בקרה כמותי וזמנית של Microenvironment חמצן ברמה יחיד Islet

המטרה הכוללת של הליך זה היא להחיל היפוקסיה לסירוגין בקנה מידה של דקות על לולאות לבלב בקנה מידה מיקרו כדי לחקור את השפעות ההתניה המוקדמת. זה מושג על ידי ייצור תחילה של מכשיר מיקרופלואידית רב-מודאלי עם קרום חדיר גז דק. השלב השני הוא יצירת מערכת אפנון חמצן ממוחשבת.

לאחר מכן, לולאות נטענות בזהירות לתוך המכשיר, ואז מחברים מיקרופלואידיקה נוזלית וחמצן. השלב האחרון הוא תיאום מיקרוסקופיה עם המיקרופלואידיקה המולטי-מודאלית על מנת לדמיין את פרמטרי העיניים המשתנים במהלך אפנון החמצן. בסופו של דבר, טכניקת היפוקסיה לסירוגין משמשת כדי להראות שתגובת הגלוקוז נפגעת בבירור בהיפוקסיה.

בעוד שמודולציות זמניות של היפוקסיה יכולות לאמן לולאות להגיב עם פחות פגיעה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חמצן מומס או שימוש בתא היפוקסי, הוא הדיוק. ריכוז החמצן יכול להיות מועבר לעפעפיים במרווחי זמן מהירים וזעירים ללא לחץ מוחלט מזרימות מסובכות.

זה גם מאפשר ניטור בזמן אמת עם רצפה ומיקרוסקופיה. מאסטר זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השתלות אלי, כגון הגדרת ליקויים היפוקסיים באתרי השתלה או משטרי התניה מוקדמת לשיפור תוצאות ההשתלה. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי היפוקסיה של אלי.

ניתן ליישם אותו גם על רקמות ומערכות אחרות כגון מערכת העצבים המרכזית, רקמות הלב, הכליה ואיברים מושתלים אחרים. הדגמת וידאו של שיטה זו היא קריטית מכיוון שרבים מייצור המכשיר וידית העפעפיים. השלבים קשים ללימוד בגלל האופי הבין-תחומי החדש של הטכניקה, אך טבועים בבגין המאתגר או המוכר על ידי ייצור שכבת הכיסוי של המכשיר המיקרופלואידי.

כדי להשיג זאת, שפכו DGAs מעורבבים מראש PDMS לגובה של 1.5 מילימטר לתוך צלחת פטרי ריקה ורפא אותה ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, יצרו את השכבה המיקרופלואידית של הגלוקוז עם מאסטר תא שפע על ידי ציפוי ספין של שתי שכבות בעובי 350 מיקרון של SU 8 21 50 ליצירת שכבה אחת של 700 מיקרון על פרוסת סיליקון בגודל 4 אינץ'. לאחר מכן חשוף אותו לאור UV באמצעות מסכת הצילום של שכבת המיקרופלואידית של הגלוקוז כדי להעביר את דפוס המיקרו-ערוצים לשכבת SU שמונה.

שטפו את האזור הלא חשוף עם מפתח SU 8. לאחר מכן, שפכו PDMS מעורבבים מראש על ה-MA עד לגובה של שלושה מילימטרים וריפאו ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר הריפוי, חתוך את שכבת המיקרופלואידית של הגלוקוז לעיצוב והשתמש באגרוף של שני מילימטר כדי ליצור את יציאות הכניסה והיציאה, כמו גם אגרוף בקוטר שמונה מילימטר לתא הראשי.

לאחר מכן, יצר את מאסטר המיקרו באר לקיבוע עפעפיים על ידי ציפוי ספין של שכבה בעובי 100 מיקרון של SU 8 2100 על פרוסת סיליקון נקייה בגודל ארבעה אינץ', ולאחר מכן השתמש בליתוגרפיה UV כדי להעביר את דפוס המיקרו באר לשכבה זו. שטפו את האזורים הלא חשופים עם המפתח לאחר השלמת ה-microwell master. הוסף שתי שכבות של 100 מיקרון של PDMS על ידי ציפוי סיבוב ב-900 סל"ד למשך 30 שניות, ולאחר מכן ריפוי במשך 10 דקות ב-80 מעלות צלזיוס כדי לייצר כל שכבה.

