+gene+modification+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2320-2325 (2002).</li>
<li>Neve, R. L., Neve, K. A., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+herpes+virus+amplicon+vectors+to+study+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of herpes virus amplicon vectors to study brain disorders.</a> Biotechniques. 39 (3), 9(2005).</li>
<li>Pohl, M., Braz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+pain%3A+emerging+strategies+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions.</a> European Journal of Pharmacology. 429 (1-3), (2001).</li>
<li>Rinaldi, A., Marshall, K. R., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-cytotoxic+herpes+simplex+virus+vector+which+expresses+Cre+recombinase+directs+efficient+site+specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination.</a> Virus Research. 65 (1), (1999).</li>
<li>Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+hybrid+serotypes%3A+Improved+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery.</a> Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).</li>
<li>Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+delivery+of+CLN2+reduces+brain+pathology+in+a+mouse+model+of+classical+late+infantile+neuronal+ceroid+lipofuscinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).</li>
<li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses+-+normal+integration+does+not+require+viral+gene-expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses - normal integration does not require viral gene-expression.</a> Journal of Virology. 63 (9), (1989).</li>
<li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene-expression+and+phenotypic+correction+using+adenoassociated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), (1994).</li>
<li>Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+activation+of+lateral+amygdala+pyramidal+cells+instructs+associative+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).</li>
<li>Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

אזורי ואבלציה גן temporally הספציפית באמצעות microinjection stereotaxic של וקטורים ויראליים בשילוב עם CPP הכולל הכחדה ושלבי כינון מאפשרת חקירה של התרומות הספציפיות של גנים לשלושה שלבים ברורים של התנהגות דמוית ממכרת. בעוד נוקאאוט המותנה שמושג תוך ניצול מערכת Cre-LoxP המסורתי מספק למרחב באופן זמני, אבלציה הגן מוגבל, stereotaxically microinjecting Cre-recombinase לאזורים במוח של עכברים בדידים floxed מאפשר שליטה חזקה עוד יותר של מתי והיכן גן בנוקאאוט. בנוסף, זה עוקף את האפשרות של שינו...

