פרוטוקולים אופטימליים עבור

מטרת עבודה זו היא להדגים כיצד להכין תרחיף ליפיד של mycobacterium בעל חיוניות גבוהה עבור עכברים עירומים (nude mice). נבודד את המקרה מהעכבר המודבק, רצוי במהלך שלב מוקדם של הזיהום.

כדי להבטיח תנובאי עיניים בעלי חיוניות גבוהה, יש לבצע המתנס של בעל החיים בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית. החזק את הדופק האחורי באמצעות פלייר המוסטטי. גזור אותם עם התכווצויות והטבל אותם ב-2% Iodine למשך 20 דקות. לצורך דה-קונטמינציה, החזק את נקודת המיקום כאשר כרית כף הרגל פונה כלפי מעלה.

איסוף הרקמה הרכה: באמצעות להב סקלפל, הסר את עצמות הפלנגות הראשונה והחמישית כדי להקל על הומוגניזציית הרקמה. הנח את הרקמה בצלחת פטרי סטרילית. גרד את האפידרמיס.

גזרו את הרקמה הגרנולומטוזית לחתיכות קטנות בעזרת מספריים והמתינו לחישוב מאוחר יותר של תנובת הבציר מהרקמה. העבירו את החתיכות הקטנות למבחנה המכילה 1 ml של תמיסת מלח מאוזנת של Hank. הוסיפו 1 ml נוסף של תמיסת Hank והומוגניזו את הרקמה שלוש פעמים, למשך 15 שניות בכל פעם, במהירות 4.

הנח מסננת תאים לתוך מבחנה קונית סטרילית של 50 ml. העבר בעזרת פיפט את התוך למסננת ואפשר לתמיסה לעבור בכוח הכבידה. כדי להסיר את השאריות, הוסף עוד שני MLS של hanks לתוך למסן והומוגנז אותו שוב.

באמצעות אותו מחזור, העבירו את התרחיף דרך נפה זו. שטפו את הנפה על ידי הוספת hanks. כדי להביא את הנפח הכולל של התרחיף ל-9 ml, הוסיפו לתרחיף 1 ml של תמיסת tripsin בריכוז 0.5% כדי להגיע לריכוז סופי של 0.05%.

ערבב את התמיסה על ידי היפוך עדין של המבחנה והדגר אותה בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות. לאחר ההדגרה, השלם את נפח התמיה ל-4 mL על ידי הוספת סליין סטרילי; צנטריפוגה ב-1700 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C, השלף את הסופרנאט ותלה את המשקע על ידי תיפוף על המבחנה. הוסף 1 mL של סליין סרומי וערבב.

העבירו את התו suspension למבחנה חדשה. הומוגניזו את התו suspension הווסקולרי באמצעות מזרק אינסולין של 1 ml עם מחט בכיול 26 gauge תוך כדי העברת התו suspension למבחנה חדשה. בצעו בקרה מיקרוביולוגית של התו suspension על ידי הנחת שתי טיפות של medium 18, ושבע טיפות של H nine brain heart infusion.

11 דגימות של Stein Genesen דגרו ב-37 degrees Celsius. לאחר מכן, יש לבצע נהלי בקרה מיקרוביולוגית שגרתיים עבור צביעת code Z.

הכינו מה dilution של תרחיף ה-S במי מלח (saline) דילול של 1:10 ודילול של 1:100. הומוגניזו כל דילול לפני הכנת השקופיות לספירה; הכינו שלוש שקופיות על ידי שרטוט של שלושה מעגלים בעלי קוטר פנימי של 10 millimeter על פני השטח של כל שקופית באמצעות טוש בעל דיו קבוע.

כעת הקיפו את העיגולים באמצעות עט לאימונוהיסטוכימיה. סמנו את הפלטות בעזרת עיפרון מספר 2 והכינו פלטות עבור שלושת ריכוזי הדילול: ללא דילול, 1:10 ו-1:100.

