Name: ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: למד ניתוח קונפוקל תלת-ממדי של מיקרוגליה ומקרופאגים במודל עכברים לאיסכמיה מוחית מוקדת. שיטת אימונופלואורסצנט מספקת רזולוציה משופרת לזיהוי סמני פעילות תאית ותובנות לתגובה הדלקתית במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

סטפנו פומגלי הוא עמית של קרן Monzino.

<html> 1. Immunofluorescence הפרוטוקול הבא מבוצע על cryosections מוח העטרה שהתקבל בעכברים perfused transcardially (20 מיליליטר של PBS, 0.1 mol / ליטר, pH 7.4, ואחריו 50 מיליליטר של paraformaldehyde המצונן 4% ב-PBS). לאחר זלוף, המוח יוסרו בזהירות והועבר לסוכרוז 30% PBS ב 4 ° C למשך הלילה לcryoprotection. אז המוח מוקפא במהירות על ידי טבילה בisopentane ב-- 45 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לפני שנחתם לתוך צלוחיות ומאוחסנים ב -70 ° C עד לשימוש. cryosections העטרה המוח (20 מיקרומטר) נחתכים באופן סדרתי וכפוף לפרוטוקול immunofluorescence 11, 6. להביא את כל חומרים כימיים ודגימות לטמפרטורת חדר לפני השימוש. אנא שים לב כי דילולים עובדים הציגו נוגדנים וסרום כתוצאה מניסויים שנעשו על מנת לקבל את הביצועים הטובים ביותר. כאשר נוגדנים וסרום שונים משמשים, הפרוטוקול צריך להיות מאומת. class = &quot;jove_content&quot;&gt; הערה שבגלל נוגדנים עיקריים הן אנטי CD11b ואנטי CD68 מבוצעים בעכברים, כדי למנוע אות צלב על ידי אנטי עכברוש אלקסה 546, השתמשנו דילול גבוה של אנטי CD11b אחרי ההגברה אות ניאון עם ערכת ה-TSA (Cy5 tyramide). הקמנו דילול העבודה האופטימלי עבור אנטי CD11b על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר פרט לצעד 1.17 ושימוש לפחות 7 דילולים שונים של אנטי CD11b כפי שדווח בטבלה 1. כתוצאה מכך, 1:30,000 נבחרו להיות הדילול רק השגת: 1) אות גלויה עם Cy5 בננומטר 646 גל העירור; 2) אין אות עם אלקסה 546 בגל עירור 532 ננומטר. בדרך זו, Alexa 546 אות ניאון קשורה באופן סלקטיבי עם ביטוי CD68. דילולים אופטימליים עבור אנטי CD11b ונוגדנים נגד CD68 עשויים להשתנות בהתאם לסוג של רקמה וחייבים להיות מוגדרים מראש כדי להתחיל את פרוטוקול שיתוף תיוג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף cryosections המוח פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוךcryosections cubate למשך 5 דקות בPBS המכילות 1% H 2 O 2 (שלב נדרש מאז ההגברה הניאון צריכה דגירה עם חזרת peroxidase, streptavidin-HRP, ראה שלב 1.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 2X עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות NGS 10% ו0.3% טריטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ב 4 ° C למשך הלילה בPBS המכיל עיקרי Ab עכברוש אנטי CD11b [1:30,000], NGS 10% ו0.3% טריטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף cryosections 2x (5 דק &#39;) עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות המשני אנטי העכברוש Ab biotinylated [1:200] ו1% NGS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 2X עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף cryosections עם TNT (טריס-HCl, NaCl, Tween: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ל1.5 שעות בTNB (טריס-HCl-NaCl-חסימת חיץ: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.5% מגיב חסימה מערכה מתאימה (ראה טבלה של חומרים כימיים)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryo שטפי<html> סעיפי 3x פעמים עם TNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections בTNB מכיל streptavidin-HRP [1:100]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 3x עם TNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections במשך 8 דקות בהגברה ממסה המכילות Cyanine 5 tyramide [1:300]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 3x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות NGS 10% ו0.1% טריטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ב 4 ° C למשך הלילה בPBS המכיל Ab העכברוש אנטי CD68 העיקרי [1:200], 3% NGS ו0.3% טריטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 3x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות Ab Alexa 546 אנטי עכברוש fluorconjugated המשני [1:500] ו1% NGS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 3x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections עבור 10 דקות בPBS המכילות מיקרוגרם / מיליליטר Hoechst 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 3x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר cryosections בלהאריך את זהב. </li></ol> 2. רכישת תמונות תלת ממדיות על ידי מיקרוסקופיה confocal s = &quot;jove_content&quot;&gt; מיקרוסקופ משמש כאן היה מיקרוסקופ IX81 מצויד FV500 יחידת סריקת confocal עם 3 קווי לייזר: Ar-Kr (488nm), אדום הוא Ne-(646nm), וירוק הוא Ne-(532nm) ו דיודות UV. