Name: Permeabilization של תאים דבקו שימוש בגז אינרטי Jet (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: למדו שיטת חדירה זמנית לתאים דבקים באמצעות זרם גז אינרטי. טכניקה זו מאפשרת העברה יעילה של חומר גנטי וביומולקולות לתאי יונקים דבקים ללא פגיעה בחיוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למקורות המימון הבאים: מכון קנדי ​​לבריאות מחקר (CIHR), מדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר (NSERC).

1. פיתוח של תכנית LabView <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה המונית בקר (MKS M100B Mass-Flo Controller) מחובר לקו גז הליום כדי להבטיח זרימת גז שיעור מדויק. יחידה זו נשלטת על ידי מתח הזנה, הנעה בין 0 ל 5 V. לולאת שליטה בתכנית LabView קובעת את המתח הנדרש בכל זמן נתון. ממשק בין המחשב ואת הזרימה ההמונית בקר מבוצע על ידי מכשיר רכישת נתונים (USB-6009 NI), ו12 V אספקת חשמל מספקת חשמל לזרימה ההמונית בקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי שקופיות ליניארי המיצוב משמשות כדי לשלוט על התנועה של צלחת 6 היטב, אחד לכל כיוון. כל מכלול מורכב מעצרת Unislide Velmex MA15-סדרה יחד עם מנוע דריכה ושני המכלולים נשלטים על ידי Velmex VXM אחד דורך מוטורי Controller. הבקר מאפשר ריצה ידנית של כל מנוע או מקבל מחרוזת של פקודות סידוריים חיצוניות, השילוב של אשר מאפשר עבור p תנועה הספציפיatterns. כמה דפוסים ניתן לתכנת לתכנית LabView, המחייבים את המשתמש על מנת לספק רק את מהירות לפיד הרצויה, כמו גם את ממדי הנתיב. </li></ol> 2. הכנת הציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שני הצילינדרים הליום והרגולטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את בקר המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תכנית LabView ולאמת את כל התנאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהפלטפורמה היא מרוכזת. כדי לבדוק זאת, נראה בכל שלב מוטורי ולוודא שכל קרון הוא לא ליד כל קצה במה. או שיש לי מרכז תכנית הכרכרות או להתאים באופן ידני על ידי שימוש בפקדי הריצה על החלק הקדמי של בקר המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זה הריצה הראשונה של היום, מומלץ להפעיל את התכנית פעם אחת ללא תאים, כדי להבטיח את ההתקנה הוא עובדת בצורה נכונה. </li></ol> 3. הכנת גובה גז Jet נימי Nozzle <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נימי מבעל ולהתמקד בחיוג הגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את o צלחת 6 היטבn הפלטפורמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף ולהקטין את נימי סילון גז לתחתית הבאר עד שהוא פוגע להחליק את המכסה. אבטח את הנימים בבעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחיוג הגובה, להעלות את נימי מ&quot;מ 3. סמן גובה זה על בסיס הנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את הנימים לגובה בטוח ולאחר מכן להסיר את צלחת 6 באר. </li></ol> 4. תא permeabilization פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורת תאים חסיד תרבות למפגש בכיסוי זכוכית מחליקה בצלחת 6 היטב תוך שימוש בטכניקות culturing סטנדרטיים. לתאי הלה, 6 צלחות היטב זרע עם 2 x 10 5 תאים לכל היטב דגירה ל48 ​​שעות לפני הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנפח מתאים של תמיסה המכילה את הווקטור הרצוי. לhrGFPII-1, ריכוז של 50 ng / μl ב 1x PBS מספק אות ניאון חזקה בתאי הלה 24 שעות לאחר transfection. ללימודים dextran, 80 מיקרוגרם / מיליליטר של 10 dextran פלואורסצנטי הירוק kDa מומלץ. מכאן ואילך, פתרון זה יכונהשל &quot;פתרון וקטור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת תרבית תאים מהיטב ולשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1,370 μl של פתרון וקטור מוכן בשלב 4.2 לטוב. זה אמור לגרום לעומק נוזל של כ 1.3 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח גם מכיל את פתרון הווקטור במרכז הבמה. מנמיכים את נחיר סילון גז לרמה המסומן בעבר שמעיד על גובה פייה של 3 מ&quot;מ מעל השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר קצב זרימת הליום בתכנית LabVIEW ובחר את דפוס תנועה הרצויה לשימוש. בחר &quot;הפעלה&quot; כאשר מוכן להתחיל את פרוטוקול permeabilization. יהיה תקופת פיגור ראשונית שבמהלכו הזרימה ההמונית בקר נערך לספק את קצב הזרימה הנדרש. ברגע שכבר הגיע לקצב הזרימה המתאים, התכנית LabVIEW תפעיל מנועים stepper לנוע גם בדפוס permeabilization הרצוי. ברגע שהפלטפורמה הפסיקה, לחכות כ 30 שניות ולהסיר את פתרון הווקטור.הערה: permeabilization האופטימלי מתרחש ליד לחץ דינמי של 100-200 אבא ביציאת הזרבובית, תלוי בקוטר הנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב שלוש פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא גם עם תקשורת ותרבות טריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3-4.6 למספר רצוי של ניסויים. הערה: הקפד לכלול דגימות בקרה אשר מורכבת של בארות שמלאות בפתרון הווקטור בלי סילון הגז שנדרס. השאר את הפתרון בבארות שליטה לכ 1 דקות ולאחר מכן להמשיך לצעדים 4.5 ו4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מפעיל ניסוי transfection hrGFP, לחזור צלחת 6 היטב לחממה ל24 שעות כדי לאפשר לחומרי transfected להיות עיבד ידי התאים. אם מפעיל ניסוי permeabilization dextran, לחזור צלחת 6 היטב לחממה ל15 דקות. </li></ol> 5. תא הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, מייד לפני הדמיה, counterstain עם כתם חי / מת מתאים כדי להעריך את המוות של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה עם appropמיקרוסקופ riate לחקור יעילות transfection / permeabilization. </li></ol>

