Name: שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: למדו לנתח ליזטים של תאים בודדים באמצעות שבב microfluidic ומבחני פלואורסצנציה או אימונואסיי. השיטה מאפשרת כימות חלבונים תוך-תאיים בריכוז גבוה ומספקת כלים לחקירת הטרוגניות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים בתודה טום רובינסון לקריאה הוכחה של כתב היד, ג Bärtschi וה &#39;בנץ להקמת מערכת בקרת לחץ שהותקן. אנחנו רוצים גם להכיר בשימוש במתקן חדר הנקי הראשון ומרכז האור מיקרוסקופית (LMC), שניהם במכון הטכנולוגי של ציריך. העבודה מומנה על ידי חברת מרק סרונו והמועצה האירופית למחקר (ERC) תחת תכנית המסגרת ה -7 (ERC החל גרנט, פרויקט לא. 203,428, nμLIPIDs).

<ol><li>Walling, M. A., Shepard, J. R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+and+live+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity and live cell arrays.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).</li>
<li>Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological single cell analysis.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).</li>
<li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+single+cell+analysis%3A+from+promise+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).</li>
<li>Faley, S., Seale, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platform+for+real-time+signaling+analysis+of+multiple+single+T+cells+in+parallel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel.</a> Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+enzyme+concentrations%2C+kinetics%2C+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).</li>
<li>Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyphenated+optical+trap+capillary+electrophoresis+laser+induced+native+fluorescence+system+for+single-cell+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis.</a> Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchamber+array+for+single+cell+isolation+and+analysis+of+intracellular+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules.</a> Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li>
<li>Ma, C., Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).</li>
<li>Shi, Q., Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+circulating+tumor+cells%3A+transcriptional+heterogeneity+and+diversity+from+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines.</a> PLoS ONE. 7 (5), e33788(2012).</li>
<li>Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+polarity%2C+stem+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell polarity, stem cells and cancer.</a> Nature. 12 (1), 23-38 (2012).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li>
<li>Gao, Y., Majumdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+valve-enabled+microfluidic+cell+co-culture+platform+and+demonstration+of+its+applications+to+neurobiology+and+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology.</a> Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).</li>
<li>White, A. K., VanInsberghe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microfluidic+single-cell+RT-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).</li>
<li>Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).</li>
<li>Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+real+time+analysis+of+protein+secretion+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Towards real time analysis of protein secretion from single cells.</a> Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Cai, D., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+Nanotechnologies+for+Study+of+Cell+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).</li>
<li>Huang, N. T., Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+platform+for+in+situ+cellular+cytokine+secretion+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping.</a> Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.</li>
<li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li>
<li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+%28G6PD%29%3A+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

טכנולוגית מיקרופלואידיקה פתחה אפשרויות חדשות ומרתקות לניתוח תא בודד. בפרט, את האפשרות למלכודת ולשתק את התאים בנפרד על ידי כלים microfluidic אפשרה מחקרים לטווח קצר וארוך שיטתיים על מאפייני תא בודד ותגובה. בנוסף, אנקפסולציה של תאים בmicrodroplets תדירות גבוהה, שנוצר על שבב אלקטרוני, אפשרה מחקרי הפרשת תא בודדים, שלא ניתן לבצע עם מכשירי cytometry קונבנציונליים. גישת microdroplet, לעומת זאת, יש כמה מגבלות, כאשר שלבי דגירה ושטיפה נדרשים לפרוטוקול אנליטית. הגישה שלנו משלבת את שני המושגים...

