ניתוח התנהגות תפוקה גבוהה אוטומטי בזחלי דג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות פגמים התנהגותיים בזחלי דג הזברה לאחר טיפול בחומרים רעילים או תרופות. זה מושג על ידי איסוף וטיפול ראשוני בעוברים או בזחלים בכימיקלים עד שבעת הימים הראשונים להתפתחות. השלב השני הוא יצירת מסלולי שחייה אגרו באמצעות תבניות שתוכננו במיוחד.

לאחר מכן, הזחלים המטופלים ממוקמים בנתיבי האגרוס לניתוח התנהגותי באמצעות צילום זמן-lapse. השלב האחרון הוא לייבא את התמונות לתמונה J ולהשתמש במאקרו ספציפי שנכתב בתוך הבית על מנת לאסוף נתוני קואורדינטות XY של הזחלים בנתיבים. בסופו של דבר, המבחן ההתנהגותי בעל תפוקה גבוהה משמש למציאת הבדלים בהימנעות ובהתנהגות ציר פיגמה, כמו גם במהירות השחייה והמנוחה בין קבוצות הטיפול.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלה הזמינות מסחרית הוא שאנו יכולים להשתמש בשיטה שלנו כדי לצפות בהתנהגויות מורכבות יותר. זה גם זול לבנייה וקל להתקנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח ההתנהגותיים, כגון כיצד חומרים רעילים משפיעים על התפתחות המוח וההתנהגות במהלך חשיפה מוקדמת לעובר.

זה יכול גם לספק תובנה לגבי פגמים מוחיים עדינים בבני אדם, שלא ניתן למצוא על ידי מסכי רעילות אחרים כיום. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שתפיסת הזחלים יכולה להיות קשה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שלשלבים יש עקומת למידה מכיוון שהפרוטוקול כולל מערכות בנויות בהתאמה אישית.

כדי להתחיל בהליך זה, הכנס למיכלים כלי פיירקס מזכוכית עם דשא מזויף העשוי מחוט ירוק. עם עלות השחר, השאירו את הכלים במיכלים למשך שעתיים על מנת לאסוף עוברי דג זברה. יוצקים את כלי הזכוכית המכילים את העוברים על מסננת כף יד עם מים נטולי יונים.

לאחר מכן, גדלו את העוברים במי ביצים המכילים 60 מיליגרם לליטר אוקיינוס מיידי במים נטולי יונים ו-0.25 מיליגרם לליטר מתילן כחול, המשמש כמעכב עובש. ניתן לאחסן את העוברים ב-50 עד 60 זחלים ל-50 מיליליטר או במיכלי רבייה גדולים יותר עד שהעוברים מוכנים לטיפול בחומרים רעילים. בהתאם להשערת הניסוי הבודד, ניתן לטפל בעוברים באופן מיידי או בשלבי התפתחות ספציפיים באמצעות חומרים רעילים או תרופות, אשר בדרך כלל מומסים ב-DMSO ולאחר מכן מדוללים עוד יותר ישירות במדיום מי הביצים.

הצבע הכחול משמש למטרות הדגמת וידאו במהלך טיפול עוברי וזחלים. ניתן לשכן את הזחלים והעוברים בצלחות פטרי עמוקות בצפיפות של כ-50 עד 60 זחלים ל-50 מיליליטר עד שהניתוח ההתנהגותי בשבעה ימים לאחר ההפריה משנה את תמיסת מי הביצים לפחות כל יומיים כדי למנוע צמיחה פטרייתית או חיידקית מהעוברים המתים. תבניות פלסטיק יוצרו ליצירת נתיבים באמצעות aros, שנשפך לתוך לוחות פלסטיק לבאר אחת מבית Thermos Scientific.

התבניות מכילות חמישה נתיבים בהם הדפנות בזווית של 60 מעלות. ראה את פרוטוקול הטקסט המלווה את הסרטון הזה למידות התבניות והצלחות? ראשית, הכינו את הארוס על ידי המסה של 0.8% ארוס במים נטולי יונים עם 60 מיליגרם לליטר אוקיינוס מיידי.

לאחר מכן, צור את הנתיבים על ידי יציקת 50 מיליליטר של הארוס המומס לצלחת באר אחת. ואז לאט מאוד הניחו את התבנית על גבי הנוזל שמבטל כל היווצרות בועות. הסר את התבנית כשהארוס התקרר.

ניתן לאחסן את נתיבי הארוס בטמפרטורת החדר עם המכסים על הכלים עד 36 שעות. לניתוח התנהגותי בתפוקה גבוהה, ארונות הדמיה מוכנים עם מצלמה דיגיטלית של 15 מגה פיקסל המחוברת לחלק העליון של הארון עם הפנים כלפי מטה בתחתית הארון. מחשב נייד עם מסך בגודל 15.6 אינץ' ממוקם כשהמסך פונה כלפי מעלה.

על מנת להימנע מהתחממות יתר של הזחלים, עדיף להשתמש במחשב נייד עם טמפרטורת מסך שאינה עולה על 28 מעלות צלזיוס. הניחו מפזר פלסטיק על גבי מסך המחשב הנייד עליו יונחו צלחות האגרוס. המפזר ימנע דפוסים נוספים בתמונות שנאספו.