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר לייזרי העירור בהתאם לאורכי הגל של צבעי ניאון כדי להיות נרגש (אדום הוא Ne-לCy5, CD11b; ירוק הוא Ne-לAlexa546, CD68 ודיודות UV לHoechst, גרעינים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את השילוב הטוב ביותר עבור מראה dichroic אוסף אותות אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את רזולוציית תמונה במינימום של 800 600 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את תחומי עניין של באמצעות עלית הקרינה והדרגה להגדיל את ההגדלה לאובייקטיבית 40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לשיטת לייזר סריקה מיקרוסקופית (LSM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל סריקות חוזרות ונשנות כדי להתאים את מכפיל (PMT) ורווח לכל ערוץ. לייזרים יכולים להיות מופעלים בנפרד כדי להקל להגדיר. שמור על רווח נמוך ככל האפשר כדי להימנע מאותות שאינם ספציפיים לא רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם repetitive סריקה פועל, העבר את מוקד השליטה להגדיר קצוות העליונים ותחתונים של ציר Z (סה&quot;כ אורך ציר z = 10 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק סריקה חוזרת ונשנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת גודל צעד. זה צריך להיות קרוב ככל האפשר לגודל פיקסל (0.225 מיקרומטר) כדי לקבל יחס של 1:1 בגודל סטנדרטי על ציר ה-z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מסנן קלמן לפחות 2 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מצב סריקה רציף כדי למנוע תופעות לדמם דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חצי דרך לאורך ציר z ולהריץ סריקה רציפה XY. בדוק את ההגדרה של PMT ורווח (יחס אות / רעש טוב). אם אינו משביע רצון, חזור על שלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל רכישת XYZ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא כקובץ multitiff. כל קובץ multitiff בדרך כלל מכיל 3 ערוצי צבע (כחול, ירוק ואדום) ו44 מטוסי מוקד. </li></ol> 3. צפו בתלת ממדי של רכישות Confocal ועיבוד תלת ממדי להעלות קבצי multitiff לתוכנת Imaris ולעבד אותם באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">תוכנה פתוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התצוגה לעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלה את קובץ multitiff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הצבע הרצוי עבור כל ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת רעש מהרקע על ידי הגדלת הערך המינימאלי בלוח התאמת תצוגה. התאם כל ערוץ בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתצוגת הסעיף. לנוע לאורך ציר z מחפש שיתוף לוקליזציה (פיקסלים צהובים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על אזור צהוב כדי לראות אם colocalization נמצא לאורך ציר Z (כלומר שייך לאובייקט מוצק). תחזיות ציר ה-Z נראות בחלק הימני ותחתון של הדמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את תמונת מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כדי לעלות תצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבול 3D לבודד את תא או קבוצה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ערוץ אחד בלוח התאמת תצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קבלן האלגוריתם לעלות / משטחים. צעדי אלגוריתם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סף (להשתמש באותו הערך מינימאלי בtהוא מציג פנל התאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שינוי הגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר החלקה (= 0.200 הטובים ביותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מראה צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של אלגוריתם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.12 לכל ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטלו את הבחירה ערוצי הקרינה בלוח התאמת תצוגה ולבחור את כל שלושה המשטחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את העצמה כדי למצוא את התצוגה הטובה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את תמונת מצב. </li></ol>

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+in+stroke%3A+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li>
<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia%3A+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li>
<li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+CareMed%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li>
<li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373(2007).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943(2011).</li>
<li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li>
<li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

אנו מציגים כאן פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M לאזור איסכמי (לניתוח מפורט יותר ראה נ&quot;צ 6). שיטה זו משלבת מכתים ספציפי של סמן הרלוונטי של הפעלת M / M עם confocal הדמיה תלת ממדית. הכוונון העדין של נוגדנים, סרום וfluorconjugated דילולים עובדים מאפשר אות אופטימלית יחס רעש של הסמנים הנחקרים. עיבוד תמונה כדי להשיג שלוש הדמיות ממדיות מאפשר הגדרה של ביטוי סמן באשכול של ת...

