שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח ליזטים של תאים בודדים באמצעות פלואורסצנטיות או בדיקות אימונולוגיות. זה מושג על ידי יצירת מכשיר מיקרופלואידי, תחילה וציפוי החדר הפנימי בנוגדנים. ואז תאים בודדים משותקים במלכודות ונחשפים לריאגנטים שונים כדי לעורר תגובה תאית בשלב השני.

שסתום בצורת טבעת נסגר במהירות ומאגר ליזה מוזרם דרך המכשיר. השסתום בצורת טבעת נפתח לזמן קצר והתאים עוברים ליזה בתוך תא המיקרו, מה שמאפשר לחלבונים המשוחררים להיקשר לנוגדנים בריכוז גבוה בשל הנפח הקטן. לאחר מכן, השסתום בצורת הטבעת נפתח.

החדר נשטף, וריאגנטים לזיהוי מוכנסים לתא המיקרו הסגור. העלייה בעוצמת הקרינה מנוטרת לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התוצאות מדגימות את יכולתה של מערכת זו לזהות כמותית ואמינה אנליט מעניין המשתחרר מתאים בודדים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ניתוח תא A בודד.

בפרט, הוא אכל מחקרים שיטתיים על התגובה התאית לשינויים בסביבה הכימית. אנו יכולים לראות תקנות למעלה או למטה של מולקולות תוך-תאיות כתוצאה מהגירוי הכימי. ישנם שני יתרונות עיקריים לטכניקה זו.

הראשון הוא שנוכל לחשוף את התאים המשותקים לסביבה כימית מוגדרת קבועה או משתנה מעת לעת. שנית, אנו יכולים לבצע רפורמה בניתוח רגיש וספציפי ביותר של האזור ללא כל זיהום צולב או אובדן אנליטים עקב הובלה. כדי להתחיל לייצר את שלושת פרוסות המאסטר השונות של SU שמונה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

אחד ישמש ליצירת השכבה הנוזלית, אחד לשכבת הבקרה והשלישי לחותמת המגע המיקרו. לאחר מכן לייצר את השבבים המיקרופלואידיים החל מהכנת תערובת של 10 לאחד של PDMS וחומר ריפוי. מערבבים את שני החלקים במרץ ומסירים את התמיסה למשך 30 דקות או עד שהתערובת נקייה מבועות.

לאחר מכן, הניחו את הוופל בתוך שכבת הבקרה בתוך צלחת פטרי והדביקו אותו על התחתית. יוצקים מעל כ-50 גרם PDMS ליצירת שכבה בעובי של ארבעה עד חמישה מילימטרים ומכניסים את הוופל לשעתיים לפחות בתנור בחום של 80 מעלות צלזיוס כדי להבטיח ריפוי מלא של ה-PDMS. חזור על אותו הליך עבור פרוסת הדפסת מיקרו מגע, אך השתמש בכ-20 גרם PDMS במקום 50, וכתוצאה מכך שכבה בעובי של ארבעה עד חמישה מילימטרים של PDMS.

להכנת השכבה התחתונה יש לסובב שכבת PDMS בגובה 40 מיקרון על הפרוסה עם השכבה המיקרופלואידית. שימוש במהירות סיבוב של 2000 סל"ד למשך 60 שניות. רפאו את שכבת ה-PDMS בתנור למשך שעה בחום של 80 מעלות צלזיוס כאשר כל החלקים החלימו.

הסר את שכבת הבקרה מהפרוסה וחתוך אותה לחתיכות בעזרת סכין הגילוח. לאחר מכן נקב חורי חיבור לחץ באמצעות ניקוב ביופסיה של מילימטר אחד וכסה את התעלות בסרט לאחסון. לאחר מכן, הסר את ה-PDMS מעל פרוסת הדפסת המגע המיקרו והכן חותמות בגודל שטח החדר.

אחסן אותם ללא אבק במגירה עד לשימוש. לאחר מכן הניחו את הוופל המצופה ספין ואת שכבת הבקרה בעובי של ארבעה עד חמישה מילימטרים במנקה פלזמה. חשוף את החלקים ב-18 וואט למשך 45 שניות באמצעות פלזמת חמצן ב-0.75 מיליבר.

לאחר טיפול בפלזמה, יישר במהירות את שתי השכבות מתחת למיקרוסקופ עם מרחק עבודה גדול. הוסף כמה PDMS רזרביים סביב החלקים העליונים הממוקמים על מנת להקל על הסרת ה-PDMS מהפרוסה. לאחר מכן מכניסים את הוופל לתנור בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.