מחקרים רבים בעבר חשפו הבדלי תא אל התא בתוך אוכלוסיית תאים גדולה 1-3, בפרט איתות מעבדת 4, או הכמויות של ביומולקולות תאית כגון חלבונים 5,6, מטבוליטים, וcofactors 7,8. heterogeneities אלה נחשבים חשובים ביסודו להסתגלות תאים והתפתחות 9, אבל גם לשחק תפקיד מרכזי בהופעתה וטיפול במחלות כגון סרטן 10-13. לכן, מחקרים ברמת התא הבודד הם עניין גבוה במחקר ביולוגי ותרופתי, במיוחד אם מחקרים אלה חושפים את תגובות תאים השונות לאחר טיפול עם חומרים כימיים ביו. בשנים האחרונות, רבות פלטפורמות אנליטיים פותחו המאפשרות ניתוח של תאי חיים בודדים או את ההרכב הכימי של התוכן הסלולרי. בעוד תא ניאון מיון מופעל (FACS) הוא הזהב standard לניתוח מאוד תפוקה גבוהה של תאי חיים בודדים, השיטה לא יכולה להיות מועסק לכימות של תרכובות תאיים או מופרשים. הופעתה של פלטפורמות microfluidic הבטיחה אסטרטגיות אנליטיות חדשניות למיצוב, טיפול ומעקב של תאים בודדים. אבן דרך במיקרופלואידיקה הושגה עם השילוב של שסתומים PDMS גמישים הבינו ידי Quake ועמיתים לעבודה 14,15. שסתומים אלו יעילים מכיוון שהם יכולים לבודד אזורים בשבב, לדוגמא להפריד בין שתי תרבויות 16. יתר על כן, הם רלוונטיים במיוחד לניתוח תא בודד, ולכן לעזור להפחית בעיות דילול אנליטי. כוחה של גישה זו לניתוח תא בודד הודגם לאחרונה על ידי הנסן ועמיתים לעבודה, שניתח את ביטוי גנים ממאה תאים בודדים ב17 מקבילים. כאשר מיקוד חלבונים ומטבוליטים, הניתוח קשה מאוד עקב חוסר המתאיםשיטות mplification, המספר הגדול של תרכובות שונות בהווה ובווריאציות שלהם בטבע כימי. יתר על כן, רוב ביומולקולות תאית צפויות להיות נוכח במספרים נמוכים עותק בסדר הגודל של כמה עשרות אלף 18, ולכן השיטה אנליטית המשמשת חייבת להיות רגישות גבוהה. מבחני יותר חזקים כגון immunoassays וimmunoassays צמודת אנזים (ELISA) קשים להשתלב במכשירי microfluidic כי הם דורשים כמה כביסה ושלבי דגירה, כמו גם חוסר תנועת פני השטח. בשל אתגרים אלה, אין זה מפתיע שרק כמה דוגמאות שדווחו בו חלבונים או מטבוליטים היו לכמת ברמת התא הבודד. לדוגמא, מחקרים על ההפרשה של תרכובות ניאון דווחו 19,20. לאחרונה, היישום עם ELISA הוצג לניתוח חלבונים מופרשים (nonfluorescent) מתרבית תאים (THP-1 תאים) 21 ויחידה (immune) תאים 10. מיקוד חלבונים תאיים, שי et al. פיתח מכשיר microfluidic שאפשר זיהוי של חלבונים תאיים לניתוח של מסלולי איתות בתאים סרטניים באמצעות immunoassay 11. עם זאת, רק כמויות יחסי של חלבונים שהיו נחושות ולא הגברה אנזימטית שימשה כדי להגדיל את האות לחלבוני שפע נמוך. לאחרונה, הצלחנו לשלב microdevice השמנה תא בודד עם מבחני הקרינה 8 וimmunoassays 22 (איור 1). תאים לכודים באופן פסיבי במבני משוכת microsized, המאפשרים אספקה ​​והחלפה (מהירה) של מדיום וחומרים כימיים אחרים ללא כל תנועה של התאים. שסתום בצורת טבעת סביב כל מלכודת מאפשר בידוד של התא בנפח קטן מאוד (&quot;microchamber&quot;). שסתום זה מונע מייד לאחר החדרת חיץ תא lysing (hypoosmolar), שהואNCE מניעת מולקולות תאיים או מולקולות מופרשים כדי לפזר משם. והכי חשוב, בשל גודלו הקטן של הנפח (625 pl) דילול גדול של המולקולות הוא התחמק. יתר על כן, מאז תמוגה וניתוח מבוצעים באותה התנוחה בשבב, אין אובדן של analytes בשל תחבורה. תכנון השבבים המתוארים כאן כולל 8 שורות לסירוגין של או 7 או 8 microchambers, בהיקף של 60 microchambers. התאים הם מופעלים בשורות, כך שזיהום צולב לאורך קו מנועה. הפלטפורמה יכולה לשמש בשילוב עם מבחני הקרינה, כמו גם מבחני חיסוניים (1D איור). באפשרות השנייה, הקמנו פרוטוקולים לחוסר תנועה של הנוגדנים, אשר עולים בקנה אחד עם ייצור השבבים ותהליך ההרכבה. לפיכך הפלטפורמה פותחת את הדרך למבחנים רגישים, אמינים וכמותיים ברמת התא הבודד. עד עכשיו, יש לנו השתמשתי במכשיר לניתוח של iאנזימי ntracellular והמופרשים (כימות יחסי על ידי מבחני האנזימטית), cofactors תאיים, חלבונים ומולקולות קטנות (כימות מוחלטת על ידי מבחני נקודת סיום או ELISA). בחלק הבא, אנו מתארים את תהליך ייצור שבבים באמצעות יתוגרפיה רב שכבתית רכה והפרוטוקולים לדפוסים של הנוגדנים באמצעות הדפסת microcontact וכימיה של פני השטח. בנוסף, כמה דוגמאות לשימוש בשבב ופעולות מקבלות.