בקרה כמותי וזמנית של Microenvironment חמצן ברמה יחיד Islet

המטרה הכללית של הליך זה היא להחיל היפוקסיה לסירוגין בפרקי זמן קצביים על איים הלבלביים במיקרו-קנה מידה, כדי לחקור השפעות של התניה מוקדמת (preconditioning). מטרה זו מושגת תחילה על ידי ייצור התקן מיקרופלואידי רב-מודאלי בעל ממבנה דקה חדירה לגזים. השלב השני הוא יצירת מערכת ממוחשבת לוויסות חמצן.

לאחר מכן, טוענים בזהירות את ה-eyelets למכשיר, ואז מחברים את המיקרופלואידיקה של הנוזלים והחמצן. השלב האחרון הוא תיאום המיקרוסקופיה עם המיקרופלואידיקה הרב-מודאלית, על מנת להמחיש את פרמטרי ה-eyelet המשתנים במהלך ויסות החמצן. לבסוף, נעשה שימוש בטכניקת ה-eyelet, hypoxic intermittent כדי להראות שהתגובה לגלוקוז פגומה בבירור במצב של היפוקסיה.

בעוד שמודולציות זמניות של היפוקסיה יכולות לאמן עיניות להגיב עם פגיעה מופשטת יותר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון חמצן מומס או שימוש בתא היפוקסיה, הוא שניתן להביא ריכוז חמצן מדויק לעפעפיים במרווחי זמן קטנים ומהירים, ללא מאמץ גזירה הנובע מזרימות מורכבות.

השיטה מאפשרת גם ניטור בזמן אמת באמצעות פלואורסצנציה ומיקרוסקופיה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השתלת תאי Alli, כגון הגדרת ליקויים היפוקסיים באתרי השתלה או קביעת משטרי עיבוד מקדים (preconditioning) לשיפור תוצאות ההשתלה. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי היפוקסיה של Alli.

ניתן ליישם זאת גם על רקמות ומערכות אחרות, כגון מערכת העצבים המרכזית, רקמות לב, הכליות ואיברים אחרים להשתלה. הדגמה בווידאו של שיטה זו היא קריטית, שכן חלקים רבים מייצור ההתקן והטיפול בפתחי הלולאות (eyelets) הם שלבים שקשה ללמוד בשל אופיה הבין-תחומי החדשני של הטכניקה, אך הם הופכים למוכרים לאחר התנסות. התחילו בייצור שכבת הכיסוי של ההתקן המיקרופלואידי.

כדי להשיג זאת, שפכו PDMS מעורב מראש של DGAs לגובה של 1.5 מילימטרים לתוך צלחת פטרי ריקה והקשילו אותו בטמפרטורה של 80 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, ייצרו את שכבת המיקרופלואידיקה של הגלוקוז עם תבנית תא הדיפוזיה באמצעות ציפוי ספין של שתי שכבות של SU 8 21 50 בעובי 350 מיקרון כל אחת, כדי ליצור שכבה אחת בעובי 700 מיקרון על גבי פרוסת סיליקון בת 4 אינצ'ים. לאחר מכן, חשפו אותה לאור UV באמצעות מסיכת הפוטו-ליתוגרפיה של שכבת המיקרופלואידיקה של הגלוקוז כדי להעביר את דפוס המיקרו-תעלות אל שכבת ה-SU 8.

שטפו את האזור שלא נחשף בעזרת מפתח SU-8. לאחר מכן, שפכו PDMS מעורב מראש של DGA על גבי ה-MA עד לגובה של 3 millimeters ומקרו בטמפרטורה של 80 °C למשך שעתיים. לאחר ההקשחה, גזרו את שכבת המיקרופלואיד של הגלוקוז לצורה הרצויה והשתמשו במנקב של 2 millimeter ליצירת פתחי הכניסה והיציאה, ובמנקב בעל קוטר של 8 millimeter עבור התא הראשי.

בשלב הבא, ייצרו את תבנית המיקרו-בארים (micro well master) לקיבוע עפעף על ידי ציפוי ספין (spin coating) של שכבה בעובי 100 micron של SU 8 2100 על גבי פרוסת סיליקון נקייה בקוטר ארבעה אינץ', ולאחר מכן השתמשו בליתוגרפיה UV כדי להעביר את תבנית המיקרו-בארים לשכבה זו. כאשר תבנית המיקרו-בארים הושלמה, שטפו את האזורים שלא נחשפו באמצעות חומר מפתח (developer). הוסיפו שתי שכבות של 100 micron של PDMS על ידי ציפוי ספין במהירות 900 RPM למשך 30 שניות, ולאחר מכן ביצוע פולימריזציה (curing) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 80 °C כדי ליצור כל שכבה.