לאחר הריפוי, השתמש באזמל כדי להסיר בזהירות את ה-PDMS מהפרוסה וכדי לחתוך את השבבים חורי גישה לחיבורים הנוזליים עם ניקוב ביופסיה של 1.5 מילימטר. בנוסף, צור מאגר בשבב על ידי חיתוך החלק העליון של קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר ושימוש ב-PDMS רזרבי למחצה. הדביקו אותו מעל.

לאחר מכן מרפאים את הצ'יפס בתנור בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. התחל בניקוי מגלשת זכוכית וחלקי PDMS. נקה מגלשת זכוכית עם סבון.

שוטפים אותו במים מזוקקים, ואז שוב באתנול. יבש את השקופית באמצעות זרם חנקן. השתמש בסרט כדי להסיר פסולת וחלקיקי אבק מה-PDMS.

לאחר מכן הנח את חלק ה- PDMS ואת הזכוכית הנקייה. החלק לתוך מנקה הפלזמה למשך 45 שניות ב-18 וואט כדי להבטיח הדבקה הדוקה, הנח את השבב על פלטה חמה למשך חמש דקות לאחר הטיפול בפלזמה לאחר ההדבקה, חתוך את החלק התחתון מכמה קצות פיפטה של 200 מיקרוליטר. מלאו אותם ב-10 עד 15 מיקרוליטר PBS מסונן עם 4% BSA והניחו אותם בכניסות המכשיר.

לאחר מכן השתמש בקצות חתוכות עם תוספת של 10 עד 15 מיקרוליטר PBS והכניס אותם לתעלות הבקרה. לאחר מכן, הכניסו את השבבים לצנטריפוגה וסובבו אותם בכוח הכבידה פי 800 למשך חמש דקות כדי למלא את התעלות בנוזל. אם נשאר אוויר באחד מהערוצים, חזור על שלב זה עד למילוי מלא של הערוצים.

דגרו את תמיסת החסימה למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את התמיסה משכבת הנוזל עם PBS בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה. באמצעות משאבת מזרק, המכשיר מוכן כעת לניסויים בתא כדי להדפיס מראש את שקופית הזכוכית לבדיקות אימונולוגיות לדגור חותמות הדפסת מיקרו מגע PDMS עם 0.5% BSA ביוטיניל בצלחת פטרי נקייה.

לאחר חצי שעה יש לנקות את הבולים ביסודיות ובמהירות במים מזוקקים ולייבש את החותמת מתחת לזרם חנקן. לאחר הייבוש, הנח במהירות את החותמות על שקופית זכוכית נקייה כדי להפקיד את ה-BSA הביוטיניל המעוצב. אין להזיז את ה-stamp לאחר הנחתו ולבדוק שה-stamp נמצא במגע עם מגלשת הזכוכית.

אם לא מעט, הקש על ה-stamp, אך אל תלחץ חזק כלפי מטה. לאחר מכן הנח את החותמת יחד עם החלק העליון של השבב המיקרופלואידי לתוך תא הפלזמה וחשוף אותם לפלזמת חמצן ב-18 וואט למשך 45 שניות. לאחר טיפול בפלזמה, הסר את החותמת ממגלשת הזכוכית.

נשימה על פני השטח תהפוך את הדפוס לגלוי. יישר את תאי המיקרו על גבי המשטח המודפס. לאחר היישור, הנח את השבב על פלטה חמה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לחסום את המשטח שנותר, הכנס תמיסת BSA מסוננת סטרילית של 4% ב-PBS לשבב עם צנטריפוגה כפי שהוצג קודם לכן, דגר את השבב למשך 30 דקות לפחות ולאחר מכן שטוף את התמיסה משכבת הנוזל עם PBS בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה.

בעזרת משאבת מזרק, השתמש בשבב ישירות או אחסן עד שבועיים בארבע מעלות צלזיוס בקופסה לחה. לאחר מכן, צור משטח כריכה פונקציונלי לחלוטין על ידי הכנסת avadon ב-PBS למאגר. הזרימו את התמיסה כדי למשוך את האוודון דרך תעלות הנוזל לאחר מכן.

יש לשטוף היטב את המאגר ולשטוף את התעלות בעזרת PBS. לאחר מכן הוסף חלבון G למאגר ומשוך אותו דרך התעלות. שטפו את כל עודפי החלבון G על ידי שטיפת המאגר והשבב עם PBS.

לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן המעניין למאגר והזרימו אותו דרך התעלות. לאחר מכן עצור את הזרימה כדי לאפשר כריכה לפני שטיפת הערוצים עם PBS פלואורסצנטי, ניתן להשתמש באנלוגים מסומנים כדי לבדוק את איכות תהליך ההדפסה לפני הכנסת תאים לערוצים. קצור תאים דבוקים כמו תאי HE 2 9 3 המוצגים כאן באמצעות מאגר ניתוק ללא אנזימים, ולאחר מכן סנן אותם כדי להפחית את מספר אשכולות התאים לאחר סינון, טען אותם למזרק.