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שם חברת הריאגנטים</td><td></td><td>הערות מספר קטלוגי</td><td>(אופציונלי)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ABCR (קרלסרוהה, גרמניה)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl &beta;-D-N,N&prime;-diacetylchitobioside hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck VWR (דרמשטדט, גרמניה)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (ויסבאדן, גרמניה)</td><td>n.a.AZ</td><td></td></tr> <tr><td>726 מפתח</td><td>AZ Electronic Materials (ויסבאדן, גרמניה)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר, ביוטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דיסוציאציה של תאים</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HDMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>Merck VWR (דרמשטדט, גרמניה)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR מפתח 600</td><td>Microresist technology GmbH (ברלין, גרמניה)</td> <td>n.a.PBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG מושתל</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, שוויץ)</td><td>n.a.PLL-g-PEG</td><td></td></tr> <tr><td>ביוטין מושתל</td><td>SuSoS, (D&uuml; בנדורף, שוויץ)</td><td>n.a.אשלגן</td><td></td></tr> <tr><td>כלורי</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>חלבון G, ביוטין</td><td>Sigma Fine Chemicals</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>פרוסת סיליקון</td><td>Si-Mat (Kaufering, גרמניה)</td><td>n.a.Sylgard</td><td></td></tr> <tr><td>184 ערכת אלסטומר סיליקון (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1610716</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שם חומר</td> מספר <td>קטלוגי</td><td>החברה</td><td>הערות (אופציונלי)</td></tr><tr><td>0.22 &micro; מסנן מזרק m PES</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1/1.5 מ"מ מנקב ביופסיה</td><td>Miltex, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תאים 20 ומיקרו; m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.Hotplate</td><td></td></tr> <tr><td>HP 160 III BM</td><td>Sawatec, סאקס, שוויץ</td><td>n.a.MA-6</td><td></td></tr> <tr><td>מיישר מסכות</td><td>קארל סוס</td><td>n.a.Multizoom</td><td></td></tr> <tr><td>AZ100M מיקרוסקופ</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.Photomask</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microlitho, אסקס, בריטניה</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>coater Modell WS-400 BZ-6NPP / LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>Modules SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, שוויץ</td><td>n.a.Step</td><td></td></tr> <tr><td>profiler Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.משאבת</td><td></td></tr> <tr><td>מזרק ו- MESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