לאחר פגיעה מוחית חריפה, מיקרוגליה במהירות מופעלים ולעבור מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים משתנים 1-3. תגובה מהותית זה קשור לגיוס של מקרופאגים יליד דם אשר נודדים לתוך 4,5 parenchyma המוח נפגע. התפקיד של מיקרוגליה ומקרופאגים אשר antigenically לא להבחין (המכונה מעתה כז / ז) בפגיעה מוחית עדיין במחלוקת. מספר גדל והולך של מחקרים מצביע על כך, באופן דומה למה שתאר למקרופאגים היקפיים, מיקרוגליה ומוח מגויסים מקרופאגים יכולים להניח פנוטיפים שונים קיצוניות שמתאימה לרעיל קלאסי הפרו דלקתי (M1) או הפנוטיפ אנטי דלקתי מגן (M2). מצבי ההפעלה השונים, כולל הפרשה של גורמים פרו או אנטי דלקתיים, שחרורו של מולקולות נוירוטרופי ופעילות lysosomal מתאפיינים בדפוס מסוים של סמנים פנוטיפי, ביטוי שתלוי בזמןאבולוציה של הסביבה. האפיון של פנוטיפים M / M אלה במוח נפגע הוא עדיין מועט. אנחנו השתמשנו במודל עכברי מבוסס היטב של pMCAo לנתח ביטוי M / M ואבולוציה לאחר שבץ. פרוטוקולי Immunofluorescence מבוססים שהוצגו כאן שואפים לקבל תובנה המראה של סמנים ספציפיים M / M פנוטיפ, הלוקליזציה שלהם ושיתוף ביטוי סלולארי באזור איסכמי. אנחנו בדקנו כמה מולקולות הקשורות למצב הפעלה שונה או פנוטיפ, כלומר CD11b, סמן משטח לידי ביטוי על ידי כדוריות דם לבנות וסמן בשימוש נרחב של הפעלה / גיוס M / M 6-8, CD68 סמן של lysosomes 6,7 וYm1 הפרשה חלבון לידי ביטוי על ידי מקרופאגים מופעלים לחלופין (M2) וקשורה להחלמה ושיקום תפקוד 9-10. כאשר שני סמנים באים לידי ביטוי על ידי אותו התא, אך בתאי subcellular שונים, colocalization לבד לא יכול להיות הרבה informative. במקרה זה, ניתוח של coexpression יכול להתבצע על ידי שימוש בתצוגת מישור אחד וע&quot;י הדמיות תלת ממד. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול כדי להשיג ניתוח תלת ממדים יסודי של coexpression סמן.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD11b</td><td>סופק באדיבות על ידי Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-mouse Ym1 </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; CHST 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>עכבר גרעינים אנטי-עצביים (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד חולדות עז ביוטית</td><td>ג'קסון מחקר חיסוני</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA ציאנין 5 מערכת </td><td>פרקין אלמר</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>להאריך זהב </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>נגד חולדות אלקסה 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>אנטי עכבר Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>אנטי ארנב Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vectors Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>Cryostat CM1850</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 מיקרוסקופ קונפוקלי </td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS תוכנה</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אימריס תוכנה 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חבילות תוכנה GraphPad Prism גרסה 4.0</td><td>תוכנת GraphPad בע"מ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח confocal תלת ממדי של מרקרי microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