קוקאין הוא psychostimulant מאוד מחזק. בעקבות חשיפה חוזרת ונשנית, כמה עיבודים מולקולריים ותאיים מתרחשים בפרס רלוונטי-מעגלי מוח שהם האמינו לגרום כפייתיים סמים התנהגות חיפוש, מה שגרם שיעור גבוה של הישנות אשר מהווה בעיה רצינית 1 קלינית. קוקאין מפעיל השפעות התנהגותיות ארוכת טווח אלה על ידי ויסות ביטוי גנים. כדי ללמוד את ההתאמות הנובעות משימוש בקוק כרוני, היו בשימוש נרחב במודלים של מכרסמים פרה. מודל אחד כזה הוא העדפת פרדיגמה המקום מותנה (CPP). מודל זה כולל את הפיתוח של עמותה למדה בין סביבה ניטראלית בעבר ואת המאפיינים המתגמלים של קוקאין. לאחר כמה זיווגים של קוקאין בחדר מסוים, בעלי חיים מותר לחקור בחופשיות את סביבת קוק לזווג ולא קוק לזווג ואם הם מעדיפים את תא סמים לזווג, הם אמרו שרכשו plac קוקאין-Inducedהעדפת דואר. יתר על כן, לאחר תקופת הכשרת הכחדה, יכולה לשמש פרדיגמה זו כדי ללמוד כינון הקשר ספציפי של שוחרת קוקאין התנהגות. בהשוואה לדגמים אחרים של התנהגות כמו התנהגות ממכרת, כגון רגישות פסיכומוטורי, המשמש למחקר ארוך טווח התנהגות מושרה קוקאין ופלסטיות מולקולרית 2,3 וממשל עצמי (SA), כי הוא חשב בצורה מדויקת יותר לחקות ממכר כמו התנהגות שנמצאה בבני אדם, את הפרדיגמה CPP היא הליך פשוט ללמוד קוקאין למידה קונטקסטואלית 4. פרוטוקולי CPP יכולים להתארך בנוחות ולכלול את הכחדת שלבי שבה, בדומה לSA, המאפשר חקירה של המנגנונים שבבסיס תשוקת סמים והישנות 5-7 ואשר האמינו לשחזר היבטים של מה שמתרחש באדם תרופה שוחרת התנהגות וסמים - וקיו-Induced הישנות 8-10. מנגנון אחד שעומד בבסיסקוקאין-induced פלסטיות התנהגותית שאופיינית לכל אחד מהשלבים שונים של CPP, כולל רכישה, הכחדה, ושבה, היא הפעלה של חתימות ייחודיות של ביטוי גנים באזורים שונים במוח. כדי לבחון ישירות אילו גנים בתוך אזורים במוח גמול רלוונטיים לתווך-Induced קוקאין שינויים התנהגותיים, הוא שימושי כדי להיות מסוגל לתפעל אותם באופן סלקטיבי באופן אזורי ספציפי. אחת דרכים להשגת מטרה זו היא microinject רקומביננטי adenoassociated וקטורים (rAAV) נגיפיים שהמפורש Cre recombinase באמצעות ניתוח stereotaxic, לאזורים במוח שונים של עכברים שיש להם גני המטרה מוקפים אתרי loxP (עכברי floxed). שיטה זו מאפשרת שליטה זמנית ואזורית מאוד מדויקת על מתי והיכן גנים ablated, בשני נוירונים מתחלקים ולא החלוקה, ללא גרימת תגובה חיסונית 11-13. רמה זו של שליטה מייצגת יתרון חשוב על פני טכנולוגיית Cre-LoxP המסורתי של רבייה עכברי floxed wעכברי ith מבטאים Cre recombinase תחת השליטה של ​​אמרגן גן אנדוגני, שבעיתוי וההפצה של מחיקת גן יכולים להיות מוסדרות יותר בחוזקה. בנוסף, נוקאאוט גן וקטור ויראלי עוקף בתיווך השפעות התפתחותיות פיצוי פוטנציאלי שעלולים להתרחש באמצעות אסטרטגיות נוקאאוט מסורתיות. בנוסף לקוקאין CPP, שתואר כאן, microinjection של rAAV-Cre לתוך המוח של עכברי floxed כדי להעריך את התפקיד של גנים ספציפיים יכול להיות מיושם בכל מקום בגוף לפרדיגמות התנהגות הכרוכים בשלבים נפרדים, ובכלל זה ניהול עצמי ורגישות פסיכומוטורי. לדוגמה, במעבדה שלנו ניצל את טכנולוגית rAAV-Cre כדי ללמוד את התפקיד של CA v 1.2 ליטר מסוג Ca 2 + ערוצים ברגישות פסיכומוטורי קוקאין 14. באופן ספציפי, rAAV-Cre היה microinjected לתוך גרעין האקומבנס (NAC) של עכברים עם גן קידוד Ca V 1.2 floxed, על מנת להוכיח כי Ca V </sub&gt; 1.2 הפועל באזור זה מתווך את שלב הביטוי של רגישות פסיכומוטורי 14,15. עם זאת, לא ניתן להשתמש באסטרטגיה rAAV-Cre אם עכברים עם גן floxed של עניין לא קיימים, כפי שהיה הניסיון שלנו בעת הערכת התפקיד של CA v 1.3 ליטר מסוג Ca 2 + ערוצים ברגישות פסיכומוטורי. לפיכך, מגבלה של שימוש rAAV-Cre מציגה את עצמו אם עכברים מותנים אינם קיימים לגן מסוים של עניין. עם זאת, rAAVs שsiRNA המפורש ניתן להשתמש בם למציאת גני המטרה, כפי שעשינו כדי לבחון את התפקיד של CA v 1.3 הערוצים 14,15. Microinjecting rAAV-Cre לאזורים נפרדים במוח של עכברי floxed ולאחר מכן בודק אותם בפרדיגמה CPP מאפשר לחקירה את הגנים הספציפיים המתווכים את השלבים השונים של התנהגות דמוית הממכר ושבו הם פועלים. השימוש בפרדיגמה זו סייעה בהבנתנו כיצד ממשל קוקאין החוזר ונשנה במהות חוטפת brמעגלי גמול ains גורמים לשינויים הסתגלותי במסלולי העברת אותות מולקולריים וביטוי גנים שיובילו למדינה המכורה 1,16,17.