אנו מציגים מכשיר microfluidic המאפשר קביעת כמותית של ביומולקולות תאית בתאים בודדים מרובים במקביל. לצורך כך, התאים לכודים באופן פסיבי באמצע microchamber. עם ההפעלה של שכבת הבקרה, התא מבודד מהנפח שמסביב בחדר קטן. הנפח המקיף לאחר מכן ניתן להחליף מבלי להשפיע על התאים המבודדים. עם זאת, על פתיחה וסגירה קצרות של החדר, הפתרון בתא יכול להיות מוחלף בתוך כמה מאה אלפיות שנייה. בשל ההפיכות של התאים, יכול להיחשף לתאים ברצף פתרונות שונים באופנה לשליטה מאוד, למשל עבור דגירה, כביסה, ולבסוף, תמוגה תא. Microchambers הסגור היטב יאפשר השמירה של lysate, למזער ולשלוט בדילול לאחר תמוגה תא. מאז תמוגה וניתוח להתרחש באותו המיקום, רגישות גבוהה נשמר משום שאין ד נוסףilution או אובדן analytes מתרחש במהלך הובלה. עיצוב microchamber לכן מאפשר ניתוח אמין לשחזור של מספרי עותק קטנים מאוד של מולקולות תאיים (attomoles, zeptomoles) שוחררו מהתאים בודדים. יתר על כן, ניתן לארגן microchambers רבים בפורמט מערך, המאפשר הניתוח של תאים רבים בבת אחת, בהתחשב בעובדה שמכשירים אופטיים מתאימים המשמשים לניטור. יש לנו כבר השתמשתי בפלטפורמה למחקרי הוכחה של הקונספט לנתח חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors ושליחים שני באופן כימות או יחסי או מוחלט.