<ol><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+humans--immunotherapy+of+patients+with+advanced+melanoma%2C+using+tumor-infiltrating+lymphocytes+modified+by+retroviral+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction.</a> The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immunity+to+viral+antigens+limits+E1-deleted+adenoviruses+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).</li>
<li>Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+method+for+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).</li>
<li>Rauth, S., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+DNA+Transferred+into+Mammalian-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells.</a> J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).</li>
<li>Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-mediated+gene+transfer+%28electroporation%29+into+mouse+Friend+and+human+K562+erythroleukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+analysis+techniques%22%5BJournal%5D)">Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells.</a> Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).</li>
<li>Fechheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+plasmid+DNA+by+scrape+loading+and+sonication+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).</li>
<li>Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhancement+of+liposome-mediated+cell+transfection+is+caused+by+cavitation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li>
<li>Hallow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+intracellular+loading+of+cells+with+molecules+by+controlled+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).</li>
<li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li>
<li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

permeabilization סילון גז אינרטי הוא טכניקה שימושית עבור transfection תא חסיד. הוא מספק את היכולת להעביר ביומולקולות לתוך תאים תוך השימוש בכוחות מכאניים, שמבטל את הצורך בכימיקלים מזיקים או וקטורים ויראליים. הטכניקה שעלול לתת לחוקרים וקלינאים דרך יעילה ופשוטה יחסית לtransfect בדיוק תאים. הסלקטיביות של permeabilization היא גם ייחודית ומאפשר לחוקרים לטיפול רק תאים מסוימים במושבה אחת אשר יכול להיות שימושי ביישומים מרובים. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:...