<table><tbody><tr><td>תאי פעילות העדפת מקום מותנים</td><td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, ארה"ב</td><td>MED-CPP-MS</td><td></td></tr><tr><td>מערכת יישור סטריאוטקסית לעכבר</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, ארה"ב</td><td>דגם 900</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי המילטון</td><td>חברת המילטון, רינו, נבאדה, ארה"ב</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-Cre-GFP</td><td>וקטור BioLabs, פילדלפיה, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>7016</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-GFP</td><td>וקטור BioLabs, פילדלפיה, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>7004</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting רקומביננטי adenoassociated וקטורים (rAAV) נגיפיים המבטאים Cre recombinase לאזורים במוח עכבר ברורים לסלקטיבי גני נוקאאוט של עניין מאפשר שליטה באופן זמני ואזורי ספציפית משופרת של מחיקת גן, בהשוואה לשיטות קיימות. אמנם גם יכולה להיות מושגת על ידי מחיקה מותנית הזדווגות עכברים שמבטאים Cre recombinase תחת שליטת יזמים גנים ספציפיים עם עכברים שנשאו גן floxed, microinjection stereotaxic מאפשר מיקוד של אזורי מוח בדידים בנקודות זמן שנקבעו הנסיין של עניין. בהקשר של העדפת קוקאין מותנית מקום, ופרדיגמות התנהגות אחרות כגון קוקאין מנהל עצמי או רגישות פסיכומוטורי שיכול להיות כרוך בנסיגה, הכחדה ו / או שלבי כינון, טכניקה זו שימושית במיוחד בחקר תרומתו הייחודית של גני המטרה ברורים לאלה שלבים של מודלים התנהגותיים של פלסטיות-Induced קוקאין. באופן ספציפי,טכניקה זו מאפשרת לאבלציה סלקטיבית של גני המטרה במהלך שלבים של התנהגות כדי לבחון את תרומתם להתנהגות על פני זמן בדידים. סופו של דבר, הבנה זו מאפשרת לתרופות ממוקדות יותר כי הם מסוגלים הטובים ביותר לטפל בגורמי הסיכון החזקים ביותר שמציגים את עצמם במהלך כל שלב של התנהגות ממכרת.

CPP לאחר ביצוע CPP על עכברי microinjected, צריך לוודא שהקבוצה של שליטה המוזרקת (rAAV-GFP) העכברים בדרך כלל רכשה העדפה הקאמרית סמים לזווג (איור 1 א, 1 ב). עכברים נחשבים לרכשו העדפה לחדר מסוים, כאשר העדפת קוקאין (משך זמן בחדר קוק לזווג מינוס הזמן שבילה בתא מלוחים לזווג) היא גבוהה באופן משמעותי בהשוואה לציון העדפה בסיסית (איור 1 ב, לעומת ב &#39;) . אם, כפי שעוקבה, עכברים מוזרקים שליטה ...

מאמר זה מתאר כיצד microinject וקטורים ויראליים למוח עכבר ולאחר מכן לבדוק בפרדיגמה העדפת מקום ממוזגת הכוללת שלב רכישה, הכחדה והחזרה.

Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע אבלציה סלקטיבית של גנים מטרה במהלך שלבים נפרדים של פרדיגמת העדפת מקום במצב given, כדי לבחון את תרומתם להתנהגות זו לאורך זמן. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקה מיקרוסקופית סטריאוטקסיס של וקטור ויראלי רקומביננטי המבטא Cre recombinase. לאחר מכן, העכברים נשארים להחלים בכלוב הבית שלהם למשך 10 עד 14 ימים לצורך הפעלת מקסימלית של ה-Cre.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא לבחון את העכברים בבדיקת העדפת מקום מותנית (conditioned place preference), כולל שלבי הרכישה, ההכחדה והחזרה. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא ביצוע בדיקה היסטולוגית לעכברים שקיבלו הזרקה מיקרוסקופית, כדי לתקף את המיקום הנכון של ההזרקה המיקרוסקופית. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שינויים בהתנהגות הרכישה, ההכחדה ו/או ההחזרה בתגובה להשבתה של הגן (gene knockout) באמצעות בדיקה התנהגותית של העדפת מקום מותנית.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מערכת ההכלאה של CRE lock P, הוא שהיא מאפשרת תזמון מדויק יותר וספציפיות אנטומית של השבטת הגן באופן נפרד, מה שמאפשר לבחון את השפעת היעדר הגן בכל שלב של ההתנהגות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהתנהגות ממכרת, כיוון שהיא כרוכה בהבנה טובה יותר של הבסיס הגנטי שעשוי להסביר כיצד חשיפה לרמזים הקשריים יכולה לעורר זיכרונות הקשורים לקוקאין, העשויים להוביל לתשוקה ולהחזרה למצב של התמכרות אצל מכורים. לתחילת העבודה, הניחו כלוב עכבר עם מצע על גבי משטח חימום כדי לחממו לצורך התאוששות לאחר הניתוח.הכינו תסבסב חשמלי לגילוח הראש, אתנול ויוד לסטריליזציה של הקרקפת. השתמשו ב-70% ethanol כדי לנקות את מוטי האוזניים ואת תומך הפה של הסטריאוטקס באמצעות מזרק המילטון של 5 µL. שאבו 5 µL של וקטור ויראלי והניחו אותו במחזיק מזרקים על הסטריאוטקס.הניחו רפידת חימום למיקרוגל או רפידה חשמלית תחת הסטריאו-טקסיס לאחר הזרקת תערובת של ketamine ו-xylazine לעכבר בהזרקה תוך-בטנית (IP). בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בצעו צביטה בזנב כדי לבדוק את רמת הסדציה. לאחר מכן, גלחו את הראש בין האוזניים והעיניים והשתמשו במקלונים מסטריליים כדי לנקות את האזור באמצעות שטיפות לסירוגין של ethanol ויוד.לאחר מכן, העבירו את העכבר למשטח החימום תחת מיקרוסקופ הסטריאו. כווננו את סולמות מוט השיניים ומוט האוזן, קיבעו את שיני העכבר במוט השיניים, והבריגו את מוט המחשור ומוט האוזן. שימו לב אם נצפית תנועת רעידה או תנועה של השפם.הנח מנת דחף של תערובת ketamine xylazine. לאחר מכן, שמן את העיניים כדי למנוע את התייבשותן. בשלב הבא, בצע חיתוך עם סכין מנתח כדי לפתוח את הקרקפת עד לאזור שמאחורי האוזניים.יש להניח תפסני בולדוג (bulldog clips) בפינות הקרקפת כדי לקלף את העור מהגולגולת, תוך הבטחה כי Bgma ו-Lambda גלויות בבירור. יש לוודא כי התפר מ-bgma ל-Lambda מיושר, ולמצב מחדש את הראש במידת הצורך.לאחר אישור שהגדרות הסטריאוטקסיס מאופסות, מקמו את קצה המחט ב-bma. מדדו את הקואורדינטות הדורסליות, הוונטרליות, המדיאליות, הלטרליות והאנטריוריות-פוסטריוריות עבור BMA ו-lambda. לאחר מכן, כווננו את הראש עד שהקואורדינטות הוונטרליות של BMA ו-lambda נמצאות בטווח של 0.02 millimeters אחת מהשנייה.מרכזו מחדש את קצה המחט על ה-bgma, ומנקודה זו התקדמו בכיוון anterior posterior אל הקואורדינטה הרצויה. לאחר מכן, קדחו חור רכישה (borehole) בקואורדינטה הרצויה. לאחר וידוא שהמחט יכולה להיכנס ללא הפרעה מצד הגולגולת, הורידו את המחט אל הקואורדינטה הוונטרלית (ventral) הרצויה.