חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ביצוע דימות בשפת זמן (time-lapse) של התנהגות תאי גליה בעקבות פגיעה בעצב פריפרי בזריקים חיים בשלב הזחלים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי קיבוע של זחלי זריקים שהורדמו באגרוז (agarose) בעל נקודת התכה נמוכה על פטריות עם תחתית זכוכית, ומיקומם באמצעות מחט דיסקציה. לאחר מכן, הזחלים המקובעים מונחים במיקרוסקופ קונפוקאלי.

נבחר עצב לצורך אבלציה (ablation) ונרכשת תמונה של האקסונים והתאים הגליאליים של העצב שאינו פגוע. לאחר מכן נבחרים תחומי עניין (ROIs) לאורך העצב והלייזר נורה כדי לבצע אבלציה באזורים הנבחרים, דבר היוצר ניתוק של העצב. לבסוף, נבצע הדמיית time-lapse של האקסונים והתאים הגליאליים בעקבות ניתוק העצב.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות התנהגות דינמית של תאי גלייה במהלך ניוון והתחדשות של עצבים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של צילומי רצף (time-lapse). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי ההתחדשות והביולוגיה של תאי הגלייה, כגון: כיצד מגיבים תאי גלייה לפגיעה עצבית? וכיצד תתי-סוגים שונים של תאי גלייה מתאמים את התנהגותם במהלך ניוון והתחדשות?

לאחר הצלבה של דגי זברה בוגרים הנושאים טרנסגנים המסמנים פלואורסצנטית נוירונים מוטוריים וסוגי תאי גליה רלוונטיים, והדגרה של העוברים עד 24 שעות לאחר ההפריה (HPF), הסירו את מי הביצים והחליפו אותם ב-1% PTU במי ביצים לפני החזרת העוברים למדגרה. מנקודת זמן זו ועד לכ-96 HPF, השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי כדי לסרוק את העוברים לנוכחות הגן הפלואורסצנטי המבוקש. העבירו את העוברים החיוביים למי ביצים טריים עם PTU והחזירו אותם למדגרה.

כאשר הזחלים הגיעו לשישה ימים לאחר הפרטילזציה (DPF), בחרו מספר עוברים להרכבה והעבירו אותם לכלי קטן יותר. הסירו את המים מהכלי והחליפו אותם מיד ב-0.02% tricaine PTU egg water, והדריכו את הזחלים בחומר ההרדמה למשך כחמש דקות. הניחו מנת אגרוז בנמסה נמוכה בריכוז 0.8% (low melt agarose), שהוכנה מראש לפי הפרוטוקול הכתוב, לתוך כלי זכוכית עם מי ברז במיקרוגל.

במשך 30 שניות או עד שה-agros נמס, הניחו לכלי הביקר להתקרר עד שנבוב ה-agros מרגיש פושר למגע. לאחר מכן, העבירו זחל שהורדם לכלי זכוכית עם תחתית שטוחה בקוטר 35 מילימטר. הסירו כל שארית מים מהכלי.

לאחר מכן, כסו מיד את הזחלים בכמות מספקת של agarose חם למילוי החלק בעל תחתית הזכוכית של הצלחת. ככל שה-agarose מתקשה, השתמשו במחט דיסקציה כדי למקם את הזחלים על צדם. לאחר מכן, הטו אותם מעט על גבם, תוך וידאי שאת הזחלים המקובעים נוגעים בזכוכית בתחתית הצלחת, דבר הנחוץ לצורך גרימה לפגיעה ולדימות.

השתמשו במחט כדי להחזיק את הזחלים במקומם עד שהאגרו יתמצק והזחל יהיה מקובע. לאחר מכן, העבירו באיטיות בעזרת פיפט כמות מספקת של מי טריקה למנה כך שיכסו לחלוטין את האגרו ואת הזחלים. הפעילו את כל ציוד מיקרוסקופ הקונפוקלי, את לייזרי הדיודה המתאימים לעירור טרנסגנים של דגי זברה ואת לייזר הצבע המופעל על ידי חנקן.

ודאו שמפליט האלומה הריק נמצא במקומו ושהתא הצבע וה-coer ב-435 nanometer נמצאים במקומם. פתחו את מנמיך עוצמת הלייזר באופן מלא ולאחר מכן פתחו את תוכנת ההדמיה עם עדשת טבילה במים של 63 x 1.2 na וזכוכית עם צד אחד משקף. השתמשו בתאורה בשדה בהיר (brightfield) כדי למצוא ולמקד שריטה או חריץ במראה.

באמצעות תוכנת דימוי, צפה בטביעות והתאם את המיקוד שלהן על מסך המחשב דרך החלון השולט בכיול הלייזר ובהגדרות ההספק. הגדר את מספר הפולסים לאחד ואת הניחות ל-3% transmission מסרגל הכלים הראשי. בחר בכלי האליפסה ולחץ על התמונה במסך המחשב.

כדי ליצור ROI מעגלי בודד, חזרו על התהליך שלוש פעמים נוספות עד שיהיו ארבעה ROI מעגליים המפוזרים באופן אקראי על פני התמונה. לאחר מכן, הפעילו את הלייזר. אם הלייזר פועל ומכויל כראוי, פעולה זו תיצור ארבעה תהרימי נקודה קטנים, אחד בתוך כל ROI מעגלי. לאחר מכן, הוציאו את פלסית הזכוכית מבמה המיקרוסקופ ונקו את העדשה.