עם הסיום, נקבו את פתחי הכניסה והיציאה בקוטר של שני מילימטרים. לבסוף, הכינו את התבנית הראשית של מיקרופלואידיקת הגז על ידי סבב של SU 8 2100 לעובי של 100 מיקרון כבשכבה הקודמת, והעבירו שוב את תבניות מיקרופלואידיקת הגז באמצעות ליתוגרפיית UV. שטפו את האזור שלא נחשף באמצעות חומר פיתוח.

בשלב הבא, שפכו שכבה בעובי 1.5 millimeter של PDMS על גבי התבנית המאסטר של המיקרופלואידיקה של הגז והקשו בטמפרטורה של 80 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, חתכו את ה-PDMS לצורה הרצויה בעזרת להב תער. לאחר מכן, נקבו חורי כניסה ויציאה בקוטר שני millimeter בשכבת הכיסוי, כך שיהיו מיושרים עם מיקומם בשכבות האחרות, על מנת להדביק את השכבות המרובות זו לזו.

ראשית, הכינו אותם על ידי ניקוי המשטחים באמצעות סרט דביק (scotch tape), חשיפתם לקשת קורונה, ולאחר מכן יישור השכבות ידנית לפי הסדר הבא. ראשית, הצמידו את הממברנה לשכבת הגז התחתונה כאשר המיקרו-בארים (micro wells) פונים כלפי מעלה. לאחר מכן, הצמידו את שכבת המיקרופלואידיקה של הגלוקוז מעל לממברנת המיקרו-בארים.

לבסוף, הצמידו את שכבת הכניסה והיציאה בחלק העליון ביותר, ובכך כסו את כל המכלול. כדי לסייע ביצירת חיבור הדוק, הניחו משקולת של 1 kg על גבי המכלול ואפו אותו בטמפרטורה של 100 °C למשך שלוש שעות. לאחר מכן, בדקו אם קיימת דליפה.

בחנו את המכשיר על ידי מילוי מים לשכבה המימית, טבילת המכשיר והזרמת אוויר דרך שכבת הגז באמצעות המזרק תוך בדיקה לאיתור דליפות. לבסוף, סטריליזציה של המכשירים שהוכו כחסיני דליפות על ידי העברת 70% ethanol דרך השכבה המימית למשך דקה אחת עד שתיים. הגדירו את המיקרו-דיספנסרים על ידי חיבור מולי ההפעלה של המיקרו-דיספנסרים ליחידות הדרייבר המצורפות.

לאחר מכן, חברו את הדריברים ללוח ה-IO הדיגיטלי בפורטים התואמים לבקרי ה-LabVIEW שלהם. בשלב הבא, חברו ספקי כוח DC של 5 וולט ו-20 וולט למגעים התואמים ביחידות ההנעה, וחברו את ה-IO הדיגיטלי למחשב נייד כדי להריץ קודי LabVIEW לבקרת גז, כפי שמתואר בנספח של פרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, חברו מיקרו-דיספנסר אחד לחנקן והשני לאוויר דחוס, כאשר שניהם מכילים 5% carbon dioxide, והגדירו את שני הגזים ל-2 PSI. חברו את מוצאי הדיספנסרים בחיבור T לפני הכניסה להתקן המיקרופלואידי.

לאחר מכן, התקינו את המכשיר על הבמה המחוממת של מיקרוסקופ הפוך עם 0% ו-21% חמצן המחוברים למכשיר. לאחר מכן, מקמו חיישן חמצן סיב אופטי ביציאת הנוזלים של המכשיר כדי למדוד את החמצן המומס ביציאה בזמן אמת. לאחר מכן, חברו את המכשיר למשאבה פריסטלטית והתחילו להזרים מים דרך המכשיר בקצב של 250 microliters לדקה.

אפיינו את התגובה העוברית של ויסות החמצן על ידי מחזורי שינוי של המיקרו-דיספנסרים בין 5% ל-21% חמצן. חברו משאבה פריסטלטית למכשיר המיקרופלואידי ומיקמו את הפיתול מעל לוח חימום בטמפרטורה של 37 °C כדי לחמם את הנוזל לפני כניסתו למכשיר המיקרופלואידי. כמו כן, חברו את יציאת המיקרופלואיד של הגלוקוז לאספן פרקציות. התחילו בניסוח של עכברי C 57 black six ובודדו איים הלבלביים באמצעות עיכול בקולגנאז והפרדה במדרג צמיפות של Ficoll, כפי שמתואר בסרטונים הבאים הזמינים ב-JoVE לאחר הבידוד.

דגרו את ה-eyelets במצע RPMI 1640 המכיל 10%FBS, 1% penicillin streptomycin ו-20 millimolar HEPES בצלחות פטרי למשך 24 עד 48 שעות. השתמשו ב-eyelets בתוך יומיים כדי להבטיח תוצאות עקביות. לאחר מכן, הכינו בופר Krebs ringer bicarbonate טרי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף, כאשר תמיסה אחת מכילה 2 millimolar glucose ותמיסה שנייה מכילה 14 millimolar glucose.