לאחר מיקרוגליה שבץ המוחי / מקרופאגים (ז / ז) עובר שפעול מהיר עם שינויים מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים הכוללים ביטוי של פני השטח אנטיגנים רומן וייצור של מתווכים כי לבנות ולתחזק את התגובה הדלקתית. ראיות מצביעות על כך שמתעוררים M / M הם תאי פלסטיק מאוד שיכול להניח הפעלה קלאסית פרו דלקתית (M1) או חלופית אנטי דלקתית (M2) לאחר פגיעה מוחית חריפה. עם זאת אפיון של ביטוי M / M סמן פנוטיפ, colocalization והתפתחות הטמפורלית במוח נפגע מלא עדיין חסר. פרוטוקולי Immunofluorescence במיוחד מכתימים סמנים רלוונטיים של הפעלת M / M יכולים להתבצע במוח איסכמי. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור את הדפוס של לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M כגוןCD11b, CD68, Ym1, במודל של עכברים של איסכמיה מוקד הנגרמת על ידי חסימה קבועה של עורק המוח האמצעי (pMCAO). ניתוח דו ממדי של האזור המוכתם מגלה כי כל סמן קשור למורפולוגיה M / M מוגדר ויש לו לוקליזציה נתון בנגע איסכמי. דפוסים של שיתוף ביטוי סמן פנוטיפ M / M ניתן להעריך על ידי confocal הדמיה תלת ממדית באזור איסכמי. ניתן לרכוש תמונות על נפח מוגדר (10 מיקרומטר Z-ציר וגודל צעד 0.23 מיקרומטר, המקביל ל 180 x 135 x 10 מיקרומטר נפח) עם מצב סריקה רציף כדי למזער את ההשפעות לדמם דרך ולהימנע מגל חופף. אז תמונות מעובדות להשיג הדמיות תלת ממדיות באמצעות תוכנת Imaris. השקפה מוצקה של שלוש הדמיות ממדיות מאפשרת ההגדרה של ביטוי סמן באשכולות של תאים. אנחנו מראים שיש לי M / M היכולת להבדיל כלפי מספר רב של פנוטיפים, תלוי במיקום באתר הנגע וtiשלי אחרי פציעה.

דוגמא לתוצאות המתקבלות כאשר פרוטוקולי תיוג ורכישות confocal מתבצעים לאזור איסכמי מתוארת באיורים 1 א ו-1B. צפו בשני ממדים של תמונות שנרכשו עולה כי בעשרים וארבע שעות לאחר איסכמיה (א &#39;), CD68 סמן lysosomal (הירוק) בא לידי ביטוי בתאי hypertrophic ameboid CD11b (אדום) נמצאים בליבת איסכמי. באזור גבול תאים החיוביים (B) CD11b להציג גופי תא עגולים ותהליכים מסועפים חיוביים לCD68. תחזיות ציר ה-Z (חלק ימני ותחתון של A ו-B)</strong...

דרך להשיג תובנות חדשות על המורכבות של התגובה הדלקתית במוח מוצגת. אנו מתארים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדים כדי לחקור את הדפוס של שיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ מיקרוגליה / מקרופאג במודל של עכברים של איסכמיה מוקד.

ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדמיות של הביטוי והמיקום התאי של סמני פנוטיפ של מקרופאגים של מיקרוגליה לאחר איסכמיה במוח. ראשית, נסמנים חתכי קריו ממוחות של עכברים שעברו איסכמיה כדי לזהות סמנים של הפעלת מקרופאגים של מיקרוגליה. החתכים הסמומנים עוברים הדמיה קונפוקאלית תלת-ממדית.התמונות שהתקבלו מעובדות לאחר מכן ליצירת הדמיות תלת-ממדיות, ומבוצע ניתוח תמונה כדי למקם את הביטוי של סמנים בצבירי תאים. הנתונים שהתקבלו מדגימים את יעילותו של ניתוח קונפוקאלי תלת-ממדי בשיוך נכון של ביטוי סמנים לגוף תאי ספציפי. כאשר שני סמנים מבוטאים על ידי אותו תא, אך במדורים תת-תאיים שונים, קולוקליזציה לבדה עשויה שלא לספק מידע רב. שימוש בניתוח תלת-ממדי, כפי שנדגים כאן, מאפשר רזולוציה ודיוק טובים יותר.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מורכבות התגובה של המוח לפגיעה איסכמית, ניתן להחיל אותה גם על מצבים חריפים או כרוניים אחרים שבהם הוצע תפקיד כפול למקרוגליה ומקרופאגים בתהליכי פגיעה ושיקום. או במקרים שבהם יש צורך במיקום סלקטיבי של אותות במישורי מרחב שונים, קרלו פריגו וסטפן אוף מגאלי ידריכו אתכם בשלבים השונים של הפרוצדורה. הפרוטוקול הבא משתמש ברקמת מוח של עכבר שבה הושרה איסכמיה על ידי חסימה קבועה של העורק המוחי האמצעי.השתמשו בקריוסטט לאיסוף חתכים קורונליים סדרתיים של המוח בעובי 20 מיקרון על ג'לטין. השתמשו בפסליות מכוסות והביאו את כל הריאגנטים והדגימות לטמפרטורת החדר לפני השימוש. שימו לב כי דילול העבודה של הנוגדנים והסרום המפורט במסמך הנלווה התקבל כתוצאה מניסויים שנועדו להשיג את הביצועים המיטביים בעת שימוש בנוגדנים ובסרומים שונים.יש לתקף את הפרוטוקול. התחל בסימון מעגלים סביב החתכים על השקופית באמצעות עט חוסם נוזלי כדי לצמצם את כמות הריאגנטים הדרושה. לאחר מכן, העבר את חתכי המוח לתא לחות באמצעות פיפט של 1 mL.הוסיפו PBS בטמפרטורת החדר לחתכים והדגירו למשך חמש דקות לצורך שטיפה. לאחר מכן, בעזרת מזרק חד-פעמי של 1 mL עם מחט, הסירו את התמיסה וחזרו על השטיפה פעם נוספת. לאחר הסרת השטיפה השנייה, המשיכו לצבוע את הדגימות תוך שימוש בפיפטה של 1 mL ובמזרק חד-פעמי לכל החלפות התמיסה. יש לבצע את הליך הצביעה כפי שסוכם כאן.יש לעיין בטקסט הנלווה לפרטים נוספים, כולל שלבי השטיפה. ראשית, התאים מדוגרים עם 1% hydrogen peroxide לאחר חסימה באמצעות normal goat serum. לאחר מכן, הם מדוגרים עם נוגדן ראשוני נגד CD 11 B. בשלב הבא, השקופיות מדוגרות עם נוגדן שני מתאים, ולאחריו triss, NACL tween buffer, או TNT, ולאחר הדגירה עם TNB, משתמשים ב-triss, H-C-L-N-A-C-L, blocking buffer, או TNB.מדליקיות הזכוכית מדוגרות עם streptavidin HRP ולאחר מכן עם תמיסת דילול להגברה המכילה cyanide five tyrom, אשר תגביר את האות האימונופלואורסצנטי. לאחר מכן, המדליקיות מדוגרות עם NGS כדי לחסום אתרי קישור לא ספציפיים. לאחר מכן הן מדוגרות עם נוגדן ראשוני נגד CD 68.לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני, מדגרים את התאים בנוגדן משני מתאים המצומד לפלואורופור, ולאחר מכן מוסיפים 1 µg/mL של hooks לסומון ה-DNA. עם השלמת הצביעה, מקבעים את נתחי הקריו (cryo sections) באמצעות prolonged gold; בעת קיבוע הנתחים, יש להימנע מיצירת בועות אוויר. יש לאחסן את הנתחים בטמפרטורה של 4 °C בחשיכה עד לניתוחם.יש לבצע את רכישת האות הפלואורסצנטי בתוך שבוע. פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ IX 81 המצויד ביחידת סריקה קונפוקלית FV 500 בעלת שלושה קווי לייזר: ארגון-קריפטון ב-488 nanometers, הליום-ניאון אדום ב-646 nanometers והליום-ניאון ירוק ב-532 nanometers, בתוספת דיודה UV בתוכנת ה-flu of U 500. יש לבחור את לייזרי העירור ואת המראות הדיכרואיות המתאימים.בנוסף, הגדירו רזולוציית תמונה של לפחות 800 על 600 פיקסלים. לאחר מכן, הניחו את הפלסיה עלבמת המיקרוסקופ ובאמצעות פלואורסצנציית epi, זהו אזור עניין והגדילו בהדרגה את ההגדלה עד לעדשה עם הגדלה של 40 x. לאחר מכן, עברו למוד של מיקרוסקופיית סריקה לייזר ובצעו סריקות חוזרות תוך התאמת רמת ההספק של הפוטומולטיפליקטור וההגבר (gain) עבור כל ערוץ.פעולה זו תפחית חפיפת אותות הנגרמת מהעברה סימולטנית של עירור באורכי גל שונים. יש לשמור על הגבירה (gain) נמוכה ככל האפשר כדי למנוע אותות לא ספציפיים לא רצויים. תוך כדי המשך הסריקה החוזרת, כוונן את המיקוד והגדר את הקצוות התחתון והעליון של ציר Z עם אורך כולל של ציר Z של 10 microns.לאחר מכן, הפסיקו את הסריקה החוזרת. בשלב הבא, הזינו את גודל הצעד. הוא צריך להיות קרוב ככל האפשר לגודל הפיקסל, שהוא 0.225 microns.פעולה זו תספק יחס גודל סטנדרטי של אחד-לאחד לאורך ציר Z בתוכנה. הפעילו את מסנן קלמן (kalman filter) לפחות פעמיים. אלגוריתם קלמן הוא פונקציה איטרטיבית המסירה אותות רנדומליים, כגון ווקסלים חיוביים בודדים השייכים לרעשי רקע, ובכך משפרת את יחס האות לרעש. כעת הפעילו את מצב הסריקה הרצפית כדי למנוע אפקטים של דילוף (bleed through).עברו לנקודת האמצע של ציר ה-Z והפעילו סריקה רצפית של XY. בדקו את הגדרות ה-PMT וההגבר (gain) כדי להבטיח יחס אות לרעש משביע רצון. בצעו רכישת נתונים של XY ו-Z לאחר הרכישה.ייצאו את הנתונים כקובץ multi TIF. כל קובץ multi TIF מכיל בדרך כלל שלושה ערוצי צבע ו-44 מישורי מיקוד לעיבוד. התחילו בפתיחת תוכנת imas.ראשית, בחרו בתצוגת ה-surpass, ולאחר מכן העלו את קובץ ה-multi TIF. בשלב הבא, בפאנל כיוונון התצוגה, בחרו כאן את הצבע הרצוי עבור כל ערוץ. אדום מייצג CD 11 B, ירוק מייצג CD 68, וכחול מייצג את צביעת ה-DNA של ה-hooks. כדי להסיר רעשים מהרקע, הגבירו את הערך המינימלי בפאנל כיוונון התצוגה עבור כל ערוץ.לאחר מכן, עברו לתצוגת החתך (section view) כדי להציג מישור מוקד XY בודד עם היטלים אורתוגונליים של צירי ה-x, Z ו-YZ. התקדמו לאורך ציר Z בחיפוש אחר קולוקליזציה, המופיעה כפיקסלים צהובים. לחצו על אזור צהוב כדי לבדוק אם הקולוקליזציה קיימת לאורך ציר Z, מה שמעיד על כך שהיא שייכת לאובייקט מוצק לאורך ציר Z.