עם ההתפתחות של ביו וההבנה של מכניקת תא, המשלוח של ביומולקולות לתוך תאים הפך להיות חיוני לתחומי מחקר רבים וטיפולים רפואיים. טכניקות שונות פותחו כדי להציג את המולקולות זרות דרך קרום הפלזמה ולתוך cytosol התא. יכולים בדרך כלל להיות מסווגים אלה כמו גם: טכניקות ויראלי, כימיים או מכאניות. טכניקות ויראלי יכולות transfect חומר גנטי כמו רנ&quot;א ודנ&quot;א באמצעות וקטורים ויראליים 1. טכניקות ויראלי נוטות להיות בעלי יעילות גבוהה בשורות תאים מסוימות, עם זאת יש להם את הפוטנציאל לתגובות חיסוניים ודלקתיות 2 הם. שיטות transfection הכימי נפוצות כוללות משקעים סידן פוספט 3, exotoxins חיידקי 4 וlipofection 5. טכניקות אלו הוכחו כיעילים, אך בעיות מסוימות מתעוררות כגון רעיל לתא ושאינו ספציפי. יתר על כן, בטכניקות כגון פוספט סידןממטרים דואר כבר נמצאו יעילות transfection עד 70% אלא רק בשורות תאים מסוימות, רק לעתים נדירות בתאים ראשוניים 6. זה ראוי לציון כמו מאמצי מחקר הגדלת מתבצעים הכניסו לתוך תאים ראשוניים, במיוחד במקרה של עיצוב טיפולים שונים לשימוש קליני והמחקר של תפקוד ה-DNA. שיבוש זמני של קרום התא באמצעות גירויים מכאניים הוא חלופי להחדרת מולקולות זרות לתוך תאים. טכניקות כוללות: microinjection של מולקולות 7, electroporation באמצעות שדה חשמלי כדי לשבש את הקרום 8,9, sonoporation באמצעות גלי אולטרסאונד כדי לשבש את קרום התא 10-12, הפצצת חלקיקים כפי שהודגם על ידי &quot;אקדח הגן&quot;, שיורה בחלקיקים קשורים עם גנים לתוך התא 13, ולאחרונה, את היישום של מתח גזירה נוזל שהוכח permeabilize temporally תאי יונקים 14,15. למרות שמכונאישיטות אל חלק מהנושאים הנ&quot;ל להימנע, הם מלווים בדרך כלל על ידי יעילות והגדרות מאוד מורכבות ומיוחדות יותר. לפיד אטמוספרי הפרשות זוהרים לחץ (APGD-t) פותח במקגיל עם המטרה הראשונית של functionalizing משטחים וניתוק תאים חסיד במבחנה 16. דרך מקרה, התגלה כי כתם חי / מת בשימוש היה איכשהו שנלקח על ידי תאים מבלי שהוסיף סוכן permeabilizing. יתר על כן, זה נראה שהתרחש רק באזורים המוגבלים של הבארות שקרתה לי להתאים את נתיב הלפיד. חקירת יכולות permeabilization של APGD-t המשיכה במחקרים בקרה, נמצא כי סילון גז אינרטי הספק של הפלזמה ללא עירור היה גם מסוגל permeabilize תאים. זאת בניגוד להשערה הראשונית כי המינים תגובתי נוצרו על ידי סילון הפלזמה באופן זמני לקוי תפקוד הקרום והציעה שפשוט mechaniכוחות קאל היו מספיקים כדי לגרום permeabilization תא. מכאן, המשך לימודים במעבדה שלנו כדי לנסות ולכמת ולאפיין את יעילות permeabilization של סילון גז אינרטי, כמו גם מבט על יכולות transfection 16. באמצעות מחקרים אלה, זה כבר גילה כי micropores לעשות בצורת עובדה בקרום הפלזמה, ונקבובי אלה נוטים לאטום בתוך כ 5 שניות 15. אנחנו הוכיחו התועלת של הטכניקה במבחנה in vivo בקרום chorioallantoic של עובר אפרוח.

<table><tbody><tr><td>Vitality hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td><td>חלבון פלואורסצנטי ירוק לניסויי טרנספקציה על תאי HeLa</td></tr><tr><td>Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>D22910</td><td>דקסטרן לניסויי חדירות</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD כדאיות/ערכת ציטוטוקסיות</td> Life <td>Technologies Inc.</td><td>L3224</td><td>לצביעה נגדית של תאי יונקים</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>להרכבת שקופיות בעת הדמיית</td></tr><tr><td>Ultra High Purity</td><td>Helium Praxair Canada Inc.</td><td>HE 5.0UH-T</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/ מדיה גבוהה של גלוקוז - 500 מ"ל</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td>לתאי HeLa</td></tr><tr><td>סרום</td><td>בקר עוברי Invitrogen</td><td>26140079</td><td>למדיה DMEM</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין,</td><td>Invitrogen</td><td>נוזלי 15140-122</td><td>למדיה DMEM</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>מיוצר במעבדה</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><חזק>טבלה 1</חזק>. רשימת הריאגנטים הנדרשים</td></tr><tr><td>6-Well Clear TC-Treated Microplates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>#1 22 x 22 כיסויים</td><td>פישר</td><td>12-542B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>World Precision Instruments</td><td></td> מזהה <td>מידע על גודל WPI</td></tr><tr><td>(מ"מ): 1, 0.86, 0.68, 0.5 הזמנה #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקר Mass-Flo</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>בקר זרימת מסה, סדרה M100B, דורש ספק כוח חיצוני של 12 וולט</td></tr><tr><td>USB-6009 DAQ Device</td><td>National Instruments</td><td>779026-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מכלול UniSlide עם מנוע צעד ובקר</td><td>מכלולי MA15 UniSlide מסדרת Velmex שתיים, מצוידים במנועי צעד Vexta 1.8&deg המסופקים על ידי Velmex, ונשלטים על ידי בקר מנוע צעד VXM</td><td></td>&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><חזק>טבלה 2.</חזק> רשימת הציוד הנדרש</td></tr></tbody></table>

