ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית
4 בספטמבר 2013
דרך להשיג תובנות חדשות על המורכבות של התגובה הדלקתית במוח מוצגת. אנו מתארים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדים כדי לחקור את הדפוס של שיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ מיקרוגליה / מקרופאג במודל של עכברים של איסכמיה מוקד.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמיין את הביטוי והלוקליזציה התאית של סמני פנוטיפ מקרופאגים מיקרוגליה לאחר איסכמיה מוחית. ראשית, קטעי קריו ממוחות עכברים איסכמיים מוכתמים כדי לזהות סמנים להפעלת מקרופאגים מיקרוגליה. החלקים המוכתמים נתונים להדמיה קונפוקלית תלת מימדית.
לאחר מכן התמונות המתקבלות מעובדות ליצירת עיבודים תלת מימדיים, וניתוח תמונה מבוצע כדי למקם את הביטוי של סמנים באשכולות תאים. הנתונים המתקבלים מדגימים את היעילות של ניתוח קונפוקלי תלת מימדי בהקצאה נכונה של ביטוי סמן לגוף תאי ספציפי כאשר שני סמנים באים לידי ביטוי על ידי אותו תא, אך בתאים תת-תאיים שונים, קולוקליזציה לבדה עשויה להיות לא אינפורמטיבית במיוחד. שימוש בניתוח תלת מימדי, כפי שנדגים כאן, מאפשר רזולוציה ודיוק טובים יותר.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המורכבות של תגובת המוח לפגיעה איסכמית, ניתן ליישם אותה גם במצבים חריפים או כרוניים אחרים שבהם הוצע תפקיד כפול למקרופאגים מיקרוגליה בפגיעה ותיקון. או באותם מקרים שבהם יש למקם אותות באופן סלקטיבי במישורים מיוחדים שונים, קרלו פריגו וסטפן ממגאלי יעבירו אותך דרך השלבים השונים של ההליך. הפרוטוקול הבא משתמש ברקמת מוח של עכבר שבה איסכמיה הושרה על ידי חסימה קבועה של עורק המוח האמצעי.
השתמש בקריוסטט כדי לאסוף חלקים עטרתיים סדרתיים של 20 מיקרון במוח על ג'לטין. שקופיות מכוסות מביאות את כל הריאגנטים והדגימות לטמפרטורת החדר לפני השימוש. שימו לב שדילול העבודה של הנוגדנים והסרום המפורטים במסמך הנלווה שלהם נבע מניסויים שנעשו על מנת להשיג את הביצועים הטובים ביותר כאשר משתמשים בנוגדנים ובסרום שונים.
צריך לאמת את הפרוטוקול. התחל בסיבוב החלקים בשקופית באמצעות עט חוסם נוזלים כדי למזער את כמות הריאגנטים הדרושים. לאחר מכן, הניחו את חלקי המוח בתא רטוב באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד.
הוסף PBS בטמפרטורת החדר לחלקים ודגר במשך חמש דקות כדי לשטוף אותם. לאחר מכן השתמש במזרק חד פעמי של מיליליטר אחד עם מחט, הסר את התמיסה וחזור על הכביסה פעם נוספת לאחר הסרת הכביסה השנייה, המשך להכתים את הדגימות באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד ומזרק חד פעמי לכל חילופי התמיסות. יש לבצע את הליך הצביעה כמסוכם. הנה.
אנא עיין בטקסט המצורף לפרטים, כולל שלבי כביסה. ראשית, התאים מודגרים במי חמצן של 1% לאחר חסימה בסרום עיזים רגיל. הם מודגרים עם נוגדן ראשוני כנגד CD 11 B.לאחר מכן, השקופיות מודגרות עם נוגדן משני מתאים ואחריו triss, NACL tween buffer, או TNT, ואז triss, H-C-L-N-A-C-L, מאגר חוסם, או TNB לאחר הדגירה עם TNB.
המגלשות מודגרות עם סטרפטווידין HRP ואחריו מדלל הגברה המכיל ציאניד חמש טירום, אשר יגביר את האות האימונופלואורסצנטי. לאחר מכן, השקופיות מודגרות עם NGS כדי לחסום אתרי קשירה לא ספציפיים. לאחר מכן הם מודגרים עם נוגדן ראשוני נגד CD 68.
לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני, התאים מודגרים בנוגדנים המשניים המצומדים המתאימים של פלואור, ואחריהם מיקרוגרם אחד למיליליטר של ווים כדי לסמן את ה-DNA. לאחר השלמת הצביעה, הרכיבו קטעי קריו באמצעות זהב ממושך בעת הרכבת חלקים, הימנעו מיצירת בועות אוויר. אחסן את החלקים בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד שהם מנותחים.