הפלטפורמה שלנו היא מסוגלת לנתח מגוון של תאיים, כמו גם מולקולות מופרשים בהווה באו המיוצר על ידי תאים בודדים. כאן, אנו רוצים להציג מחקרי ירושלים שונים כדי להדגיש את המגוון של מבחני אפשריים. אנו נותנים דוגמא לאנזים מופרש (איור 5 א), כמו גם אנזים תאיים (איור 5) וחלבון (5c דמויות וד). לדוגמאות נוספות, כגון cofactors או מולקולות קטנות, עיינו Eyer et al. (2012) וEyer et al. (2013). <p class="jove_content" style=";te...

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנתח ליזטים של תאים בודדים באמצעות פלואורסצנציה או בדיקות אימונו-סריקה (immunoassays). דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת התקן מיקרופלואידי וציפוי התא הפנימי בנוגדנים. בשלב השני, תאים בודדים מקובעים במלכודות ונחשפים לריאגנטים שונים כדי לעורר תגובה תאית.שסתום בצורת טבעת נסגר במהירות ובופר ליזיס (lysis buffer) זורם דרך המכשיר. השסתום בצורת הטבעת נפתח לזמן קצר והתאים עוברים ליזיס בתוך המיקרו-תא, מה שמאפשר לחלבונים המשוחררים להיקשר לנוגדנים בריכוז גבוה בשל הנפח הקטן. לאחר מכן, השסתום בצורת הטבעת נפתח.את התא שוטפים, ומכניסים ריאגנטים לזיהוי לתוך המיקרו-תא הסגור. העלייה בעוצמת הפלואורסצנציה מנוטרת לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה; התוצאות מדגימות את יכולתו של מערכת זו לזהות באופן כמותי ואמין אנליט רצוי השוחרר מתאים בודדים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום של ניתוח תא בודד.בפרט, היא אפשרה ביצוע של מחקרים שיטתיים על התגובה התאית לשינויים בסביבה הכימית. ניתן לראות ויסות חיובי או שלילי (up or down regulations) של מולקולות תוך-תאיות כתוצאה מהגירוי הכימי. לטכניקה זו יש שני יתרונות עיקריים.ראשית, אנו יכולים לחשוף את התאים המקובעים לסביבה כימית מוגדרת שהיא קבועה או משתנה באופן מחזורי. שנית, אנו יכולים לבצע אנליזה רגישה וספציפית ביותר של המצב ללא זיהום צולב או אובדן של אנליטים עקב שינוע. כדי להתחיל, הכינו את שלוש פרוסות המאסטר השונות של SU eight כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.אחד ישמש ליצירת השכבה הפלואידית, אחד לשכבת הבקרה, ושלישי עבור חותמת המיקרו-מגע. לאחר מכן, ייצרו את השבבים המיקרופלואידיים החל מהכנת תערובת של PDMS וחומר מעבד ביחס של 10 ל-1. ערבבו את שני החלקים בעוצמה ובצעו ניקוז גזים (degassing) לתמיסה למשך 30 דקות או עד שהתערובת תהיה נקייה מבועות.בשלב הבא, מקמו את פרוסת הסיליקון (wafer) בתוך שכבת הבקרה בתוך צלחת פטרי והדביקו אותה לתחתית. שפכו כ-50 גרם PDMS מעל כדי ליצור שכבה בעובי של ארבעה עד חמישה מילימטרים, והניחו את הפרוסה למשך שעתיים לפחות בתנור בטמפרטורה של 80 °C כדי להבטיח אשפרה מלאה של ה-PDMS. חזרו על אותו הליך עבור פרוסת הסיליקון להדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing), אך השתמשו בכ-20 גרם PDMS במקום 50, כדי להגיע לשכבת PDMS בעובי של ארבעה עד חמישה מילימטרים.להכנת השכבה התחתונה, בצעו ציפוי סבב (spin coat) של שכבת PDMS בגובה 40 micron על גבי הפרוסה (wafer) עם השכבה המיקרופלואידית. השתמשו במהירות סיבוב של 2000 RPM למשך 60 שניות. לאחר שכל החלקים התקשו, בצעו אשפרה (cure) לשכבת ה-PDMS בתנור למשך שעה אחת בטמפרטורה של 80 °C.הסיר את שכבת הבקרה מהוופר וחתוך אותו לחלקים בעזרת להב תער. לאחר מכן, נקב חורי חיבור ללחץ באמצעות מחט ביופסיה של 1 mm וכסה את התעלות בסרט דביק לצורך אחסון. בשלב הבא, הסר את ה-PDMS מעל וופר ההדפסה במיקרו-מגעים והכן חותמות בגודל של שטח התא.אחסן אותם במגירה נקייה מאבק עד למועד השימוש. לאחר מכן, הנח את השבב שעבר ציפוי ספין (spin coating) ואת שכבת הביקורת בעובי 4 עד 5 מילימטרים במנקה פלזמה. חשוף את החלקים ב-18 watts למשך 45 שניות באמצעות פלזמת חמצן ב-0.75 millibar.