בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבודד ליפופוליסכריד מהמעטפת החיצונית של חיידקים גרם-שליליים ולאפיין מבנית את חלק הליפיד A באמצעות פרוטוקולים של MS טנדם. הדבר מושג על ידי מיצוי כימי של ליפופוליסכריד מפני השטח של התא החיידקי, ולאחר מכן הידרוליזה חומצית עדינה לשחרור הליפיד A מהחלק הפוליסכרידי של הליפופוליסכריד. כשלב שני, תמיסה של ליפיד A מנותחת באמצעות MSMS עם יינון בפיזור אלקטרוסטטי (electrospray ionization).

בפרוטוקול שלנו, lipid A מאותחל באמצעות MS MS המבוסס על דיסוציאציה מושריתהתנגשות (collision induced dissociation) או על פוטודיסוציאציה באור על-סגול (ultraviolet photo dissociation) לצורך אפיון מבני. התוצאות מראות הבדלים בתבנית הפרגמנטציה בספקטרומיית מסה שהופקה מפרוטוקולי MS MS המבוססים על דיסוציאציה מושרית התנגשות או על פוטודיסוציאציה באור על-סגול, כאשר UVPD מניבה תבנית פרגמנטציה אינפורמטיבית יותר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שספקטרומטריית מסה טנדם מאפשרת את פענוח האנליטים המיועדים על בסיס פרשנות של תבניות פרגמנטציה אבחנתיות.

דיסוציאציה פוטוכימית בעזרת קרינת על-סגול, ובמיוחד דיסוציאציה פוטוכימית, היא שיטת MSMS בעלת אנרגיה גבוהה המייצרת יוני שברים מגוונים יותר מאשר טכניקות קיימות כגון דיסוציאציה מושרית התנגשות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שיטת הספקטרומטריית מסות UVPD שנעשה בה שימוש טרם הומסחרה. בנוסף, השיטה משתמשת בלייזר שהוטמע בספקטרומטר מסות באמצעות התאמות מותאמות אישית לפני תחילת הליך זה.

קצרו תאים מתרבית חיידקים של 250 ml; סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-10,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, שפכו את העליון (supernatant) של מצע הגידול, ושטפו את משקע התאים עם 50 ml של 1x PBS. לאחר סבב צנטריפוגה נוסף להשקיע את התאים, שפכו את העליון.

בשלב הבא, השעו מחדש את התאים ב-40 ml של 1X PBS וחלקו אותם בין שתי מבחנות צנטריפוגה של Teflon בנפח 250 ml. הוסיפו לכל מבחנה 25 ml של כלורופורם ו-50 ml של מתנול ליצירת תערובת חד-פאזית. ערבבו על ידי הפיכת המבחנות והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפחות.

כדי להבטיח ליזיס מלא של התאים, סבבו את התערובת בצנטריפוגה ב-2000 $\times$g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר והסִירו את הנוזל העליון. שטפו את משקע ה-LPS עם כ-100 ml של תערובת Bly dire חד-פאזית. סבבו בצנטריפוגה ב-2000 $\times$g למשך 20 דקות והסִירו את הנוזל העליון.

הוסיפו 27 µL של בופר להידרוליזה חומצית מתונה למשקע ה-LPS וערבבו באמצעות שאיבה והזרקה (pipetting) עד שנותרו רק חלקיקים קטנים. בצעו סוניקציה באמצעות ראש Probe כדי להגיע לסספנזיה הומוגנית. השעו את משקע ה-LPS בתמיסה במחזור עבודה קבוע למשך 20 שניות ב-50% מההספק. חזרו על הסוניקציה של הדגימה פעמיים, עם 20 שניות לכל פעימה ומרווח של כ-5 שניות בין הפעימות.

לאחר מכן, הרתיחו את הדגימות באמבט מים למשך 30 דקות. הוציאו את המבחנות מאמבט המים והמתינו לקירור הדגימה לטמפרטורת החדר. לפני השלב של מיצוי lipid A לאחר ההידרוליזה, המירו את תמיסת ה-SDS לתערובת BLY דו-פאזית על ידי הוספת 30 µL של כלורופורם ו-30 µL של מתנול ליצירת תערובת של כלורופורם, מתנול ובאפר להידרוליזה בחומצה חלשה; ערבבו על ידי היפוך ובצעו צנטריפוגה.

