שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנתח ליזטים של תאים בודדים באמצעות פלואורסצנציה או בדיקות אימונו-סריקה (immunoassays). דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת התקן מיקרופלואידי וציפוי התא הפנימי בנוגדנים. בשלב השני, תאים בודדים מקובעים במלכודות ונחשפים לריאגנטים שונים כדי לעורר תגובה תאית.

שסתום בצורת טבעת נסגר במהירות ובופר ליזיס (lysis buffer) זורם דרך המכשיר. השסתום בצורת הטבעת נפתח לזמן קצר והתאים עוברים ליזיס בתוך המיקרו-תא, מה שמאפשר לחלבונים המשוחררים להיקשר לנוגדנים בריכוז גבוה בשל הנפח הקטן. לאחר מכן, השסתום בצורת הטבעת נפתח.

את התא שוטפים, ומכניסים ריאגנטים לזיהוי לתוך המיקרו-תא הסגור. העלייה בעוצמת הפלואורסצנציה מנוטרת לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה; התוצאות מדגימות את יכולתו של מערכת זו לזהות באופן כמותי ואמין אנליט רצוי השוחרר מתאים בודדים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום של ניתוח תא בודד.

בפרט, היא אפשרה ביצוע של מחקרים שיטתיים על התגובה התאית לשינויים בסביבה הכימית. ניתן לראות ויסות חיובי או שלילי (up or down regulations) של מולקולות תוך-תאיות כתוצאה מהגירוי הכימי. לטכניקה זו יש שני יתרונות עיקריים.

ראשית, אנו יכולים לחשוף את התאים המקובעים לסביבה כימית מוגדרת שהיא קבועה או משתנה באופן מחזורי. שנית, אנו יכולים לבצע אנליזה רגישה וספציפית ביותר של המצב ללא זיהום צולב או אובדן של אנליטים עקב שינוע. כדי להתחיל, הכינו את שלוש פרוסות המאסטר השונות של SU eight כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.

אחד ישמש ליצירת השכבה הפלואידית, אחד לשכבת הבקרה, ושלישי עבור חותמת המיקרו-מגע. לאחר מכן, ייצרו את השבבים המיקרופלואידיים החל מהכנת תערובת של PDMS וחומר מעבד ביחס של 10 ל-1. ערבבו את שני החלקים בעוצמה ובצעו ניקוז גזים (degassing) לתמיסה למשך 30 דקות או עד שהתערובת תהיה נקייה מבועות.

בשלב הבא, מקמו את פרוסת הסיליקון (wafer) בתוך שכבת הבקרה בתוך צלחת פטרי והדביקו אותה לתחתית. שפכו כ-50 גרם PDMS מעל כדי ליצור שכבה בעובי של ארבעה עד חמישה מילימטרים, והניחו את הפרוסה למשך שעתיים לפחות בתנור בטמפרטורה של 80 °C כדי להבטיח אשפרה מלאה של ה-PDMS. חזרו על אותו הליך עבור פרוסת הסיליקון להדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing), אך השתמשו בכ-20 גרם PDMS במקום 50, כדי להגיע לשכבת PDMS בעובי של ארבעה עד חמישה מילימטרים.

להכנת השכבה התחתונה, בצעו ציפוי סבב (spin coat) של שכבת PDMS בגובה 40 micron על גבי הפרוסה (wafer) עם השכבה המיקרופלואידית. השתמשו במהירות סיבוב של 2000 RPM למשך 60 שניות. לאחר שכל החלקים התקשו, בצעו אשפרה (cure) לשכבת ה-PDMS בתנור למשך שעה אחת בטמפרטורה של 80 °C.

הסיר את שכבת הבקרה מהוופר וחתוך אותו לחלקים בעזרת להב תער. לאחר מכן, נקב חורי חיבור ללחץ באמצעות מחט ביופסיה של 1 mm וכסה את התעלות בסרט דביק לצורך אחסון. בשלב הבא, הסר את ה-PDMS מעל וופר ההדפסה במיקרו-מגעים והכן חותמות בגודל של שטח התא.

אחסן אותם במגירה נקייה מאבק עד למועד השימוש. לאחר מכן, הנח את השבב שעבר ציפוי ספין (spin coating) ואת שכבת הביקורת בעובי 4 עד 5 מילימטרים במנקה פלזמה. חשוף את החלקים ב-18 watts למשך 45 שניות באמצעות פלזמת חמצן ב-0.75 millibar.

לאחר הטיפול בפלסמה, יישרו במהירות את שתי השכבות תחת מיקרוסקופ בעל מרחק עבודה גדול. הוסיפו מעט PDMS רזרבי מסביב לחלקים העליונים שהוצבו כדי להקל על הסרת ה-PDMS מהוופר. לאחר מכן, הניחו את הוופר בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך שעה אחת לפחות.