ההטלות גלויות בחלק הימני והתחתון של האיור. צלם תמונת מצב (snapshot), ולאחר מכן חזור לתצוגת ה-surpass. בשלב הבא, בתפריט הנפתח של העריכה (edit), בחר ב-crop 3D וסמן אזור עניין (region of interest) כדי לבודד תא בודד או מקבץ של תאים.לאחר מכן, בלוח כוונון התצוגה, בחרו ערוץ אחד. בחרו בבנאי האלגוריתם surpass surfaces. כדי להגדיר את האלגוריתם, בחרו תחילה בערוץ.לאחר מכן, הגדירו את הסף (threshold) כערך המינימום שנקבע בלוח כוונון התצוגה, והגדירו שינוי גודל (resizing) במידת הצורך. בשלב הבא, הגדירו את ההחלקה (smoothing) כ-0.200. בחרו את לוח הצבעים ושנו את המראה לפי הצורך.חזור על ההגדרות של בונה האלגוריתם surpass surfaces עבור כל ערוץ. לאחר מכן, בלוח התאמת התצוגה, בטל את הבחירה בערוצי הפלואורסצנציה ובחר את שלושת המשטחים. לבסוף, הזז את הנפח כדי למצוא את התצוגה הטובה ביותר וצלם תמונה (snapshot) כדי לקבוע את דפוס הביטוי המשותף של סממני MM.הפרוטוקולים לאימונופלואורסצנציה ורכישת דימויים במיקרוסקופ קונפוקאלי המתוארים בסרטון זה בוצעו במודל עכבר לאיסכמיה מוקדית שהודעת על ידי חסימה קבועה של העורק המוחי האמצעי. מבט דו-ממדי של התמונות שנרכשו מראה כי 24 שעות לאחר האיסכמיה, הסמן הליזוזומלי CD 68, המוצג בירוק, מובע בתאי CD 11 B חיוביים היפרטרופיים, הנראים באדום, הנמצאים בליבה האיסכמית. היטל ציר Z המוצג בפינה הימנית התחתונה מדגים כי התפלגות הסמנים שתועדה במבט במישור בודד קיימת גם לאורך ציר Z באזור הגבולי.תאים חיוביים ל-CD 11 B מציגים גופי תא היפרטרופיים עם שלוחות החיוביות להן ל-CD 68 גבוהה, מה שמרמז כי פגוזומים קשורים לממברנת התא. הדבר מעיד על התנהגות PHA חומצית פעילה של תאי מיקרוגליה לצורך הערכת ביטוי משותף של CD 68 ו-YM one, סמן של קיטוב M two. התמונות הפלואורסצנטיות עברו רינדור תלת-ממדי.המבט התלת-ממדי של התמונות שנרכשו המוצגות כאן מצביע על נוכחותם של תאים חיוביים ל-CD 68 המוצגים בירוק ותאים חיוביים ל-YM one המוצגים בווקסלים פלואורסצנטיים אדומים. כאשר אלו מונחים במקביל, מבטו של הצופה עשוי להניב אות עם לוקליזציה משותפת (co localization) הנראה כצהוב, דבר שעלול שלא להיות קשור למרחק הממשי בין הסמנים. כדי להגדיר לוקליזציה משותפת.יש להפיק תצוגה של מישור בודד עם היטלים של ציר Z תוך כדי תנועה לאורך ציר Z. המטרה היא חיפוש לאחר-מיקום (colocalization). היטל ציר Z מתקבל כפי שניתן לראות בחלק הימני והתחתון של תמונה זו.ניתן להפוך ווקסלים פלואורסצנטיים לאובייקטים מוצקים באמצעות רינדור תלת-ממדי, תוך שיוך ביטוי של סמן לגוף תאי ספציפי. לאחר הגדלה גבוהה ורינדור תלת-ממדי, שני הסמנים נראים כשייכים לתאים שונים הנמצאים בקרבה רבה זה לזה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקת אימונופלואורסצנציה עם מספר סמנים וצבעים, וכיצד לרכוש ולהציג בצורה נכונה תמונות תלת-ממדיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית.בנוסף, ניתן לנצל ביעילות את ניתוח עיבוד הנתונים (post-processing) המתואר כדי לנתח ביטוי משותף (co-expression) או קולוקליזציה (colocalization) ברמה התאית, או במקרים שבהם יש צורך במיקום סלקטיבי של אותות במישורים מרחביים שונים.