לאחר הטיפול בפלסמה, יישרו במהירות את שתי השכבות תחת מיקרוסקופ בעל מרחק עבודה גדול. הוסיפו מעט PDMS רזרבי מסביב לחלקים העליונים שהוצבו כדי להקל על הסרת ה-PDMS מהוופר. לאחר מכן, הניחו את הוופר בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך שעה אחת לפחות.לאחר הפילול, השתמש בסקלפל כדי להסיר בזהירות את ה-PDMS מהוופר ולגזור את השבבים המיקרופונומיים. פנקח חורי גישה לחיבורים הפלואידיים באמצעות מחט ביופסיה בקוטר 1.5 millimeter. בנוסף, צור מאגר בשבב המיקרופלואידי על ידי גזירת החלק העליון של טיפ פפיטה בנפח 200 microliter ושימוש במעט PDMS חצי-פילול. הדבק אותו בחלק העליון.לאחר מכן,בצעו פתיחה (cure) של השבב בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך שעה אחת לפחות. התחילו בניקוי של שקופית זכוכית וחלקי PDMS. נקו את שקופית הזכוכית באמצעות סבון.שטפו זאת במים מזוקקים, ולאחר מכן שוב באתנול. ייבשו את העגילה באמצעות זרם חנקן. השתמשו בסרט הדבקה כדי להסיר שאריות וחלקיקי אבק מה-PDMS.לאחר מכן, הניחו את חלק ה-PDMS ואת הזכוכית הנקייה. החליקו אותם אל תוך מנקה הפלזמה למשך 45 שניות בהספק של 18 watts כדי להבטיח הידבקות חזקה, והניחו את השבב על פלטה חמה למשך חמש דקות לאחר טיפול הפלזמה. לאחר ההדבקה, גזרו את החלק התחתון של מספר קצות טיפים של פפטה בנפח 200 microliter. מלאו אותם ב-10 עד 15 microliters של PBS מסונן עם 4%BSA והניחו אותם בתוך הכניסות של ההתקן.לאחר מכן, השתמשו בקצוות טיפים גזוזיים בתוספת של 10 עד 15 µL של PBS והכניסו אותם לתעלות הבקרה. לאחר מכן, הניחו את השבבים בצנטריפוגה וסובבו אותם במהירות של 800 ×g למשך חמש דקות כדי למלא את התעלות בנוזל. אם נותר אוויר באחת התעלות, חזרו על שלב זה עד שהתעלות יתמלאו לחלוטין.דגרו את תמיסת החסימה למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התמיסה מהשכבה הנוזלית באמצעות PBS בקצב זרימה של 10 µL לדקה. באמצעות משאבת מזרק, המכשיר מוכן כעת לניסויי תאים; כדי להכין את השקופית הזכוכיתית לבדיקות אימונו-ספציפיות (immunoassays), דגרו חותמות הדפסה במיקרו-מגע (micro contact printing) מ-PDMS עם 0.5% biotinylated BSA בתוך צלחת פטרי נקייה.לאחר חצי שעה, נקו את החותמות ביסודיות ובמהירות בעזרת מים מזוקקים וייבשו את החותמת תחת זרם חנקן. לאחר הייבוש, הניחו במהירות את החותמות על תבנית זכוכית נקייה כדי להשקיע את ה-BSA הביוטינילי המודפס. אין להזיז את החותמת לאחר ההנחה, ויש לוודא שהחותמת נמצאת במגע עם תבנית הזכוכית.אם הבול לא נצמד מעט, הקישו עליו, אך אל תלחצו חזק. לאחר מכן, הכניסו את הבול יחד עם החלק העליון של השבב המיקרופלואידי לתא הפלזמה וחשפו אותם לפלזמת חמצן בהספק של 18 watts למשך 45 שניות. לאחר טיפול הפלזמה, הסירו את הבול מהשקופית.נשיפה על פני השטח תהפוך את התבנית לנראית. יישרו את המיקרו-תאים מעל הפני השטח המודפסים. לאחר היישור, הניחו את השבב על פלטה חמה בטמפרטורה של 50 °C למשך 30 דקות כדי לחסום את שאר פני השטח, הכניסו לשבב תמיסת BSA מסוננת סטרילית בריכוז 4% ב-PBS באמצעות צנטריפוגה כפי שהודגם קודם לכן, הדגירו את המיקרו-שבב למשך 30 דקות לפחות, ולאחר מכן שטפו את התמיסה משכבת הנוזלים באמצעות PBS בקצב זרימה של 10 µL לדקה.באמצעות משאבת מזרקים, השתמש בשבב באופן מיידי או לאחר אחסון של עד שבועיים בטמפרטורה של 4 °C בתוך קופסה לחה. לאחר מכן, צור משטח קישור תפקודי מלא על ידי הזרקת avadon ב-PBS אל המאגר. זרימה של התמיס תמשוך את ה-avadon דרך תעלות הנוזלים לאחר מכן.שטפו היטב את המאגר והעבירו PBS דרך הערוצים. לאחר מכן, הוסיפו Protein G למאגר ומשכו אותו דרך הערוצים. שטפו את עודפי ה-Protein G על ידי שטיפת המאגר והשבב ב-PBS.