permeabilization של תאים דבקו שימוש בגז אינרטי jet

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

טכניקות transfection התא שונות קיימות ואלה יכולים להיות מחולקים לשלוש קטגוריות רחבות: ויראלי, כימי ומכאני. פרוטוקול זה מתאר שיטה מכאנית לpermeabilize temporally תאים חסיד באמצעות סילון גז אינרטי שיכול להקל על העברת בדרך כלל מקרומולקולות שאינן חדירות לתאים. אנו מאמינים כי טכניקה זו עובדת על ידי הקניית כוחות גזירה על קרום הפלזמה של תאים חסיד, וכתוצאה מכך היווצרות הזמנית של micropores. ברגע שהנקבוביות הללו נוצרו, התאים ולאחר מכן חדירים לחומר גנטי וביומולקולות אחרת. הכוחות מכאניים המעורבים אין להפעיל את הסיכון של תאים באופן קבוע מזיקים או ניתוק מהמצע שלהם. יש, אם כן, טווח צר של דינמיקת גז אינרטי בי הטכניקה היא יעילה. סילון גז אינרטי הוכיח יעיל בpermeabilizing שורות תאים חסיד שונות, כולל הלה, HEK293 ותאי האנדותל של אב העורקים בבטן אנושי. פרוטוקול זה הוא מתאים לעמermeabilization של תאים חסיד הן במבחנה, כפי שכבר הוכיחו, in vivo, מראה שהוא עשוי לשמש למחקר ופוטנציאלי ביישומים קליניים בעתיד. כמו כן, יש את היתרון של permeabilizing תאים בצורה מרחבית מגבילה, אשר יכול להוכיח להיות כלי מחקר חשוב.

Permeabilization של תאי הלה עם 10 dextran פלואורסצנטי הירוק kDa באמצעות סילון גז הליום עם 0.86 מ&quot;מ נימי קוטר פנימיים מוצג באיור 1. תאים היו counterstained מייד לאחר permeabilization עם פתרון 2 μl / מיליליטר EthD-1 (LIVE / DEAD הכדאיות / Cytotoxicity Kit) כדי לחזות מוות של תאים. מייד לאחר counterstaining, מכסה מחליק היו רכובים וצלם. נתון זה מראה את תוצאות של הפעלת סילון גז הליום בשלושת לחצים לשקע שונים בהשוואה למדגם שליטה. שים לב שרוחב מסלול permeabilization ו...

פרוטוקול זה מתאר שיטה לpermeabilization הזמני של תאים חסיד באמצעות סילון גז אינרטי. טכניקה זו מאפשרת ההעברה של חומר וביומולקולות גנטיים לתאי יונקים חסיד על ידי הניצול של כוחות מכאניים כדי לשבש את קרום הפלזמה.