סבב את דגימת ה-S למשך 10 דקות ב-2000 ×g. באמצעות פיפטת זכוכית, העבר את הפאזה התחתונה למבחנת צנטריפוגה נקייה מטפלון. לאחר מכן, בצע חילוץ שני על ידי הוספת 30 µL של הפאזה התחתונה מתערובת דו-פאזית של bly dire שהושגה שיווי משקל, אל הפאזה העליונה במבחנת הדגימה, ערבב באמצעות היפוך וסבב ב-2000 ×g למשך 10 דקות. חלץ את הפאזה התחתונה באמצעות פיפטת זכוכית ואגד אותה עם הפאזה התחתונה שחולצה קודם לכן.

שטפו את השכבות התחתונות המאוחדות על ידי הוספה של 114 mil של פאזה עליונה של bly dire שהושגה שיווי משקל, כדי ליצור תערובת דו-פאזית של bly dire; ערבבו באמצעות הפיכה וביצעו צנטריפוגה. סובבו במהירות של 2000 ×g למשך 10 דקות והשתמשו בפיפט העברה מזכוכית. העבירו את הפאזה התחתונה לבקרה נקייה של אידור סיבובי מזכוכית וייבשו את הדגימה באמצעות אידור סיבובי.

בשלב הבא, הוסיפו 5 mL של תערובת כלורופורם-מתנול לבקבוק המגירה (rotary flask) ובצעו סוניקציה במכשיר אולטרסוני עבור 30 שניות לפחות, כדי לסייע בהשעיה של lipid A מדפנות הבקבוק. השתמשו בפיפט העברה מזכוכית כדי להעביר את הליפיד למבחנה נקייה מזכוכית, הסגורה באמצעות פקק הברגה פנולי עם ציפוי A-P-T-F-E.

ייבשו את הדגימה תחת זרם של חנקן באמצעות מייבש חנקן. השעיקו מחדש את השומן המיובש ב-1 mL של תערובת כלורופורם-מתנול. לאחר הוספת הממס, ערבלו את התערובת במכשיר vortex כדי להבטיח השעיה מלאה.

העבירו למסביבת דגימה קטנה מזכוכית וייבשו באמצעות מייבש חנקן. אחסנו את הדגימה המיובשת בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לביצוע ניתוח TLC או MS בעתיד. ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לניתוח הבא.

לאחר הכנת הדגימה, ערבבו 200 µL של methanol בדרגת HPLC עם 200 µL של chloroform בדרגת HPLC בתוך מבחנה קטנה וריקה מדגימה מזכוכית. העבירו 200 µL מתערובת הממס של chloroform ו-methanol למבחנה המכילה את lipid A, ובצעו סוניקציה לתכולת המבחנה למשך חמש דקות או עד להמסה מלאה של כל החומר. לאחר מכן, הגדירו את ספקטרומטר המסות למצב שלילי של electrospray ionization ומלאו מזרק של 250 µL בתמיסת lipid a.

החדירו את המזרק למשאבת מזרקים והזרים ישירות את הליפיד המדולל. דגימה בקצב זרימה של 2.0 עד 3.5 µL לדקה. בצעו אופטימיזציה ושיפור של אות יוני הליפיד באמצעות כוונון של אופטיקת היונים.

אספו את ספקטרום המסות של הליפיד. בודדו מין אחד והפעילו את הליפיד A המטרה על ידי בחירה ב-CID כשיטת ה-MSM. לאחר מכן, הגבירו את מתח ה-CID או את אנרגיית ההתנגשות הנורמלית עד לפירוק הליפיד הקדם.

מין בעל שפע יחסי של כ-10% בהשוואה לאיון המוצר בעל השפע הגבוה ביותר; רכוש ומצע את הספקטרה עד להשגת יחס אות לרעש מספק. עבור יוני המוצר, הכן את הדגימה ואת ספקטרומטר המסה כפי שמתואר בסעיף הקודם. הדלק את הלייזר המחובר לספקטרומטר המסה.