כדי להתחיל בצילום תמונה, העבירו בזהירות את הזחלים מצלחת הפטרי לנתיב האגרוס כדי לסייע בהפחתת הלחץ של הזחלים. ניתן למקם עד 20 זחלים בכל נתיב, אך בדרך כלל משתמשים בחמישה זחלים בכל נתיב כדי להקל על המעקב המדויק ביותר אחר מהירות השחייה ולהפחית את מספר הזחלים הדרושים לכל ניסוי, למלא את המסלולים במי ביצים, עם או בלי תרופות או חומרים רעילים בהתאם לניסוי. אל תמלא את הנתיבים עד הסוף עד שהם ממוקמים בארונות ההדמיה כדי למנוע גלישה.

אפשר 10 דקות לזחלים להתאקלם לאחר תקופת ההתאקלמות. מקם ארבע צלחות ביד ישירות על גבי מסך המחשב הנייד. בשלב זה, ניתן למלא את הנתיבים בביצים, מים או טיפול כימי כך שהוא יהיה ישר עם החלק העליון של הנתיב כדי למנוע צללים בשולי הנתיבים.

בתמונות מתכנת המחשב לצילום דולג זמן, מצלם תמונות כל שש שניות בסך הכל 300 תמונות לכל ניסוי. הגדר את המצלמה ברזולוציה נמוכה יותר להדמיה במהירות וידאו. בעוד שהרזולוציה הנמוכה יותר מגבילה את ההקלטות לצלחת מרובת בארות אחת.

הקלטות הווידאו מתאימות להדמיית אירועי שחייה מהירה. השתמש במצגת PowerPoint כגירוי מרתיע לזחלים בהדגמה זו. PowerPoint מתחיל עם רקע לבן ריק למשך 15 דקות, ואחריו 15 פס אדום נע בחצי העליון של הצלחת.

כדי למנוע אידוי של הנוזל בתוך נתיבי ה-aros, שמור על זמן ההדמיה המקסימלי מתחת לשעה. פתח את התמונות עם תמונה J בהדגמה זו. נעשה שימוש במאקרו פנימי לניתוח זחלים של חמישה נתיבים וניתן להפוך אותו לזמין לכל משתמש.

השתמש בהנחיות במאקרו כדי להגדיר את הפרמטרים, כגון מספר התמונות והצבע שיש להחסיר. לאחר מכן, המאקרו מפצל אוטומטית את ערוץ הצבע כך שניתן יהיה להסיר את הצבע האדום. מחסיר את הרקע, מחיל סף ומזהה את הזחלים על ידי ניתוח חלקיקים.

לאחר שכל התמונות עוברות דרך המאקרו J של התמונה, יוצג קובץ תוצאות שיכיל את קואורדינטות ה-XY של הזחלים הבודדים עבור כל תמונה, יחד עם מספר התמונה ומספר הנתיב. שמור את קובץ התוצאות בתבנית Excel ומיין על סמך רקע ריק לעומת רקע הסרגל הנע ולאחר מכן מספר הבאר. השתמש בתבנית Excel הכוללת משוואות מוכללות כדי לקבוע באופן אוטומטי את מיקום הזחלים בבארות, מרחק בין זחלים, מהירות תנועה וכמות מנוחה.

תבנית האקסל העדכנית ביותר שנוצרה במעבדת Cretin זמינה על פי בקשה לבנות גרפים המציגים קבוצות טיפול שונות בגיליון האקסל, יחד עם מבחן T להשוואה בין קבוצות טיפול וביקורות. ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי נוסף באמצעות תוכנת הסטטיסטיקה SPSS. התוצאות מוצגות עבור זחלים שטופלו במי ביצים ו-DMSO כבקרות וריכוזים משתנים של חומר הדברה אורגנו-פוספט הנפוץ במזונות לא אורגניים.

כאן הפסים הלבנים מראים נתונים מזחלים שנחשפו לרקע ריק, והפסים האדומים מראים נתונים מהזחלים שנחשפו לפס האדום הנע. לשלוט. זחלים הגדלים במי ביצים מראים העדפה מוגברת להיות למטה בצלחת לאחר שמציגים להם את הפס האדום הנע. תוצאות דומות מתקבלות כאשר מגדלים זחלים במי ביצים המכילים מיקרוגרם אחד למיליליטר של DMSO, ממס המשמש בדרך כלל להמסת תרופות וחומרים רעילים שונים כ-1000 x תמיסות מלאי.

הגרפים מציינים את המדידות שניתן לקבל מניתוח התנהגותי, כולל אחוז הזחלים למטה בנתיב, אחוז הזחלים בקצה השביל, אחוז הזחלים בשולי השביל, המרחק בין מהירות השחייה של הדגים של הזחלים ואחוז הזמן שהזחלים נמצאים במנוחה. התוצאות המוצגות הן דגימה מניסוי אחד. עם זאת, כאשר חוזרים על עצמם, התוצאות מצביעות על כך שמהירות השחייה והתנהגות הפיגמה משתנות על ידי ריכוזים נמוכים של חומרי הדברה אורגנו-פוספטים, המחקים רמות במזון אנושי לאחר שליטה, ניתן לבצע את ניתוח ההדמיה וההדמיה תוך שעה וחצי אם הוא מבוצע כראוי.

ההיבט החשוב ביותר בהליך זה הוא לזכור לשמור על המדיום התרבותי נקי על ידי החלפתו במדיום חדש מדי יום.