רכישת אות פלואורסצנטי צריכה להתבצע תוך שבוע. פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ IX 81 המצויד ביחידת סריקה קונפוקלית FV 500 עם שלושה קווי לייזר, ארגון קריפטון ב-488 ננומטר, הליום ניאון אדום ב-646 ננומטר והליום ניאון ירוק ב-532 ננומטר, בתוספת דיודת UV בשפעת של תוכנת U 500. בחר את לייזרי העירור והמראות הדיכרואיות המתאימים.
הגדר גם רזולוציית תמונה של 800 על 600 פיקסלים לפחות. לאחר מכן, הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ ובאמצעות אפי פלואורסצנטי, זהה אזור עניין, הגדל בהדרגה את ההגדלה למטרה של פי 40. לאחר מכן עבור לשיטת מיקרוסקופ סריקת לייזר והפעל סריקות חוזרות תוך התאמת רמת ההספק של מכפיל הפוטו והרווח עבור כל ערוץ.
זה יפחית את חפיפת האותות הנגרמת על ידי עירור עכשווי באורכי גל שונים. שמור על הרווח נמוך ככל האפשר כדי למנוע אותות לא ספציפיים לא רצויים. המשך הסריקה החוזרת, כוונן את המיקוד והגדר את הקצוות התחתונים והעליונים של ציר Z באורך כולל של ציר Z של 10 מיקרון.
לאחר מכן הפסק את הסריקה החוזרת. לאחר מכן, הזן את גודל הצעד. זה צריך להיות קרוב ככל האפשר לגודל הפיקסלים, שהוא 0.225 מיקרון.
זה ייתן יחס גודל סטנדרטי של אחד לאחד על פני ציר Z בתוכנה הפעל מסנן קלמן לפחות פעמיים. אלגוריתם קלמן הוא פונקציה איטרטיבית המבטלת אות אקראי, כגון ווקסלים חיוביים בודדים השייכים לרעשי רקע, ובכך משפרת את יחס האות לרעש. כעת הפעל את מצב הסריקה הרציף כדי למנוע דימום דרך אפקטים.
עבור לנקודת האמצע של ציר Z והפעל סריקה רציפה XY. בדוק את ההגדרה של PMT ואת הרווח כדי להבטיח יחס אות לרעש משביע רצון. Run XY, Z לאחר הרכישה.
ייצא את הנתונים כקובץ TIF מרובה. כל קובץ TIF מרובה מכיל בדרך כלל שלושה ערוצי צבע ו-44 מישורי מוקד לעיבוד. התחל בפתיחת תוכנת imas.
ראשית, בחר את תצוגת המעבר ולאחר מכן העלה את קובץ ה-TIF הרב-תכליתי. לאחר מכן בלוח התאמת התצוגה, בחר את הצבע הרצוי עבור כל ערוץ כאן. אדום מייצג CD 11 B.ירוק מייצג CD 68, וכחול מייצג את כתם ה-DNA של הווים כדי להסיר רעש מהרקע, להגדיל את הערך המינימלי בלוח כוונון התצוגה עבור כל ערוץ.
לאחר מכן עבור לתצוגת המקטע כדי לדמיין מישור מוקד XY יחיד עם הקרנות אורתוגונליות של ציר x, Z ו- YZ. נוע לאורך ציר Z בחיפוש אחר לוקליזציה, המופיעה כפיקסלים צהובים. לחץ על אזור צהוב כדי לראות אם הקולוקליזציה קיימת לאורך ציר Z, מה שמצביע על כך שהוא שייך לציר Z של אובייקט מוצק.
הקרנות נראות בחלק הימני והתחתון של האיור. צלם תמונה, ולאחר מכן חזור לתצוגת העליון. לאחר מכן, בתפריט הנפתח עריכה, בחר חתוך תלת-ממד ושרטט אזור מעניין כדי לבודד תא או אשכול תאים.
לאחר מכן, בלוח התאמת התצוגה, בחר ערוץ אחד. בחר את בונה האלגוריתמים של משטחי העלייה. לאחר מכן כדי להגדיר את האלגוריתם, ראשית, בחר ערוץ.
לאחר מכן הגדר את הסף כערך מינימלי זהה לזה שנקבע בלוח התאמת התצוגה והגדר את שינוי הגודל במידת הצורך. לאחר מכן, הגדר החלקה כ-0.200. בחר בחלונית הצבע ושנה את המראה בהתאם לצורך.