ב-300,000 תאים למיליליטר, טען את התאים על השבב באמצעות זרימה קדימה על משאבת המזרק למשך כשלוש דקות בקצב של 10 עד 20 מיקרוליטר לדקה עבור תאים דביקים כגון אלה על מנת למנוע הצמדה לא ספציפית של התאים בעת מילוי המלכודות, סגור את התאים על ידי לחיצה על השכבה העליונה עם שלושה מוטות. לאחר מכן בדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ. אם נמצא שתאים רבים נדבקו באופן לא ספציפי למשטח בתוך התאים, פתחו אותם במהירות ונסו לשטוף אותם עם מאגר דיסוציאציה של תאים בקצב זרימה של 10 עד 30 מיקרוליטר לדקה.

עבור בדיקת גלוקוז שש פוספט דהידרוגנאז או G 6 PDH, הוסף שני גלוקוז מילי-מולרי, שישה פוספט 0.5 מילי-מולר ו-DP 0.5 יחידות למערכי DIA של מיליליטר ו-0.3 מילי-מולרי RIN למאגר ליזה וודא שהוא מעורבב היטב. לאחר ניקוי הערוצים, משוך את מאגר הליזה G six PDH דרך השבב בקצב זרימה של 30 מיקרוליטר לדקה. כאשר מאגר הליזיס זורם, פתח וסגור במהירות את התאים, והשאיר אותם פתוחים למשך 500 אלפיות השנייה כדי לאפשר לליזה להיכנס לתא מיד לאחר תחילת הליזיס כדי לנטר את התגובה הקינטית.

בדוגמה זו, ניתן לנטר מוצר פלואורסצנטי לאורך זמן. מוצג כאן מערך של תאים שמולאו בצבע מאכל כתום ולאחר מכן נסגרו על ידי לחיצה על שכבת הבקרה מעל תאי המיקרו. לאחר סגירת התא, צבע מאכל ירוק נשטף דרך התעלות כדי להראות את אטימות התאים.

כל תא מכיל נפח של 625 פיקוליטר נוזל בלבד השומר על ריכוז המולקולות המשתחררות מתאי הליס גבוה מספיק לניתוח. יתר על כן, ניתן לפתוח ולסגור את השסתומים באופן שימנע זיהום צולב בין התאים. בתוך תאים אלה, ניתן למדוד אנליטים כגון כמות הליזוזום המשתחררת מתא U 9 37 יחיד המופעל על ידי PMA, מכיוון שהוא מזרז אנזימטית את הייצור של מולקולה פלואורסצנטית בתוך החדר.

הקווים הירוקים מייצגים את השינוי בעוצמת הקרינה לאורך זמן עבור תאים שאוכלסו על ידי תא אחד. כמו כן מוצגת עוצמת הקרינה עבור תא ללא תאים המיוצגים על ידי הקו המקווקו השחור. לשם השוואה, בדיקה זו מראה את ההשפעה של מולקולה רעילה על שלמות הממברנה על ידי מדידת אנזים תוך-תאי G 6 PDH.

הקו השחור מייצג את דגימות הביקורת ללא השפעה רעילה, ואילו הקו הכתום מייצג תאים המושפעים מהרעלן המוצג. הנה דוגמה לבדיקה חיסונית לחלבון התוך תאי. נוגדנים נגד GFP היו משותקים על פני השטח וברגע שהתאים עברו ליזה, קינטיקה הקישור של חלבוני GFP הודגמה באמצעות מיקרוסקופ דשא.

זמן 0.1 מסמן את הכנסת מאגר הליזיס בזמן ש-0.2 GFP מתחיל להצטבר על פני השטח, כלומר ליזיס תאים התרחש ו-GFP התפזר אל פני השטח. קשירת GFP לנוגדנים הושלמה בזמן 0.3. בדוגמה אחרונה זו, GA DH משוחרר הקשור ללכידת נוגדנים על פני השטח ולאחר מכן נוספו נוגדנים לזיהוי בשילוב HRP.

לאחר שכל נוגדני הזיהוי הלא קשורים נשטפו, הוכנס מגיב הזיהוי והתגובה הייתה לאורך זמן. להלן השוואה של כמות ה- GA DH התוך-תאי לשעבר בכמויות של בעלי חיים בין תאי U 9 37 ו- HEC 2 93 שנמדדו בשיטה זו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את השבבים המיקרופלואידיים, כיצד לשנות את פני השטח כדי לאפשר בדיקות חיסוניות, ולבסוף, כיצד להשתמש במכשיר לניתוח תא בודד.

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעזור לענות על שאלות רבות בתחום הביולוגיה של תא בודד.