לאחר הפילול, השתמש בסקלפל כדי להסיר בזהירות את ה-PDMS מהוופר ולגזור את השבבים המיקרופונומיים. פנקח חורי גישה לחיבורים הפלואידיים באמצעות מחט ביופסיה בקוטר 1.5 millimeter. בנוסף, צור מאגר בשבב המיקרופלואידי על ידי גזירת החלק העליון של טיפ פפיטה בנפח 200 microliter ושימוש במעט PDMS חצי-פילול. הדבק אותו בחלק העליון.

לאחר מכן,בצעו פתיחה (cure) של השבב בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך שעה אחת לפחות. התחילו בניקוי של שקופית זכוכית וחלקי PDMS. נקו את שקופית הזכוכית באמצעות סבון.

שטפו זאת במים מזוקקים, ולאחר מכן שוב באתנול. ייבשו את העגילה באמצעות זרם חנקן. השתמשו בסרט הדבקה כדי להסיר שאריות וחלקיקי אבק מה-PDMS.

לאחר מכן, הניחו את חלק ה-PDMS ואת הזכוכית הנקייה. החליקו אותם אל תוך מנקה הפלזמה למשך 45 שניות בהספק של 18 watts כדי להבטיח הידבקות חזקה, והניחו את השבב על פלטה חמה למשך חמש דקות לאחר טיפול הפלזמה. לאחר ההדבקה, גזרו את החלק התחתון של מספר קצות טיפים של פפטה בנפח 200 microliter. מלאו אותם ב-10 עד 15 microliters של PBS מסונן עם 4%BSA והניחו אותם בתוך הכניסות של ההתקן.

לאחר מכן, השתמשו בקצוות טיפים גזוזיים בתוספת של 10 עד 15 µL של PBS והכניסו אותם לתעלות הבקרה. לאחר מכן, הניחו את השבבים בצנטריפוגה וסובבו אותם במהירות של 800 ×g למשך חמש דקות כדי למלא את התעלות בנוזל. אם נותר אוויר באחת התעלות, חזרו על שלב זה עד שהתעלות יתמלאו לחלוטין.

דגרו את תמיסת החסימה למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התמיסה מהשכבה הנוזלית באמצעות PBS בקצב זרימה של 10 µL לדקה. באמצעות משאבת מזרק, המכשיר מוכן כעת לניסויי תאים; כדי להכין את השקופית הזכוכיתית לבדיקות אימונו-ספציפיות (immunoassays), דגרו חותמות הדפסה במיקרו-מגע (micro contact printing) מ-PDMS עם 0.5% biotinylated BSA בתוך צלחת פטרי נקייה.

לאחר חצי שעה, נקו את החותמות ביסודיות ובמהירות בעזרת מים מזוקקים וייבשו את החותמת תחת זרם חנקן. לאחר הייבוש, הניחו במהירות את החותמות על תבנית זכוכית נקייה כדי להשקיע את ה-BSA הביוטינילי המודפס. אין להזיז את החותמת לאחר ההנחה, ויש לוודא שהחותמת נמצאת במגע עם תבנית הזכוכית.

אם הבול לא נצמד מעט, הקישו עליו, אך אל תלחצו חזק. לאחר מכן, הכניסו את הבול יחד עם החלק העליון של השבב המיקרופלואידי לתא הפלזמה וחשפו אותם לפלזמת חמצן בהספק של 18 watts למשך 45 שניות. לאחר טיפול הפלזמה, הסירו את הבול מהשקופית.

נשיפה על פני השטח תהפוך את התבנית לנראית. יישרו את המיקרו-תאים מעל הפני השטח המודפסים. לאחר היישור, הניחו את השבב על פלטה חמה בטמפרטורה של 50 °C למשך 30 דקות כדי לחסום את שאר פני השטח, הכניסו לשבב תמיסת BSA מסוננת סטרילית בריכוז 4% ב-PBS באמצעות צנטריפוגה כפי שהודגם קודם לכן, הדגירו את המיקרו-שבב למשך 30 דקות לפחות, ולאחר מכן שטפו את התמיסה משכבת הנוזלים באמצעות PBS בקצב זרימה של 10 µL לדקה.

באמצעות משאבת מזרקים, השתמש בשבב באופן מיידי או לאחר אחסון של עד שבועיים בטמפרטורה של 4 °C בתוך קופסה לחה. לאחר מכן, צור משטח קישור תפקודי מלא על ידי הזרקת avadon ב-PBS אל המאגר. זרימה של התמיס תמשוך את ה-avadon דרך תעלות הנוזלים לאחר מכן.

שטפו היטב את המאגר והעבירו PBS דרך הערוצים. לאחר מכן, הוסיפו Protein G למאגר ומשכו אותו דרך הערוצים. שטפו את עודפי ה-Protein G על ידי שטיפת המאגר והשבב ב-PBS.

בשלב הבא, הוסיפו את הנוגדן הרצוי למאגר והעבירו אותו דרך התעלות. לאחר מכן, הפסיקו את הזרימה כדי לאפשר קישור לפני שטיפת התעלות ב-PBS; ניתן להשתמש באנלוגים מסומנים פלואורסצנטית כדי לבדוק את איכות תהליך ההדפסה לפני הכנסת תאים לתעלות. אספו תאים שנצמדו, כגון תאי HE 2 9 3 המוצגים כאן, באמצעות תמיסת דיסוציאציה ללא אנזימים, ולאחר מכן סננו אותם כדי להפחית את מספר מקבצי התאים. לאחר הסינון, העמיסו אותם למזרק.