חזור על ההגדרה עבור בונה האלגוריתם של משטחי המעבר עבור כל ערוץ. לאחר מכן, בלוח כוונון התצוגה, בטלו את הבחירה בערוצי הקרינה ובחרו את כל שלושת המשטחים. לבסוף, הזז את עוצמת הקול כדי למצוא את התצוגה הטובה ביותר וצלם תמונה כדי לקבוע את תבנית הביטוי המשותף של סמני MM.
הפרוטוקולים לאימונופלואורסצנציה ורכישה קונפוקלית המתוארים בסרטון זה בוצעו במודל עכבר של איסכמיה מוקדית הנגרמת על ידי חסימה קבועה של עורק המוח האמצעי. מבט דו-ממדי של תמונות שנרכשו מראה כי 24 שעות לאחר איסכמיה, הסמנים הליזוזומליים CD 68, המוצגים בירוק, מתבטאים בהיפרטרופיים בתוך תאים חיוביים CD 11 B, הנראים באדום הקיימים בליבה האיסכמית. הקרנת ציר Z המוצגת בפינה הימנית התחתונה מדגימה כי התפלגות הסמן המתועדת בתצוגת המישור היחיד קיימת גם לאורך ציר Z באזור הגבול.
התאים החיוביים ל-CD 11 B מציגים גופי תאים היפרטרופיים עם תהליכים חיוביים מאוד ל-CD 68, מה שמרמז על כך שפגוזומים קשורים לקרום התא. זה מצביע על התנהגות חומצית PHA פעילה של תאי מיקרוגליה כדי להעריך ביטוי משותף של CD 68 ו-YM one, סמן של M 2 מקוטב. מ"מ. התמונות הפלואורסצנטיות עברו עיבוד תלת מימדי.
התצוגה התלת מימדית של התמונות הנרכשות המוצגות כאן מצביעה על נוכחותם של תאים חיוביים CD 68 המוצגים בירוק ותאים חיוביים YM המוצגים בווקסלים פלואורסצנטיים אדומים. במקביל, נקודת המבט של הצופה עשויה להניב אות מקומי משותף הנראה כצהוב, שאולי אינו קשור למרחק האמיתי בין הסמנים. כדי להגדיר לוקליזציה.
יש ליצור תצוגת מישור יחיד עם הקרנות של ציר Z הנעה לאורך ציר Z. מחפש לוקליזציה. הקרנת ציר Z מתקבלת כפי שניתן לראות בחלק הימני והתחתון של תמונה זו.
ניתן להפוך ווקסלים פלואורסצנטיים לאובייקטים מוצקים על ידי עיבוד תלת מימדי עם הקצאת ביטוי סמן לגוף תאי ספציפי. לאחר הגדלה גבוהה ועיבוד תלת מימד, נראה ששני הסמנים שייכים לתאים שונים שנמצאים בסמיכות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקת אימונופלואורסצנציה עם סמנים וצבעים מרובים, וכיצד לרכוש ולדמיין כראוי תמונות תלת מימדיות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
בנוסף, ניתן לנצל באופן פורה את ניתוח העיבוד המתואר כדי לנתח כל ביטוי משותף או קולוקליזציה ברמה התאית, או במקרים שבהם יש צורך למקם אותות באופן סלקטיבי במישורים מרחביים שונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לוויזואליזציה של הביטוי והמיקום של סמני פנוטיפ של מיקרוגליה/מקרופאגים במודל עכבר של איסכמיה מוקדית. באמצעות אימונופלורסצנציה ודימיון קונפוקלי תלת-ממדי, המחקר שואף להעמיק את ההבנה של התגובה הדלקתית במוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- מיקרוגליה ומקרופאגים ממלאים תפקידים מכריעים בדלקת במוח.
- הבנת דפוסי ההפעלה שלהם חיונית לחקר מצבים איסכמיים.
- טכניקות דימות תלת-ממדיות יכולות לספק תובנות טובות יותר לגבי אינטראקציות תאיות.
- קו-לוקליזציה של סמנים עשויה שלא לחשוף באופן מלא את הדינמיקה התאית.
מטרת המחקר
- להדמיות של הפעלת מיקרוגליה/מקרופאגים בעקבות איסכמיה מוחית.
- לשיפור הרזולוציה של ניתוח ביטוי סממנים.
- להדגמת היעילות של דימיון קונפוקאלי תלת-ממדי במחקרים במדעי העצבים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת חתכי קריו (cryo sections) ממוחות של עכברים שעברו איסכמיה.