Permeabilization של תאים דבקו שימוש בגז אינרטי Jet

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע פרמיליזציה של תאים דבקים. הדבר מושג תחילה על ידי גידול של תאי הניסוי על לביבות זכוכית (cover slips) בלוחות של שישה בארות. השלב השני הוא שטיפת התאים ב-XPBS וכיסויים בתמיסה המכילה את הביומולקולה שמעבירים אל תוך התא.בשלב הבא, מעבירים סילון של גז אינרטי. הדגימה חדירה לתאים. השלב הסופי הוא קיבוע וצביעה של התאים, במידת הצורך.בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיית אימונופלורסצנציה כדי להראות את יעילות החדירה ואת חיוניות התאים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון פליפורציה (proliferation) או רובי גנים (gene guns), הוא שניתן להקימה בקלות והיא מאפשרת חדירה מוגבלת מרחבית של תאים נצמדים. בתרבית, בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את הטכניקה עלולים להיתקל בקשיים, מכיוון שייתכן ויידרש זמן כדי לדייק פרמטרים מסוימים, כגון קצב זרימת הגז או קוטר הנימי, כדי לאפשר חדירה יעילה ביישומים הספציפיים שלהם.בקר זרימת המסה המשמש בהליך זה דורש ספק כוח חיצוני של 12 vol ומחובר לקו גז הליום כדי להבטיח קצב זרימת גז מדויק; הממשק בין בקר זרימת המסה למחשב מבוצע באמצעות התקן לרכישת נתונים. יחידה זו נשלטת על ידי מתח כניסה הנע בין אפס לחמישה וולטים. לולאת בקרה בתוכנת ה-lab view קובעת את המתח הנדרש בכל רגע נתון.שני מסלולי החלקה ליניאריים למיקום משמשים לשליטה בתנועת פלטת שש הבארות, אחד עבור כל כיוון. כל מכלול מורכב ממכלול uni slide מסדרת MA 15 של Velm X המחובר למנוע פסיעות, ושני המכלולים נשלטים על ידי בקר מנועי פסיעות VELM XVXM יחיד. הבקר מאפשר הנעה ידנית של כל מנוע או קבלת מחרוזת של פקודות טוריות חיצוניות.השילוב ביניהם מאפשר דפוסי תנועה ספציפיים. ניתן לתכנת מספר דפוסים בתוכנת ה-LabVIEW, כך שהמשתמש נדרש לספק רק את מהירות הלפיד הרצויה ואת ממדי הנתיב. התחילו בהכנת הציוד על ידי פתיחת both של גליל ההליום והווסת, והפעילו את בקר המנוע.פתחו את תוכנת LabVIEW וודאו שכל התנאים תקינים. לאחר מכן, ודאו שהפלטפורמה ממורכזת לבדיקה. בחנו כל שלב מנוע וודאו שכל זרוע אינה קרובה לקצוות השלב, ולאחר מכן הפעילו את התוכנה למירכוז הזרועות.אם זו הפעולה הראשונה להיום, מומלץ להריץ את התוכנית פעם אחת ללא תאים כדי לוודא שההגדרות פועלות כראוי. כדי להכין את גובה פיית הנימי של ה-gas Jett, הוצא את הנימי מהמחזיק ואפס את חיוג הגובה. הנח את הפלטה בעלת שש הבארות על הפלטפורמה.החליפו את קפילרת סילון הגז והורידו אותה לתחתית הבאר עד שתיגע בלוחית הכיסוי. קבעו את הקפילרה במחזיק באמצעות חוגת הגובה. העלו את הקפילרה שלושה מילימטרים, וסמנו גובה זה על בסיס הקפילרה.לבסוף, הרם את הקפילריה לגובה בטוח ולאחר מכן הוצא את הפלטה בעלת שש הבארות. יש לגדל את שורת התאים הנצמדים עבור פרוטוקול זה עד להגעה לקונפלואנציה על לוחות כיסוי מזכוכית בתוך פלטה בעלת ש אחת הבארות, תוך שימוש בטכניקות גידול סטנדרטיות עבור תאי helo. זרע את הפלטות בעלות שש הבארות בריכוז של 2×10⁵ תאים לבאר והדגר למשך 48 שעות לפני הטיפול.