בריכוז של 300,000 תאים למיליליטר, טענו את התאים לשבב באמצעות זרימה קדימה במשאבת מזרקים למשך כמעט שלוש דקות בקצב של 10 עד 20 µL לדקה עבור תאים דביקים כגון אלו, וזאת כדי למנוע היצמדות לא ספציפית של התאים. כאשר המלכודות מלאות, סגרו את התאים על ידי הפעלת לחץ של שלושה bars על השכבה העליונה. לאחר מכן, בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ. אם נמצא כי תאים רבים נצמדו באופן לא ספציפי לפני השטח בתוך התאים, פתחו אותם במהירות ונסו לשטוף אותם בעזרת תמיסת דיסוציאציה של תאים בקצב זרימה של 10 עד 30 µL לדקה.

עבור בדיקת הגלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז או G6PDH, הוסיפו לחוצץ ליזיס 2mM גלוקוז-6-פוספט, 0.5mM NADP, 0.5 units/mL של G6PDH ו-0.3mM של RNase, וודאו שהתערובת מעורבבת היטב. לאחר שהערוצים נקיים, העבירו את חוצץ הליזיס של ה-G6PDH דרך השבב בקצב זרימה של 30 µL/min. בזמן זרימת חוצץ הליזיס, פתחו וסגרו במהירות את התאים, והשאירו אותם פתוחים למשך 500 milliseconds כדי לאפשר לליזיס להיכנס לתא, ומיד לאחר תחילת הליזיס התחילו לנטר את התגובה הקינטית.

בדוגמה זו, ניתן לעקוב אחר תוצר פלואורסצנטי לאורך זמן. מוצג כאן מערך של תאים שמולאו בצבע מאכל כתום ולאחר מכן נסגרו על ידי הפעלת לחץ בשכבת הבקרה שמעל המיקרו-תאים. לאחר סגירת התאים, צבע מאכל ירוק נשטף דרך התעלות כדי להדגים את אטימות התאים.

כל תא מכיל נפח של 625 picoliters בלבד של נוזל, השומר על ריכוז גבוה מספיק של מולקולות השתחררו מתאי הליזיס לצורך אנליזה. יתרה מכך, ניתן לפתוח ולסגור את השסתומים באופן שימנע זיהום צולב בין התאים. בתוך תאים אלו, ניתן למדוד אנליטים כגון כמות הליזוזום ששחרר תא U 9 37 בודד שהופעל על ידי PMA, שכן הוא מקטליז באופן אנזימטי את ייצורו של מולקולה פלואורסצנטית בתוך התא.

הקוים הירוקים מייצגים את השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה לאורך זמן עבור תאים המאוכלסים בתא אחד. מוצגת גם עוצמת הפלואורסצנציה עבור תא ללא תאים, המיוצגת על ידי הקו השחור המקווקו. לצורך השוואה, בדיקה זו מראה את ההשפעה של מולקולה רעילה על שלמות הממברנה על ידי מדידת האנזים התוך-תאי G six PDH.

הקו השחור מייצג את דגימות הביקורת ללא השפעה רעילה, בעוד שהקו הכתום מייצג תאים שהושפעו מהרעלן המוצג. זהו דוגמה לבדיקה אימונולוגית (immunoassay) עבור החלבון התוך-תאי. נוגדני GFP anti GFP קובעו על פני השטח, ולאחר ליזיס של התאים, ויזואליזציה של קינטיקת ההיקשרות של חלבוני ה-GFP בוצעה באמצעות מיקרוסקופיית TIRF.

זמן 0.1 מסמן את הוספת תמיסת הליזיס; בזמן 0.2 GFP מתחיל להצטבר על הפני השטח, מה שמעיד על כך שהתרחשה ליזיס של התאים ו-GFP דיף אל הפני השטח. קישור ה-GFP לנוגדנים הושלם בזמן 0.3. בדוגמה סופית זו, GA DH ששוחרר נקשר לנוגדני לכידה על פני השטח, ולאחר מכן נוספו נוגדני זיהוי המשו coupling ל-HRP.

לאחר שכל הנוגדנים הגשים שלא נקשרו נשטפו, הוזן תסבוב הגילוי והתגובה התרחשה לאורך זמן. להלן השוואה של כמות GA DH שהייתה בעבר תוך-תאית בדגימות מבעלי חיים בין תאי U 9 37 לתאי HEC 2 93 שנמדדה בשיטה זו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הכנת השבבים המיקרופלואידיים, כיצד לשנות את פני השטח כדי לאפשר ביצועי בדיקות אימונו-ספציפיות, ולבסוף, כיצד להשתמש במכשיר לניתוח של תא בודד.

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות רבות בתחום הביולוגיה של תא בודד.