חממו את התמיסות בשפופרות קוניות של 50 milliliter על ידי הנחתן במקלח מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius. לאחר מכן, הכינו את הצבע עבור העיןולטים (eyelets) המבודדים על ידי הוספה של 5 micromolar של 4:02 AM ו-DMSO ו-2.5 micromolar של RH 1 23 ו-100%ethanol לשני milliliters של באפר קרבס (Krebs buffer) המכיל 2 millimolar של גלוקוז. לאחר מכן, העבירו את העיןולטים באמצעות פפית של 10 microliter והדגירו אותם בצבע למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

לאחר הצביעה, טענו כ-20 eyelets למכשיר דרך כניסת מיקרו-התעלה של הגלוקוז. כוונו את ה-eyelets אל תוך התא על ידי הזרמה של בופר (buffer) מהיציאה חזרה אל הכניסה. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה ל-eyelets ולבופר למשך 10 דקות כדי לשטוף שאריות של צבעים.

ראשית, העבירו דרך המערכת בופר ביקרבונט קרבס-רינגר (Krebs ringer bicarbonate buffer) בריכוז 2 mM למשך חמש דקות כדי לבסס קו בסיס רגיל של הדופק. לאחר מכן, גרו את התא באמצעות בופר גלוקוז בריכוז 14 mM למשך 15 דקות, ולאחריו שטיפה של 15 דקות עם בופר גלוקוז בריכוז 2 mM. במהלך תהליך זה, רשמו את הפליטה באורך גל של 510 nm עבור שתי פליטות על ידי עירור ב-340 nm ו-380 nm.

בנוסף, רשמו את פליטת ה-530 של RH 1 23 על ידי עירור הצבע ב-480 nanometers. כדי למזער הפרעות קונבקטיביות במהלך מודולציית חמצן, החילו זרימת בופר במהלך שלבי הגירוי והשטיפה, והקפידו להפסיק את הזרימה בשלבים אחרים במהלך הבדיקה. אספו את השפכים מפתח היציאה של הגלוקוז במרווחי זמן של דקה אחת לשימוש באנליזה נוספת באמצעות הגישה המיקרופלואידית המוצגת בסרטון זה; ניתן לווסת במהירות את אחוז החמצן הזורם מעבר לממברנת ה-PDMS הדקה באמצעות המזרקים המיקרומ电脑יים.

להלן דוגמה למודולציה זו הנעה בין דקה אחת לשש דקות. ניתן גם לספק מודולציות כמותיות של חמצן בפרקי זמן קצרים מדקה, בין 2 ל-8.5 parts per million, על ידי אספקת חמצן בטווח של 5% עד 21%. הקו הכחול מראה את אחוז החמצן המסופק, והקו הירוק מראה את רמת החמצן המומס הנוצרת ב-parts per million. כאשר מחזוריות זו מיושמת ליצירת היפוקסיה לסירוגין ב-eyelets, ניתן להבחין ביתרונות של עיבוד מקדים (preconditioning) של ה-eyelets כנגד היפוקסיה בהשוואה לדופק נורמוקסי לא סדיר, וזאת על ידי התבוננות בשיפור ביחס ה-for לאחר הטיפול. ניתן לראות את השפעות ההיפוקסיה וההיפוקסיה לסירוגין ב-overshoot ובשיכוך התנודות של תהליכי calcium transients, כפי שמוצג כאן; בצבע כחול מופיעה התגובה הנורמוקסית.

בצבע אדום מוצגת התגובה להיפוקסיה, והקו הירוק מייצג את התגובה להיפוקסיה לאחר התניה. כאן מוצגות המדידות של סידן, פוטנציאל מיטוכונדריאלי ואינסולין. אלו הן תוצאות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בזמן אמת ובדיקת EISA מחוץ לשבב (off chip), תוך שימוש יחד עם הזרימה המיקרופלואידית מהמערכת; אלו מתחילים לבנות תמונה רב-מודאלית של התגובה של גלוקוז ואינסולין תחת מצב היפוקסיה חולף.

לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה ביומיים אם היא מבוצעת כראוי: יום אחד עבור ייצור המכשיר ובידוד תאי העפעף, ויום אחד עבור ניסויי העפעף עצמם. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לאמת את ריכוז החמצן המסופק על ידי כיול גז המכשיר לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום העוברית ומיקרו-פיזיולוגיה של רקמות אחרות לבחון כיצד היפוקסיה ותבניות חמצן זמניות עשויות להשפיע על מחלות כגון סוכרת, הפרעות קרדיווסקולריות והפרעות נוירולוגיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי אופן השליטה בוויסות חמצן, מניפולציה של רקמות מיקרוסקופיות והפקת מדידות עקביות ומשמעותיות של היפוקסיה ברקמה באמצעות התקני מיקרופלואידיקה רב-מודאליים.