לאחר שתסיים, נקב את הכניסה בקוטר שני מילימטר ביציאות היציאה. לבסוף לייצר את המאסטר המיקרופלואידי של הגז על ידי סיבוב SU 8 בעובי של 2100 עד 100 מיקרון כמו בשכבה הקודמת, ולהעביר את דפוסי המיקרופלואידיקה של הגז שוב באמצעות ליתוגרפיה UV. שטפו את האזור הלא חשוף עם המפתח.

לאחר מכן, שפכו שכבה בעובי 1.5 מילימטר של PDMS על מאסטר המיקרופלואידיקה של הגז ורפא ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן חתוך את ה-PDMS לצורה בעזרת סכין הגילוח. לאחר מכן נקב יציאות כניסה ויציאה בקוטר שני מילימטר לתוך שכבת הכיסוי כדי ליישר קו עם המקום שבו הן נמצאות בשכבות האחרות כדי לחבר את השכבות המרובות יחד.

ראשית, הכינו אותם על ידי ניקוי המשטחים עם סקוטש, חשיפתם לקשת קורונה, ולאחר מכן יישור השכבות ביד בסדר הבא. ראשית, הצמידו את הממברנה לשכבת הגז התחתונה כשבארות המיקרו פונות כלפי מעלה. לאחר מכן קשר את שכבת הגלוקוז המיקרופלואידית על גבי קרום המיקרו באר.

לבסוף, חבר את שכבת הכניסה והיציאה בחלקו העליון, ועוטף את כל המכלול. סיוע ביצירת קשר הדוק על ידי הוספת משקל של קילוגרם אחד על גבי המכלול ואפייתו בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. ואז לדלוף.

בדוק את המכשיר על ידי העמסת מים לשכבה המימית, טבילת המכשיר והזרמת אוויר דרך שכבת הגז עם המזרק תוך חיפוש נזילות. לבסוף, עקר את המכשירים נטולי הדליפות על ידי העברת 70% אתנול דרך השכבה המימית למשך דקה עד שתיים. הגדר את מכשירי המיקרו על ידי חיבור ראשון של כבלי הבקרה של מכשירי המיקרו ליחידות הנהג הכלולות.

לאחר מכן חבר את מנהלי ההתקנים ללוח ה-IO הדיגיטלי ביציאות המתאימות לפקדי תצוגת המעבדה שלהם. לאחר מכן, חבר ספקי-כוח של חמישה וולט ו-20 וולט DC למגעים המתאימים להם ביחידות ההנעה וחבר את ה-IO הדיגיטלי למחשב נייד על מנת לבצע קודי תצוגת מעבדה לבקרת גז כמתואר בנספח של פרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן חבר מתקן מיקרו אחד לחנקן והשני לאוויר דחוס, שניהם מכילים 5% פחמן דו חמצני והגדר את שני הגזים לשני PS. אני מחבר את יציאות המתקן בצומת T לפני הכניסה למכשיר המיקרופלואידי.

לאחר מכן, התקן את המכשיר על הבמה המחוממת של מיקרוסקופ הפוך עם 0% ו -21% חמצן המחובר למכשיר. לאחר מכן, הצב חיישן חמצן סיבים אופטיים בתפוקת הנוזל של המכשיר כדי למדוד את החמצן המומס בתוך הפלט בזמן אמת. לאחר מכן חבר את המכשיר למשאבה פריסטלטית והתחל להזרים מים דרך המכשיר במהירות של 250 מיקרוליטר לדקה.

אפיין את התגובה החולפת של אפנון חמצן על ידי רכיבה על מכשירי המיקרו בין חמישה ל-21% חמצן. חבר משאבה פריסטלטית למכשיר המיקרופלואידי ומקם את הצינור מעל פלטה חמה של 37 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הנוזל לפני שהוא נכנס למכשיר המיקרופלואידי. כמו כן, חבר את יציאת הפלט של מיקרופלואידיקת הגלוקוז לקולט שברים כדי להתחיל לנתח C 57 שישה עכברים שחורים ולבודד את לולאות הלבלב על ידי עיכול קולגנאז והפרדת שיפוע צפיפות F ccal כמתואר בסרטונים הבאים הזמינים מ-JoVE לאחר בידוד.

דגרו את הלולאות במדיום RPMI 1640 המכיל 10% FBS, 1% סטרפטומיצין פניצילין וערימות של 20 מילי-מולארי בצלחות פטרי למשך 24 עד 48 שעות. יש להשתמש בלולאות תוך יומיים כדי להבטיח תוצאות עקביות. לאחר מכן, הכינו מאגר ביקרבונט טרי של קרבס רינגר כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה עם תמיסה אחת המכילה שני גלוקוז מילימולרי ואחרת המכילה 14 גלוקוז מילימולרי.