- צביעת אימונופלואורסצנציה לזיהוי סממנים של מיקרוגליה/מאקרופאגים.
- דימות קונפוקאלי תלת-ממדי להדמיה מפורטת.
- ניתוח תמונות לאיתור מיקום ביטוי הסממנים בצבירים תאיים.
תוצאות עיקריות
- דימות תלת-ממדי מאפשר שיוך מדויק של ביטוי סמנים.
- סמנים יכולים להבטא עצמם במדורים תת-תאיים שונים.
- רזולוציה משופרת מספקת תובנות טובות יותר לגבי אינטראקציות תאיות.
- המתודולוגיה מדגימה פוטנציאל משמעותי למחקרי עתיד.
מסקנות
- ניתוח קונפוקאלי תלת-ממדי יעיל לחקר דלקות במוח.
- הבנת הדינמיקה של מיקרוגליה/מקרופאגים היא קריטית עבור אסטרטגיות טיפוליות.
- ניתן להחיל גישה זו על מודלים שונים של פגיעות מוחית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח קונפוקאלי תלת-ממדי של סמני קיטוב של מיקרוגליה/מקרופאגים מאפשר מיפוי מרחבי ופנוטיפי מדויק של תגובות דלקתיות עצביות במודלים פרה-קליניים של פגיעה מוחית. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור גילוי תרופות המתמקדות בדלקת עצבית. גישה זו תומכת ברצף תרגומי על ידי אספקת נתונים כמותיים ברזולוציה גבוהה על דינמיקת תאי חיסון הרלוונטית לבדיקת היפותזות טיפוליות ולמיון תיקי פיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מצבי הפעלה של מיקרוגליה/מקרופאגים והתפלגות מרחבית לאחר פגיעה מוחית.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי הבחנה בין פנוטיפים פרו-דלקתיים ואנטי-דלקתיים ברזולוציה תאית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרה של ביטוי משותף של סמנים ומיקומם ברקמה רלוונטית למחלה.
- מספק פלטים כמותיים לקבלת החלטות על קידום תיק פיתוח מבוסס היפותזות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין חתכי רקמה מתוקתקים ופאנלים של סמנים עבור תהליכי עבודה של דימוי ואנליזה בהמשך.
- סטנדרטיזציה של פרוטוקולים של אימונופלורסצנציה ודימוי קונפוקאלי לצורך הדירות וסקלאביליות.
- מייצר קריאות כמותיות רב-ערוציות המתאימות להערכה השוואית של תרכובות.
- מאפשר הערכה מהימנה של קולוקליזציה של סמנים והטרוגניות תאית במבחני סריקה.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות של דלקת עצבית ופגיעה עצבית לצורך גילוי ביומרקרים תרגומיים.
- תומך ברצף החקירה משלב הגילוי המוקדם ועד לאימות פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניתוח פנוטיפי לאורכי.
- מספק נתונים מותאמי סיכון להקדמת מטרות דלקתיות-עצביות לעבר פיתוח פרה-קליני.
- משפר את הערך הניבוי עבור מודולציה טיפולית של פנוטיפים של תאי מערכת החיסון במערכת העצבים המרכזית (CNS).
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של פנוטיפים של תאי מערכת החיסון במודלים של פגיעות מוחיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים באמצעות מיפוי ביטוי של סמנים וקו-לוקליזציה (colocalization) in situ.
- סריקה: מספק פלטי דימוי כמותיים וניתנים לשחזור עבור פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדידות רב-ממדיות ופלטים סטטיסטיים להשוואה בין תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפ תאי לנקודות סיום רלוונטיות למחלה ואסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימוי וניתוח לשימוש חוזר עבור מודלים מגוונים של פגיעות ודלקת נוירולוגית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר על דלקת נוירונית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי דימות ואנליזה לשיפור השחזוריות והיכולת להרחבה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go ובהקצאת הון באמצעות אספקת נתונים פנוטיפיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מטרות לדלקת נוירונית ואסטרטגיות טיפוליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונופלורסצנציה, מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנות לניתוח תמונות.
- מחייב גישה לציוד דימות מתקדם ותשתיות מחשוב.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי צביעה ופרמטרי דימות בין צוותים שונים.
- עשוי לדרוש התאמה לסוגי רקמות שונים או למודלים של מחלות, בהתאם לבחירת הסמן.
- תלוי בתיקוף של ספציפיות הנוגדנים ורזולוציית הדימות לצורך כימות מדויק.