פפוטו חמישה µL של תמיסת סרום הפנול ו-10 µL של תרחיף sary לתוך כל עיגול, הומוגניזרו ופזרו את התרחיף באופן שווה על פני שטח העיגול. בעזרת ידית של לולאה חד-פעמית, הניחו את המשטחים הללו על שולחן מפולס לייבוש. קבעו אותם על ידי העברת המשטחים שלוש פעמים מעל להבה כחולה, כאשר תרחיפי ה-bachelor פונים כלפי מעלה.

בצע תחזוקת קוד Zuni. בחן את השקופיות הללו. שלוש הדילולות.

בחרו את הדילול המתאים ביותר לספירת sary. הכינו 200 µL של תרחיף sary שהורג על ידי אוטוקלב של התרחיף הווסקולרי למשך 30 דקות ב-121 °C. השתמשו בערכת L 7 0 0 7 live dead back light לבדיקת חיוניות חיידקים לצביעה פלואורסצנטית של ליפידים מיקרו-בקטריאליים.

הכינו מה dilution של 1:10 של תמיסה A ומה dilution של 1:20 של תמיסה B ממש לפני השימוש. לכל 200 µL של תרחיף וסקולרי (vascular suspension) לא מדולל, מקורי והרוג, הוסיפו 3.6 µL של תמיסה A המדוללת ו-6 µL של תמיסה B המדוללת. לאחר 15 דקות של אינקובציה בחושך, סנטריפוגו את התרחיף ב-10,600 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. הסירו את עלון התרחיף (supernatant) באמצעות פיפטה.

השעה את המשקע ב-50 µL של 10% Glycerol, והומוגניז אותו באמצעות שאיבה והזרקה חוזרת עם פיפט. הנח שמונה µL מכל תרחיף על גשמיות זכוכית וכסה בכיסוי זכוכית קטן. הגן על הדגימה מאור.

יש לבחון את התרחיפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הכין תרחיף בריכוז של 10^7 BA lip ל-ml, והעבר 1 ml של תוכה להקפאה לכל מבחנה לקריו-שימור (cryo vial). לאחר מכן, הוסף 150 µl מהתרחיף S ל-1 ml של התוכה להקפאה והומוגנ את התערובת על ידי הפיכת המבחנה.

הנח את מבחנת הקריו בתוך מכל ההקפאה. שמור את המכל בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. העבר את המבחנות לקופסת אחסון ושמור אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד להפשרה.

הפשיר את התרחיף הקפוא באמבט מים המכוון ל-37 °C. העבר את התרחיף לשפופרת קונית המכילה 20 mL של תמיסת סלין סטרילית. סבב בצנטריפוגה כדי לרכז.

הבלין (baline) עקב אחר פרוטוקול ה-Z sustaining לספירה ואחר פרוטוקול הצביעה הפלואורסצנטית לקביעת החיוניות. הכינו תרחיף המכיל 10 עד 8 BA לכל מנה, והומוגניזו את התרחיף לפני הזרקה לכל בעל חיים. שאבו 100 µL למזרק אינסולין והזריקו 30 µL לכריות כף הרגל האחורית של כל בעל חיים לצורך קביעת החיוניות.

פלואורסצנציה ירוקה נצפתה בכל ה-BAI ופלואורסצנציה אדומה רק ב-bai. כאשר ה-BAI שימשו כביקורת ללא זיהום, נצפתה אותה עוצמה של אור BAI ירוק ואדום. הזרקה של M Lepar שהוקפאו לפרקי זמן שונים הניבה עלייה של 10 עד 1000 פעמים במספר ה-BAI שהתגלו לאחר שבעה חודשים.

כהערה סופית, ברצוננו להוסיף שמאחר ש-IL leid אינו גדל in vitro, פרוטוקול זה מאפשר דרך מהירה וקלה לשמירה על yl Leid חיוני הזמין לשימושים נוספים במעבדה.