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

טראומה מוחית חריפה היא פגיעה חמורה שאין לה טיפול הולם עד כה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד אורכי התהליך של התפתחות טראומה המוחית חריפה וחיטוט אסטרטגיות טיפוליות במכרסמים. שני דגמים של טראומה מוחית חריפה למדה אצל בשני פוטונים הדמיה vivo של המוח הם הפגינו בפרוטוקול זה.

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

ניתן להשתמש בהדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים כדי לחקור אינטראקציות בין סוגי תאים שונים בחוט השדרה בסביבת הרקמה הטבעית שלהם בחיה כימרית של מח עצם עם פגיעת ריסוק טראומטית של חוט השדרה בעמוד הגב.

ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

מיקרוגלייה הם תאים חיסוניים המוח כי סקר ולהגיב המוח שינו פיסיולוגיה באמצעות שינויים מורפולוגיות אשר עשויים להעריך באופן כמותי. זה מתאר פרוטוקול ImageJ מבוסס פרוטוקול ניתוח כדי לייצג מיקרוגלייה מורפולוגיה רציפה לנתונים על פי מדדים כגון הסתעפויות תא, המורכבות צורה.

לכימות מיקרוגלייה מורפולוגיה של Photomicrographs של אימונוהיסטוכימיה מוכן רקמות באמצעות ImageJ

פרוטוקול זה מתאר את תהליך העבודה צעד אחר צעד עבור אימונוofluoroocoooooooiood של IBA1 ו TMEM119, בנוסף ניתוח של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם חדירת תאים מיאלואידית היקפית ברקמת המוח העכבר.

Immunofluorescence צביעת באמצעות IBA1 ו TMEM119 עבור צפיפות Microglial, מורפולוגיה וניתוח הסתננות מיאלואידית תא היקפית במוח העכבר

דימום אינטרפרנכימלי ודלקת עצבית המלווה בחבלה מוחית עלולים לגרום לפגיעה מוחית משנית חמורה. פרוטוקול זה מפרט מודל השפעה קליפתית מבוקרת עכבר (CCI) המאפשר לחוקרים לחקור דימום, קונטוזיה ותגובות חיסוניות פוסט-טראומטיות ולחקור טיפולים פוטנציאליים.

מודל השפעה קליפת המוח מבוקרת פרה-קלינית עבור דימום טראומטי, חבלה ודלקת עצבית

פרוטוקול זה מציג שיטות לאפיון התגובה הנוירו-דלקתית וההמודינמית לפגיעה מוחית טראומטית קלה ולשילוב נתונים אלה כחלק מניתוח מערכות רב-משתניות תוך שימוש ברגרסיה חלקית של ריבועים מזעריים.

ניתוח מערכות של התגובה הנוירו-דלקתית וההמודינמית לפגיעה מוחית טראומטית

תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

הפרוטוקול מתאר פגיעה מוחית טראומטית קלה במודל עכבר. בפרט, פרוטוקול שלב אחר שלב לגרימת פגיעת ראש סגורה קלה בקו האמצע ואפיון מודל בעלי החיים מוסבר במלואו.

מודל ראש סגור מבוקר אלקטרומגנטי של פגיעה מוחית טראומטית קלה בעכברים

זיהוי מיקרוגליה (MG) ומקרופאגים חודרים היקפיים (Mø) בחוט השדרה הפגועים הוא קשה. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בזרימה ציטומטרית (FCM) לזיהוי MG דמוי M1, MG דמוי M2, M1 דמוי Mø ו-M2 דמוי Mø, בהתאמה. ניתן ליישם טכנולוגיה זו גם על מחלות אחרות של מערכת העצבים המרכזית כדי להבין את תפקידם של MG ו-Mø.

זיהוי מיקרוגליה ומקרופאגים חודרים היקפיים בחוט השדרה הפגוע באמצעות ציטומטריית זרימה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקוד תאי החיסון לאחר שבץ איסכמי באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרי במודל מיני שבץ. שיטה זו מאפשרת בחינה מפורטת של אינטראקציות נוירואימוניות וניתן להתאים אותה לחקר מחלות ניווניות אחרות, מה שמשפר את ההבנה שלנו לגבי תגובות חיסוניות בפתולוגיה של שבץ מוחי.

בידוד והערכה ציטומטרית של זרימה של אינטראקציות נוירואימוניות במודל עכברי מיני שבץ

תוכנת מיפוי פרמטרים מיקרוגליאליים (MMPS) היא צינור ניתוח ידידותי למשתמש שאינו דורש מומחיות בקידוד ומבצע ניתוח מורפולוגיה מיקרוגליאלית חד-תאית מתמונות אימונופלואורסנציה. מאומת במודל דלקת עצבית המושרה על ידי ליפופוליסכרידים, MMPS מזהה באופן שכפולי שינויים מורפולוגיים הקשורים להפעלה ומאפשר פנוטיפינג מיקרוגליאלי סטנדרטי וניתן להרחבה.

תוכנת מיפוי פרמטרים מיקרוגליאליים (MMPS): כלי קוד פתוח וידידותי למשתמש לניתוח כמותי של מורפולוגיית מיקרוגליה

למד ניתוח קונפוקל תלת-ממדי של מיקרוגליה ומקרופאגים במודל עכברים לאיסכמיה מוחית מוקדת. שיטת אימונופלואורסצנט מספקת רזולוציה משופרת לזיהוי סמני פעילות תאית ותובנות לתגובה הדלקתית במוח.

ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

גלה סרטונים נוספים