ביום הטיפול, הכינו נפח מתאים של תמיסה המכילה את הווקטור הרצוי. עבור מחקרי דקסטרין, מומלץ להשתמש ב-80 micrograms per milliliter של 10 kilodalton green fluorescent dextrin, ולהלן. תמיסה זו תיקרא תמיסת ווקטור.הסר את מצע גידול התאים מהבאר ושטוף שלוש פעמים בעזרת XPBS. העבר באמצעות פיפט 1, 370 microliters של תמיסת וקטור אל הבאר. פעולה זו צריכה להביא לעומק נוזל של כ-1.3 millimeters. הנח את הבאר המכילה את תמיסת הווקטור במרכז הפלטפורמה.הורד את פיית סילון הגז לגובה שסומן קודם לכן, המציין גובה פיה של שלושה מילימטרים מעל העגילה. הגדר את קצב זרימת ההליום בתוכנת ה-lab view ובחר את תבנית התנועה הרצויה לשימוש. בחר ב-run.בעת התחלת פרוטוקול החדירה (permeation), תהיה תקופת השהיה ראשונית שבה בקר זרימת המסה נערך לספק את קצב הזרימה הדרוש. להצלחת פרוטוקול זה, חשוב לבצע אופטימיזציה של תנאי הזרימה כדי למזער את עומק התאים ואת התנתקותם. לאחר הגעה לקצב הזרימה המתאים, תפעיל תוכנת ה-LabVIEW את מנועי הפסועים כדי להניע את הבאר בתבנית החדירה הרצויה. ברגע שהפלטפורמה תעצור, יש להסיר את פלטת שש הבארות מהפלטפורמה.המתינו כ-30 שניות ולאחר מכן הסירו את תמיסת הווקטור. שטפו את הבאר שלוש פעמים עם PBS. לאחר השטיפה השלישית, מלאו את הבאר במצע גידול טרי.חזרו על פרוטוקול החדירה למספר הניסויים הרצוי. הקפידו לכלול דגימות ביקורת, המהוות בארים הממולאים בתמיסת הווקטור ללא הרצת סילון הגז מעליהם. השאירו את התמיסה בארי ביקורת למשך כדקה אחת לפני סילוק התמיסה.שטיפת התאים ב-PBS ומילוי הבאר במצע גידול טרי. החזרת פלטת שש הבארים לאינקובטור; במקרה של חדירת דקסטרין, יש להדגיר למשך 15 דקות. לאחר מכן, יש לדגם את התאים באמצעות המיקרוסקופ המתאים כדי לבחון את יעילות החדירה.מוצגים כאן תוצאות של חדירות של תאי HeLa לדקסטרין פלואורסצנטי ירוק במשקל 10 kilodalton באמצעות סילון גז הליום בעל קוטר פנימי של 0.86 millimeter. פאנלים קפילריים A, B ו-C מראים תוצאות של הפעלת סילון גז ההליום בשלושה לחצי יציאה שונים, ופאנל D הוא ביקורת שבה נוסף דקסטרין אך ללא חשיפה לסילון גז ההליום. התאים נצבעו בצביעה נגדית מיד לאחר הפרמיליזציה כדי להנמיך את מות התאים. בתמונות אלו, דקסטרין פולט פלואורסצנציה ירוקה ותאים מתים פולטים פלואורסצנציה אדומה.בפאנלים A ו-B נצפה כי רוחב נתיב החדירה והיעילות עלו עם עלייה בלחץ הדינמי, כאשר נרשמה עלייה קלה בלבד במוות התאי. עם זאת, ברגע שהושג לחץ דינמי גבוה כפי שנצפה בפאנל C, תאי HeLa נשלפו מלוחיות הזכוכית (cover slips) וחדירה היקפית מועטה מאוד נצפתה באמצעות בדיקות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. נקבוביות מיקרוסקופיות (Micropores) נצפו בממברנת התא.בדוגמה זו, בוצעה חדירה של תאי HeLa באמצעות סילון גז הליום עם קפילרה בעלת קוטר פנימי של 0.86 millimeter בלחץ יציאה של 300 Pascals. נרכשו תמונות של מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת בהגדלה של 50,000 x. פאנל A מציג דגימת ביקורת המראה פני תא חלקים, בעוד שפאנל B מציג את פני תא שעבר חדירה המראה נקב בעל קוטר של 84 nanometer. לאחר רכישת המיומנות, טכניקה זו אמורה להימשך בין 15 ל-30 דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר הפרוצדורה, ניתן לבצע צביעות כדי להעריך גורמים נוספים כגון חיוניות התאים.