לאחר הגעה לקואורדינטה, צללו עומק של 0.015 millimeters תחתיה למשך כ-10 שניות כדי ליצור כיס קטן עבור הווקטור הוויראלי בקצב של כ-0.1 microliters לדקה, והזריקו את הנפח הרצוי של הווקטור הוויראלי לאחר המתנה של שלוש דקות לדיפוזיה של הווקטור הוויראלי; הרימו את קצה המחט ב-0.015 millimeters והמתינו שתי דקות נוספות. עם סיום ההזרקות, מרחו שעוות עצם (bone wax) לאיטום שני החורים ולאחר מכן תפרו את הקרקפת. לבסוף, בצעו אלחוש של העצב (nerve block) באזור הפגוע.הוציאו את העכבר מהמסגרת הסטריאו-טקסיס והניחו אותו בכלוב חמים על גבי בלוק חימום להתאוששות למשך 45 דקות עד שעה. אפשרו לעכבר להתאושש במשך 10 ימים לפחות כדי לאפשר רב-פעילות מקסימלית. תנו לבעל החיים מים ומזון רך, ובמידת הצורך, בופרנורפין פעמיים ביום לשיכוך כאבים לאחר ההתאוששות. הכניסו את העכברים לתא המרכזי של מכשיר העדפת מקום בעל שלושה תאים לתקופת הסתגלות של 60 שניות, כאשר דלתות הגילוטיינה סגורות.לאחר ההרגלה, פתחו את דלתות הגילוטיינה ואפשרו לעכברים לחקור באופן חופשי את שלושת התאים במשך 1200 שניות. השתמשו בתוכנת Med PC four כדי לתעד את הזמן שהחיה בילתה בכל תא, בהתאם להנחיות מפרוטוקול הטקסט. שבצו את העכברים לתאי ההתנייה על בסיס ביצועיהם במהלך המבחן המקדים.במהלך שלושת הימים הבאים, מזריקים 10 milligrams per kilogram של קוקאין במהלך מפגש בוקר ומאחדים אותם באופן מיידי בתא שהוקצה להם למשך 1200 seconds. מחזירים את העכברים לכלובי הבית למשך ארבע שעות, ואז מזריקים להם סליין וכובלים את העכברים באופן מיידי לתא הנגדי למשך 1200 seconds. כדי לבחון רכישה, מניחים את העכבים בתא המרכזי כאשר דלתות הגילוטיינה סגורות לתקופת הסתגלות שנייה.פתחו את דלתות הגילוטיינה ואפשרו חקירה חופשית למשך 1200 שניות או להקלטה. חשבו את ההעדפה על סמך הזמן שהושלם בכל התאים, על ידי חיסור משך הזמן שהושלם בתא הצמד של ה-saline ממשך הזמן שהושלם בתא הצמד של ה-cocaine. לאחר ביצוע CPP בעכברים שעברו הזרקה מיקרוסקופית, הם נחשבים כמי שרכשו העדפה לתא מסוים.כאשר ההעדפה לקוקאין, המוגדרת כזמן שהויה בתא עם זוג הקוקאין פחות הזמן שהויה בתא עם זוג הסליין, גבוהה באופן מובהק בהשוואה למדד ההעדפה בבסיס (baseline). אם עכבות קבוצת הביקורת המוזרקת אינן מראות העדפה לתא עם זוג הקוקאין או מראות סלידה, מיקום ההזרקה מאומת מיד באמצעות היסטולוגיה, ועכברים עם מיקום שגוי מוצאים מהמחקר. אם קבוצת הביקורת המוזרקת רכשה העדפה באופן רגיל, הפרדיגמה מורחבת על ידי תחילת תהליך הכיבוי (extinction).עכברים נחשבים ככאלו שהגיעו להכחדה של ההעדפה המושרה על ידי התרופה לתא מסוים. כאשר ההעדפה לקוקאין לאורך שני ימי הכחדה רצופים נמוכה באופן מובהק בהשוואה לציון ההעדפה בשלב הרכישה בנקודת זמן זו, ניתן לבצע שחזור באמצעות מנה ראשונית (prime) של התרופה. אם ציון ההעדפה לאחר מתן המנה הראשונית של התרופה אינו שונה סטטיסטית מזה שבשלב הרכישה, נאמר כי קבוצה זו שחזרה את ההעדפה המושרה על ידי התרופה לתא שהוצמד לתרופה באמצעות quantitative PCR.איור זה מדגים כי הגן הנחקר אכן עבר knockout בעכברים שעברו מיקרו-הזרקה של RAAV Cree GFP לתוך הגרעין האקומבנס (nucleus accumbens) בעלי האיזורפורמה של תעלת סידן מסוג L, CAV 1.2. דגימות (punches) מעכברים שהוזרק להם RAAV Cree מראות ירידה משמעותית בביטוי הגן בהשוואה לעכברים שהוזרק להם A-A-V-G-F-P, כפי שמוצג כאן. ניתוח אימונוהיסטוכימי של הגרעין האקומבנס עבור GFP חושף מיקום דו-צדדי תקין של ה-RAAV Cree שהוזרק לאחר הליך זה.ניתן לבצע טכניקות אחרות, כגון quantitative real-time PCR ו-Western blotting, כדי לענות על שאלות הנוגעות להשפעת knockdown של גן על רמות הביטוי של גנים אחרים בעלי עניין. לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי האופן שבו ניתן לבצע ablate סלקטיבי של גנים מטרה במוח העכבר באמצעות הזרקה סטריאוטקסיס מיקרוסקופית של וקטורים ויראליים, וזאת כדי לבחון באופן סלקטיבי את תפקידם של גנים אלו ברכישה, הכחדה (extinction) והחזרה (reinstatement) של פרדיגמת ה-condition place preference.