ראו את הפרוטוקול הכתוב לפרטי ה-MS, הגדירו את תוכנת המכשיר כך שהלייזר יפעיל את לייזר האקסימר כאשר היונים נכנסים לתא ה-HCD; לאחר מכן, הפעילו את מחולל הפולסים כך שהלייזר יפעיל פולס בכל שתי מילישניות. בודדו את יון הקדמון של הליפיד על ידי בחירה ב-HCD כשיטת ה-MS MS וכוונו את האנרגיה ההתנגשותית ל-1% normalized collision energy; הפעילו את יון הליפיד המבודד על ידי הגברת אנרגיית הלייזר וכוונון מספר פולסי הלייזר, שבדרך כלל הם עשרה פולסים של six milli joule. לבסוף, רכשו ובצעו ממוצע של הספקטרה עד להשגת יחס אות לרעש מספיק.

עבור יוני המוצרין של UVPD. ספקטרום המסה של MALDI TOF ביוניים שליליים של ליפיד A מזן E Coli K 12 W 3 110 מניב מין דפרוטוני יחיד ביחס מסה למטען של 1796.2 כמין העיקרי שנצפה. פרטי ניתוח ה-maldi מוצגים בפירוט בתוך פרוטוקול הטקסט.

לחלופין, אותה דגימת ליפידים שעברה ESI במצב שלילי הניבה בעיקר יוני ליפידים עם דפרוטונציה כפולה ביחס מטען ראשי של 898.1. יוני ליפידים עם דפרוטונציה יחידה ביחס מטען ראשי של 1796.20 ניתנים לצפייה, אך בשפע יחסי נמוך יותר מאשר למינים עם דפרוטונציה כפולה. פרגמנטציה באמצעות CID או UVPD ב-193 nanometers בוצעה על יון הליפיד עם הדפרוטונציה היחידה. ניתן להשתמש בטכניקות אלו כדי להקצות מבנים כימיים בצורה מדויקת יותר, ובמיוחד של ליפידים.

מין המכיל שילובים מורכבים של מודיפיקציות או מודיפיקציות כימיות שלא אופיינו בעבר. פרופילי פרגמנטציה מוצגים עם קוים מקווקווים המייצגים את אתרי השבירה, והם תואמים לערכי יחס המטען הראשי המופיעים מתחת לכל מבנה שסופק. ערכי יחס המטען הראשי ואתרי השבירה המודגשים בגופן אדום מייצגים יוני מוצר ייחודיים הקשורים לליפיד המסומן ב-UVPD 32 P.

ליפיד A שבודד משני זנים שונים של e coli K 12 נאלח באמצעות TLC. הפרוטוקול להליך זה מפורט בתוך הפרוטוקול הטקסטואלי. זן K 12 W 3 110 מכיל בעיקר BIS וליפיד A טריס-פוספורילציה, או שניתן להבחין בתבנית TLC מורכבת יותר עם 32 p ליפיד.

הבודד ממאבקי *E. coli* זן WD 1 0 1. WD 1 0 1 מייצר ליפיד. מושג שינוי משמעותי עם רבינו ופוספואתנולאמין.

מאחר ששני פוספטים, במיקומים 1 ו-4 פריים, זמינים לשינוי, ניתן לתאר את הליפיד A מ-WD 1 0 1 כמודיפיקציה בודדת המכילה רק el amino arabinose אחד או phosphoethanolamine באחד הפוספטים, או כמודיפיקציה כפולה שבה שני הפוספטים עברו שינוי באופן קומבינטורי. בנוסף למודיפיקציה בפוספטים 1 ו-4 פריים, נצפתה גם תוספת של Palmitate, המגבירה את ערך ה-RF של מיני ליפיד a במערכת ממס זו. פרוטוקול זה סלל באופן ייחודי את הדרך עבור חוקרים בתחום המיקרוביולוגיה להעמיק בחקירת יחסי מבנה-תפקוד בכל הנוגע לאופן שבו מודיפיקציות של ליפיד a משפיעות על הביולוגיה של חיידקים גראם-שליליים.

אנו מעוניינים מאוד ונינו להוכיח את יעילותו של MS המבוסס על UVPD לאפיון של מבנים של מולקולות בעלות חשיבות ביולוגית, כגון גליקנים, חלבונים, חומצות גרעיניות ושומנים מורכבים אחרים. זכרו כי עבודה עם ממסים אורגניים, חומרים מסוכנים ביולוגית ולייזרים עלולה להיות מסוכנת ביותר. חשוב להדגיש כי יש לטיפל בממסים בתוך מapay fume hoods כימיים מאווררים.

יש להשתמש תמיד בציוד מגן מתאים, כגון כפפות ומשקפי מגן, ויש להגן כראוי על הלייזר המשמש ל-UVPD.