בשלב הבא, הוסיפו את הנוגדן הרצוי למאגר והעבירו אותו דרך התעלות. לאחר מכן, הפסיקו את הזרימה כדי לאפשר קישור לפני שטיפת התעלות ב-PBS; ניתן להשתמש באנלוגים מסומנים פלואורסצנטית כדי לבדוק את איכות תהליך ההדפסה לפני הכנסת תאים לתעלות. אספו תאים שנצמדו, כגון תאי HE 2 9 3 המוצגים כאן, באמצעות תמיסת דיסוציאציה ללא אנזימים, ולאחר מכן סננו אותם כדי להפחית את מספר מקבצי התאים. לאחר הסינון, העמיסו אותם למזרק.בריכוז של 300,000 תאים למיליליטר, טענו את התאים לשבב באמצעות זרימה קדימה במשאבת מזרקים למשך כמעט שלוש דקות בקצב של 10 עד 20 µL לדקה עבור תאים דביקים כגון אלו, וזאת כדי למנוע היצמדות לא ספציפית של התאים. כאשר המלכודות מלאות, סגרו את התאים על ידי הפעלת לחץ של שלושה bars על השכבה העליונה. לאחר מכן, בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ. אם נמצא כי תאים רבים נצמדו באופן לא ספציפי לפני השטח בתוך התאים, פתחו אותם במהירות ונסו לשטוף אותם בעזרת תמיסת דיסוציאציה של תאים בקצב זרימה של 10 עד 30 µL לדקה.עבור בדיקת הגלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז או G6PDH, הוסיפו לחוצץ ליזיס 2mM גלוקוז-6-פוספט, 0.5mM NADP, 0.5 units/mL של G6PDH ו-0.3mM של RNase, וודאו שהתערובת מעורבבת היטב. לאחר שהערוצים נקיים, העבירו את חוצץ הליזיס של ה-G6PDH דרך השבב בקצב זרימה של 30 µL/min. בזמן זרימת חוצץ הליזיס, פתחו וסגרו במהירות את התאים, והשאירו אותם פתוחים למשך 500 milliseconds כדי לאפשר לליזיס להיכנס לתא, ומיד לאחר תחילת הליזיס התחילו לנטר את התגובה הקינטית.בדוגמה זו, ניתן לעקוב אחר תוצר פלואורסצנטי לאורך זמן. מוצג כאן מערך של תאים שמולאו בצבע מאכל כתום ולאחר מכן נסגרו על ידי הפעלת לחץ בשכבת הבקרה שמעל המיקרו-תאים. לאחר סגירת התאים, צבע מאכל ירוק נשטף דרך התעלות כדי להדגים את אטימות התאים.כל תא מכיל נפח של 625 picoliters בלבד של נוזל, השומר על ריכוז גבוה מספיק של מולקולות השתחררו מתאי הליזיס לצורך אנליזה. יתרה מכך, ניתן לפתוח ולסגור את השסתומים באופן שימנע זיהום צולב בין התאים. בתוך תאים אלו, ניתן למדוד אנליטים כגון כמות הליזוזום ששחרר תא U 9 37 בודד שהופעל על ידי PMA, שכן הוא מקטליז באופן אנזימטי את ייצורו של מולקולה פלואורסצנטית בתוך התא.הקוים הירוקים מייצגים את השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה לאורך זמן עבור תאים המאוכלסים בתא אחד. מוצגת גם עוצמת הפלואורסצנציה עבור תא ללא תאים, המיוצגת על ידי הקו השחור המקווקו. לצורך השוואה, בדיקה זו מראה את ההשפעה של מולקולה רעילה על שלמות הממברנה על ידי מדידת האנזים התוך-תאי G six PDH.הקו השחור מייצג את דגימות הביקורת ללא השפעה רעילה, בעוד שהקו הכתום מייצג תאים שהושפעו מהרעלן המוצג. זהו דוגמה לבדיקה אימונולוגית (immunoassay) עבור החלבון התוך-תאי. נוגדני GFP anti GFP קובעו על פני השטח, ולאחר ליזיס של התאים, ויזואליזציה של קינטיקת ההיקשרות של חלבוני ה-GFP בוצעה באמצעות מיקרוסקופיית TIRF.זמן 0.1 מסמן את הוספת תמיסת הליזיס; בזמן 0.2 GFP מתחיל להצטבר על הפני השטח, מה שמעיד על כך שהתרחשה ליזיס של התאים ו-GFP דיף אל הפני השטח. קישור ה-GFP לנוגדנים הושלם בזמן 0.3. בדוגמה סופית זו, GA DH ששוחרר נקשר לנוגדני לכידה על פני השטח, ולאחר מכן נוספו נוגדני זיהוי המשו coupling ל-HRP.לאחר שכל הנוגדנים הגשים שלא נקשרו נשטפו, הוזן תסבוב הגילוי והתגובה התרחשה לאורך זמן. להלן השוואה של כמות GA DH שהייתה בעבר תוך-תאית בדגימות מבעלי חיים בין תאי U 9 37 לתאי HEC 2 93 שנמדדה בשיטה זו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הכנת השבבים המיקרופלואידיים, כיצד לשנות את פני השטח כדי לאפשר ביצועי בדיקות אימונו-ספציפיות, ולבסוף, כיצד להשתמש במכשיר לניתוח של תא בודד.ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות רבות בתחום הביולוגיה של תא בודד.