stereotaxic-microinjection-viral-vectors-expressing-cre-recombinase

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

מקור: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Newborn Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של וקטור ויראלי המקודד Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP לתוך הסטריאטום של גור עכבר מהונדס גנטית כדי להשיג מניפולציה גנטית על ידי כריתת קלטת STOP עם אגף loxP, הפעלת חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP כמדווח.

מיקרו-הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית בסטריאטום גור עכבר

מקור: Pereira, M. et al., In vivo Direct Reprogramming של תאי גליה תושבים לאינטרנוירונים על ידי הזרקה תוך מוחית של וקטורים ויראליים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים הזרקה סטריאוטקסית של נגיף הקשור לאדנו לקליפת המוח של עכבר טרנסגני כדי להעביר תכנות מחדש של עצבים תלויי Cre וגנים מדווחים פלואורסצנטיים לתאי גליה.

הזרקה סטריאוטקסית של וקטורים ויראליים לתכנות מחדש של תאי גליה במודל עכבר

מקור: Fricano-Kugler, C. J., et al. תכנון, אריזה ואספקה של CRISPR רטרו ולנטי-וירוסים עם טיטר גבוה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה מדויקת של גנים עצביים במוח העכבר. הפרוטוקול מבטיח העברת וירוסים מדויקת לבליטה המשוננת, ומאפשר תיוג פלואורסצנטי ונוקאאוט גנים בתיווך CRISPR לחקור מעגלים עצביים, תפקוד גנים ומנגנוני מחלה in vivo.

הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה גנטית עצבית ממוקדת במוח העכבר

יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך...

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

הזרקת stereotactic של lentiviruses להביע cDNAs או shRNAs יכול לווסת ביטוי גנים באזורים ספציפיים במוח של עכברים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשלב זריקות stereotactic עם משימות התנהגותיות, כגון מבחן להרחיב שדה (OFT) ומבחן הכפייה לשחות (FST).

יישום טכניקת הזרקת stereotactic לחקר השפעות גנטיות על התנהגות בעלי החיים

מכרסמים הם מודל מתאים לחקירת המצעים המולקולריים של התנהגות והפרעות פסיכיאטריות מורכבות. ניתן להשתמש במיקרו-הזרקת מוח במכרסמים ערים כדי להבהיר מצעי מחלה. מוצגת שיטת מיקרו-הזרקה יעילה וניתנת להתאמה אישית למוח כמו גם ביצוע פרדיגמה אופרנטית המכמתת מוטיבציה.

מכרסמים מוח Microinjection לחקר מולקולריים מצעים של התנהגות מוטיבציה

גישות optogenetic נמצאים בשימוש נרחב כדי לתפעל פעילות עצבית ולהעריך את ההשלכות על תפקוד המוח. הנה, טכניקה מתוארת שעם ביטוי in vivo של המפעיל האופטי Channelrhodopsin, המאפשר ניתוח vivo לשעבר של נכסים הסינפטי של ארוכי טווח ספציפי קשרים עצביים מקומיים מעגלים הקשורות פחד.

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

אנו מתארים פרוטוקול של ניתוח stereotaxic עם מכשיר ביתי הראש-קבוע עבור ריאגנטים microinjecting לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית ב תאים עצביים של אזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

השיטות המתוארות כאן מתארות הליך המשמש להיפוך אופטוגנטי של פלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין במעגל רלוונטי התנהגותית בחולדות. גירוי אופטי מתמשך בתדר נמוך של סינפסות תלמו-אמיגדלה גורם לדיכאון ארוך טווח (LTD). In vivo המושרה אופטיגנטית LTD בחולדות שחוו קוקאין הביאה לאחר מכן להחלשה של חיפוש סמים המונע על ידי רמזים.

שימוש באופטוגנטיקה כדי להפוך גמישות מוחית ולעכב חיפוש קוקאין בחולדות

למדו מיקרו-הזרקה סטריאוטקטית של וקטורים ויראליים המביעים Cre recombinase כדי לחקור את תפקידם של גנים בהעדפות מקום מותנות קוקאין בעכברים. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של מנגנוני התמכרות ותגמול במוח.

Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין

גלה סרטונים נוספים