permeabilization-of-adhered-cells-using-an-inert-gas-jet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול זה מתאר מודל microfluidic שיתוף תרבות לתרבות סימולטני מקומי של תאים וחיידקים אפיתל. מודל זה יכול לשמש חוקר את תפקידם של אותות מולקולריים שונים מסיסים על הפתוגנזה, כמו גם מסך האפקטיביות של זני חיידקים פרוביוטיים המשוערת.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

תיאור של שיטות להמיר HP DeskJet 500 המדפסת לתוך bioprinter. המדפסת מסוגלת עיבוד תאים חיים, מה שגורם הנקבוביות חולפים על הממברנה. נקבוביות אלה יכול להיות מנוצל לשלב מולקולות קטנות, כולל ניאון G-אקטין, לתוך תאים מודפסים.

יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה

שילוב הדור monodisperse טיפה עם סידור אינרציה של תאים וחלקיקים, אנו מתארים שיטה כדי לתמצת המספר הרצוי של תאים או חלקיקים בטיפה אחת בשיעורים kHz. אנחנו מדגימים את יעילות פעמיים העולה על אלו של אנקפסולציה לא מסודרת עבור טיפות יחיד ו פעמיים החלקיקים.

קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

השתמשנו פלזמה משופרת שיקוע כימי להפקיד שכבות דקות החל ננומטר ל -100 ננומטר כמה כמה על חלקיקים בגודל ננו של חומרים שונים. אנחנו לחרוט לאחר מכן את חומר הליבה לייצר nanoshells חלולים אשר חדירות נשלטת על ידי עובי הקליפה. אנחנו מאפיינים את החדירות של ציפויים אלו כדי מומסים קטנים להוכיח כי מחסומים אלה יכולים לספק שחרור מתמשך של חומר הליבה על פני כמה ימים.

אנקפסולציה וחדירות מאפיינים של חלקיקים פלזמה polymerized הולו

jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית ​​עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

דבקות תאים היא המפתח לגישות רבות במחקר ביו-חומרים והנדסת רקמות. טכניקה שלב אחר שלב מוצגת באמצעות כימיה רטובה לשינוי פני השטח של הפולימר החשוב PTFE עם פפטידים.

כימיה רטובה פפטיד קיבוע על polytetrafluoroethylene עבור Cell-הדבקה משופרת

שבב מיקרופלואידי יוצר כדי לייצר זוגות של נקודות זהב ליצירת בועות טנדם ואיים מצופים פיברונקטין לדפוס תא בודד בקרבת מקום. שדה הזרימה שנוצר התאפיין במהירות תמונת חלקיקים ושימש לחקר השפעות ביולוגיות שונות, כולל נקבוביות קרום התא, עיוות ממברנה ותגובת סידן תוך תאית.

מערכת Microfluidic עם דפוסי Surface לחקירת בועת Cavitation (ים) אינטראקציה דו תא ואת Bioeffects הנובע מהן ברמת התא הבודד

דוח זה מתאר טכניקה פשוטה וקלה לביצוע, תוך שימוש בוואקום בלחץ נמוך, למילוי תעלות מיקרופלואידיות בתאים ומצעים למחקר ביולוגי.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

המודלים הנוכחיים של תרבות bilayer אינן מאפשרות לימודים פונקציונלי במבחנה המחקים ויוו microenvironments. שימוש בפוליאתילן גליקול שיטה תבניות תחמוצת אבץ, פרוטוקול זה מתאר את התפתחות קרום המרתף ביונים ודק במיוחד עם נוקשות tunable, נקבוביות, והרכב ביוכימי המחקה באופן הדוק ויוו מטריצה חוץ-תאית.

תרבית תאים זגוגית אלסטי Porated Hydrogels כמו קרום המרתף ביונים עבור כפול

השימוש הידרוג'לים פוטו-הדרגתיים כדי לבודד תאים חיידקיים על ידי שימוש בכלי טפיחה אור ברזולוציה גבוהה מדווח. נהלים ניסיוניים חיוניים, תוצאות ויתרונות של התהליך נבדקים. השיטה מאפשרת בידוד מהיר וזול של חיידקים ממוקדים המציגים פונקציות נדירות או ייחודיות מקהילות או אוכלוסיות הטרוגניות.

ממשקי הידרוג'ל הניתנים לצילום להקרנת חיידקים, בחירה ובידוד

אנו מציגים שיטה להזרקת תאים באמצעות טכנולוגיית הזרקת מים ללא מחט יחד עם המשך של חקירות לאחר הלידה במונחים של כדאיות תאית, התפשטות ומדידות גמישות.

הזרקת תאי סטרומה שמקורם ברקמת שומן חזירית באמצעות טכנולוגיית Waterjet

למדו שיטת חדירה זמנית לתאים דבקים באמצעות זרם גז אינרטי. טכניקה זו מאפשרת העברה יעילה של חומר גנטי וביומולקולות לתאי יונקים דבקים ללא פגיעה בחיוניות.

Permeabilization של תאים דבקו שימוש בגז אינרטי Jet

גלה סרטונים נוספים