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Droplet מבוססי פלטפורמות microfluidic הם המועמדים המבטיחים לניסויים תפוקה גבוהה שכן הם מסוגלים להפיק, picoliter עצמית מידור כלי ובזול בשיעורים קילוהרץ. באמצעות שילוב עם מהירות, רגישות גבוהה שיטות ספקטרוסקופיות ברזולוציה פלואורסצנטי, כמויות גדולות של מידע שנוצר בתוך מערכות אלה ניתן לחלץ ביעילות, לרתום ולנצל אותו.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

מכשירי Millifluidic מנוצלים לסינתזה מבוקרת של ננו, ניתוח של מנגנוני תגובה וזרימת קטליזה המתמשכת זמן נפתר.

Millifluidics לסינתזה כימית וזמן נפתר מכניסטית לימודים

אנו מציגים biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic לגילוי הכלאת DNA. בעקבות functionalization הבדיקה ssDNA, הסגוליות, הרגישות, וגבול הגילוי נלמדים ביעדי ssDNA משלימים ולא משלימים. תוצאות ממחישות את השפעתם של אירועי הכלאת DNA על מערכת אלקטרוכימיים, עם גבול גילוי של 3.8 ננומטר.

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

אנו מציגים מערכת מבוא מדגם אגל דיסקרטית לספקטרומטריית מצמידים אינדוקטיבי פלזמה המונית (ICPMS). הוא מבוסס על שבב microfluidic זול וחד פעמי שיוצר טיפות monodisperse ביותר בטווח גודל של 40-60 מיקרומטר בתדרים בין 90 ל -7,000 הרץ.

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

התקנים מיקרו-מיוצרים המשולבים עם רכיבים נוזליים מספקים פלטפורמה במבחנה למחקרי תאים המחקים את המיקרו-סביבה in vivo. פיתחנו שבבים מיקרופלואידיים מבוססי פולימתיל-מתאקרילט לחקר תגובות תאיות תחת גירוי מתח כימי/חשמלי/גזירה יחיד או קיים.

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

אנו מדגימים פלטפורמת microfluidic עם רשת האלקטרודה משטח משולבת המשלב חישת דופק התנגדות (RPS) עם הגישה מרובה חלוקת קוד (CDMA), לבצע ריבוב איתור אומדת חלקיקי ערוצי microfluidic מרובים.

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

כאן אנו מציגים מיקרו droplet למיעון-מערכים (עיוותים), שיטה מערך מבוסס droplet מסוגל לקבוע חלבון מוחלטת שפע תאים בודדים. נדגים את היכולת של ארכיון דיגיטלי כדי לאפיין את הטרוגניות בביטוי של p53 חלבון משתיק קול גידול בקו תאים סרטניים אנושיים.

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

דוח זה מתאר שיטה מבוססת שבב מיקרופלואידיג כדי להגדיר ניסוי של תרבות תא בודדת שבה ניתן להשיג שיוך ביעילות גבוהה וניתוח מיקרוסקופי של תאים בודדים מרובים.

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

אנו מציגים מערכת מיקרופלואידית למחקרי תפוקה גבוהה על מכונות חיים מורכבות, המורכבת מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. השבב המיקרופלואידי מאפשר ניתוח של התנאים המיקרו-סביבתיים המורכבים והדינמיים ביותר ב-vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

הפרוטוקול מתאר פלטפורמה מיקרופלואידית מתקדמת למדידה כמותית של דינמיקת הפרשת ציטוקינים של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים בודדים. הפלטפורמה מודדת עד שלושה ציטוקינים במקביל (IL-6, TNFα ו-IL-1β) עבור כל תא בודד המגורה באמצעות ליפופוליסכריד כדוגמה.

גישה מיקרופלואידית לפתרון הפרשת ציטוקינים סימולטנית ורציפה של תאים רב-תפקודיים בודדים 

למדו לנתח ליזטים של תאים בודדים באמצעות שבב microfluidic ומבחני פלואורסצנציה או אימונואסיי. השיטה מאפשרת כימות חלבונים תוך-תאיים בריכוז גבוה ומספקת כלים לחקירת הטרוגניות תאית.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

גלה סרטונים נוספים