החליפו את מחלק הקרן הריק במחלק קרן מסוג 100%ILL כדי לבצע חיתוך של עצב מוטורי באמצעות אבלציה בלייזר. מרחו טיפה קטנה של מדיום טבילה במים על העדשה והניחו את הצלחת עם הזחלת המורכבת על הבמה המתאימה, והשתמשו בתופסנים לייצובה בעזרת העין והתאורה רחבת השדה. התמקדו בזחלות ואתרו את הנוירונים המוטוריים.

סרקו את העצבים בסגמנטים חצייים 10 עד 20 ובחרו עצב מוטורי לניתוק. לאחר מכן, הציגו תצוגה חיה של העצב על מסך המחשב. בחרו במישורי Z והשיגו תמונה של האקסונים ותאי הדבקיה של העצב שאינו פגוע.

לאחר מכן, הכינו את הגדרות הדמיון בשיטת time-lapse לצילום היטל Z (Z projections) של כל סוגי התאים במרווחים של 5 עד 30 דקות. בהתאם לניסוי, הסירו את מפחית האור (beam splitter) מסוג 100%ILL והחליפו אותו בלוח ריק (blank). חזרו לתצוגה חיה של העצב והשתמשו בערוץ הפלואורסצנציה המתאים כדי לצפות באקסונים שייחתכו.

באמצעות כלי האליפסה, צור ROI אליפטי דק באזור המיועד לאבלציה. לאחר מכן, צור ROIs קטנים יותר בתוך האזור שנבחר בחלון השולט בהגדרות הלייזר. הגדר את מספר הפולסים לשניים ואת לוח העמעום ל-18% transmission.

לאחר מכן, הפעילו את הלייזר בתוך ה-ROIs שנבחרו. המתינו 10 שניות או יותר ובדקו שוב את האזור שהוסר (ablated area) כדי לאתר פלואורסצנציה. שימו לב ש-ROI עשוי להיראות בתחילה כמי שהוסר ממנו רקמה, בעוד שבפועל חל תהליך של פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching), וייתכן שיהיה צורך לשנות מעט את ה-ROIs במהלך תהליך האבלאציה כדי להשיג חיתוך מלא (complete transection).

אם הפלואורסצנציה חוזרת, הגבירו את עוצמת הלייזר והפעילו אותו. חזרו על פעולה זו עד שהפלואורסצנציה נעלמת בתוך ה-R OIS ואינה חוזרת בתוך 10 שניות. לאחר השלמת האבלציה, התחילו בדימוי time-lapse; כאשר ה-time-lapse מסתיים.

השתמשו בתוכנת דימוי כדי לאסוף את הנתונים וליצור הש projection Z מורכב בצבעים עבור כל נקודת זמן. צרו סרטון QuickTime כדי לנתח בו-זמנית את התנהגותם של האקסונים ותאי הגליה. את הבדיקה המתוארת כאן ניתן להשתמש בה כדי להעריך את תגובתם של תאי הגליה ואוכלוסיות תאים אחרות הקשורות לעצב לפני פגיעה אקסונלית in vivo.

כאן מוצגת דוגמה לפגיעה עצבית שנוצרה בשימוש בשיטה זו ותגובת התאים הגליאליים שמסביב. הניסוי בוצע בדגי zebrafish טרנסגניים בני שישה DPF, שהביעו EGFP מכוון לממברנה בתאי ggl פרי-נוראליים, ו-DS red ציטוזולי בנוירונים מוטוריים. הפגיעה נגרמה לאורך ההשלחה הרוסטרלית של עצב מוטורי בגו, אשר צולמה לאחר מכן בשיטת time-lapse בערוצי EGFP ו-DS red.

דבר זה אפשר ויזואליזציה בו-זמנית של התנהגויות האקסונים ותאי הגליה מיד לאחר הפגיעה. תמונות אלו הן נקודות זמן סטטיות שנלקחו מסרט ה-time-lapse. האליפסה המקווקוות מראה את ה-ROI שהוסר באמצעות הלייזר לאחר דקה אחת.

לאחר החיתוך או ה-MPT, באזור שהוסר לא נצפתה פלואורסצנציה, ואזור הפגיעה נמדד כ-3.5 micrometers מהקצה הפרוקסימלי לקצה הדיסטלי. ניתן לאשר את הצלחת החיתוך על ידי דימות של קצה העצב הדיסטלי וחיפוש סימנים לניוון ואלריאני (wallerian degeneration), כולל פרגמנטציה של אקסונים דיסטליים ופינוי מהיר. היעדר פלואורסצנציה אקסונלית לאורך הקצה הדיסטלי ב-120 MPT מעיד כי אקסונים אלו אכן עברו ניוון ואלריאני וכי החיתוך הצליח.

התאמת הספק הלייזר להגדרה אידיאלית היא קריטית בעת ביצוע ניסויי אבלציה בלייזר. הגדרות הספק לייזר אידיאליות יבצעו אבלציה נקייה של העצב רק בתוך ה-ROI הנבחר; הגדרות הספק לייזר נמוכות או גבוהות מדי יניבו תוצאות תת-אופטימליות. כאן מוצגת פגיעה שבוצעה עם הספק לייזר נמוך מדי. הפלואורסצנציה נותרה בתוך ה-ROI לאחר הפעלת הלייזר, מה שהוביל לניתוק (transection) חלקי.

מצד שני, כפי שמוצג בדמות זו, הספק לייזר גבוה מדי גרם לשחיקה גדולה באופן קיצוני. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן קיבוע דגי zebrafish לניסויי חיתוך בלייזר. בצעו חיתוך באמצעות לייזר צבע עם משאבת חנקן, והעריכו את תגובת התאים הסובבים באמצעות דימוי קונפוקלי בשיטת time-lapse.