מחממים את התמיסות בצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר על ידי הנחתם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכינו את הכתם ללולאות המבודדות על ידי הוספת חמישה מיקרומולרים של 4:02 AM ו-DMSO ו-2.5 מיקרו-מולרי של RH 1, 23 ו-100% אתנול לשני מיליליטר של מאגר קרבס המכיל שני מילי-מולרי של גלוקוז. לאחר מכן, הרם לולאות עם פיפטה של 10 מיקרוליטר ודגר אותן בכתם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הצביעה, טען כ-20 לולאות לתוך המכשיר דרך כניסת המיקרו-ערוץ של הגלוקוז. כוון את הלולאות לתא על ידי תחול מאגר מהשקע בחזרה לכניסה. לאחר מכן יש לחלחל את הלולאות ולחצץ למשך 10 דקות כדי לשטוף עודפי צבע.

ראשית, צייר שני מאגר קרבס רינגר ביקרבונט מילי-מולרי דרך המערכת למשך חמש דקות כדי ליצור קו בסיס דופק תקין. לאחר מכן יש לעורר את החדר עם מאגר הגלוקוז של 14 מילי-מולרי למשך 15 דקות, ולאחר מכן שטיפה של 15 דקות עם מאגר הגלוקוז של שני מילי-מולריות. במהלך תהליך זה, רשום את ה-510 ננומטר לשתי פליטות על ידי גירוי הדיאטה 340 ננומטר ו-380 ננומטר.

כמו כן, רשום את פליטת 530 של RH 1 23 על ידי גירוש הצבע ב-480 ננומטר. כדי למזער הפרעות הסעה במהלך אפנון חמצן, הפעל זרימת חיץ במהלך שלבי הגירוי והכביסה, והקפד לעצור את הזרימה בשלבים האחרים במהלך הבדיקה. אסוף שפכים מיציאת הגלוקוז במרווחי דקה לשימוש בניתוח נוסף באמצעות הגישה המיקרופלואידית המוצגת בסרטון זה, ניתן לווסת את אחוז החמצן הזורם על פני קרום ה-PDMS הדק במהירות באמצעות מזרקי המיקרו הממוחשבים.

הנה דוגמה לאפנון זה שנע בין דקה אחת לשש דקות. אפשר גם לספק אפנון כמותי תת-דקה של חמצן בין שניים ל-8.5 חלקים למיליון על ידי אספקת חמצן בין חמישה ל-21%הקו הכחול מראה את אחוז החמצן המועבר וירוק הוא החמצן המומס המתקבל בחלקים למיליון. כאשר מפעילים מחזוריות זו ליצירת היפוקסיה לסירוגין בלולאות, ניתן לראות את היתרונות של לולאות התניה מוקדמת כנגד היפוקסיה בהשוואה לדופק נורמוקסי לא סדיר על ידי התבוננות ביחס המשופר לאחר הטיפול השפעות של היפוקסיה והיפוקסיה לסירוגין ניתן לראות בשיכוך יתר ותנודה של מעברי סידן כפי שמוצג כאן בכחול היא התגובה הנורמוקסית.

באדום היא התגובה ההיפוקסית, והקו הירוק הוא התגובה ההיפוקסית המותנית. מדד הסידן, הפוטנציאל המיטוכונדריאלי והאינסולין מוצגים כאן. אלה התוצאות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בזמן אמת ובדיקת EISA מחוץ לשבב באמצעות השפכים המיקרופלואידיים מהמערכת יחד, אלה מתחילים לבנות תצוגה רב-מודאלית של תגובת האינסולין של הגלוקוז תחת חולף היפוקסי.

לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי, יום אחד לייצור המכשיר ולבידוד תאי העפעפיים ויום אחד לניסויי העפעפיים עצמם. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאמת את ריכוז החמצן שנמסר על ידי נישואין עם הגז של המכשיר לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים במוצא העוברי ובמיקרופיזיולוגיה של רקמות אחרות לחקור כיצד היפוקסיה ודפוסי חמצן זמניים יכולים להשפיע על מחלות כמו סוכרת, הפרעות לב וכלי דם והפרעות נוירולוגיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלוט באפנון חמצן, לתפעל רקמות מיקרו וליצור מדידות חוזרות ומשמעותיות של היפוקסיה של רקמות באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים רב-מודאליים.