פרוטוקול גנטי אינדוקציה ויזואליזציה של גידולים שפירים ופולשני בסוג cephalic מכלולי Melanogaster דרוזופילה
11 בספטמבר 2013
שיתוף פעולה בין אונקוגן הופעל כמו RAS V12 ומוטציות בגנים קוטביות תא כמו שרבטה, לגרום לצמיחת גידול בדרוזופילה שבו תאים סרטניים גם להציג התנהגויות פולשנית. הנה פרוטוקול פשוט לאינדוקציה והתבוננות בגידולים שפירים ופולשנית מוצג.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום לגידולים שפירים ופולשניים בדרוזופילה, ולאחר מכן לדמיין אותם על ידי ניתוח קומפלקס הזחל. זה מתחיל בהתמקמות בין הזנים הרצויים ובידוד צאצאי הזחל, הנושאים את הגידולים הפולשניים או השפירים. השלב הבא הוא לנתח את הזחלים שנבחרו.
לחשוף את הקומפלקס הצפלי על ידי חיתוך שני שליש מהדרך למטה, אבטחתם ולאחר מכן הפיכתם כלפי חוץ. לאחר מכן מנקים את רקמות הגוף והמעיים השומניות, ואז נשברים גם כל העצבים שעדיין מחוברים לחוט העצב הגחוני ולאפידרמיס הזחל. השלב האחרון הוא לדמות את הקומפלקס הצפאלי או לתקן אותו עבור יישומים במורד הזרם.
בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות ש-GFP תייג גידולים פולשניים או שפירים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה משאלות המפתח בביולוגיה של הסרטן. לדוגמה, ייתכן שתרצה להבין אילו גנים יכולים לעכב התקדמות של גידולים באורגניזם שלם.
לאחר שהושגו המלאים הגנטיים הנדרשים, הכינו תרבית התחלה של זן הבוחן. הכינו גם תרבית התחלה למלאי שנבדק. הכלאה של 10 בתולות נקבות ממלאי הבוחן עם 10 זכרים מהמלאי שנבדק.
אפשרו לזבובים להזדווג ולהטיל ביצים במשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן העבירו אותם לבקבוקון טרי כדי לייצר צאצאים נוספים. עקוב אחר בקבוקוני הצלב לאיתור ביצים וזחלי כוכב ראשון. הגדר צלב חדש.
אם הבקבוקונים שנאספו מראים שקיעת ביצים גרועה. אם הבקבוקונים שנאספו מתחילים להתייבש, הוסיפו רק שלוש עד ארבע טיפות מים מזוקקים כדי לשמור על לחות התרבית. המשיכו לעקוב אחר הבקבוקונים עד לשוטטות.
זחלי כוכב שלישי נוכחים. לאחר מכן המשך בניטור שלהם תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. באמצעות אותו הליך, אסוף זבובים הנושאים גידולים פולשניים באמצעות המלאי הרשום עד יום התרבית החמישי או השישי, זחלי כוכב שלישי נודדים יהיו זמינים מתרביות הגידול השפירות.
עם זאת, הם לא יהיו זמינים עד היום העשירי מתרביות הגידול הפולשניות. כדי לאסוף את זחלי הכוכב השלישי, הרטיבו מכחול דק במים מזוקקים וגרדו אותם מדופן הבקבוקון. מניחים את הזחלים במגלשת שקע עם XPBS קר, ולאחר מכן בעזרת מברשת צבע רטובה.
מגרדים כל חומר מזון מהאפידרמיס שלהם. למשך מספר דקות של קיבוע, הניחו את הזחל על הצלחת בחום של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לזמן קיבוע ארוך יותר, הניחו את הזחלים בבקבוקון תרבות עם תנומת זבוב בלבד על שרביט.
חבר את בקבוקון התרבות ותן לו לעמוד במשך 40 דקות. לאחר מכן, העבירו את הזחלים המשותקים למגלשת זכוכית. מוסיפים טיפה של שמן פחמימות הילה בהיר ומכסים את הזחלים בכוס כיסוי.
כעת, התבוננו בזחלים תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. לביטוי GFP, בחר את הזחלים הפלואורסצנטיים הירוקים והמשך בדיסקציה. זחלים שפירים נושאי גידול יזוהרו בירוק באזור הקדמי שבו קיים הקומפלקס הצפלי.
גידולים פולשניים יזוהרו גם בירוק באזור הקדמי של הזחלים בקומפלקס הצפלי. במידת האפשר, הקפד לתעד את הגידולים הפלואורסצנטיים. לכן האפידרמיס השקוף של הזחל מקשה על התבוננות במידת הנדידה של הגידולים, ולכן עלינו לנתח את הגידולים.
התחל בשימוש במלקחיים כדי להעביר זחל טרי עם כל אחד מהגידולים. הקלד לבאר של צלחת דיסקציה המכילה מיליליטר אחד של XPBS קר. החזיקו את הזחלים באמצעות זוג מלקחיים במרחק של כשני שליש מהקצה הקדמי.
שימוש בזוג מלקחיים נוסף מפריד בצורה חכמה את השליש האחורי של הזחלים ומשליך אותו. לאחר מכן הוא שחרר את שני השלישים הקדמיים. כאשר הלחץ בתוך הזחלים משתחרר, תוכנו יזלוג החוצה מחלל הגוף.
בעזרת מלקחיים, הסר את הרקמות שנזלו מחלל הגוף. לאחר מכן, החזיקו את וו הפה של הזחל ודחפו אותו לתוך אפידרמיס הזחל. שימוש בזוג המלקחיים השני הפוך לחלוטין את הזחלים.
כעת בעזרת המלקחיים, בעדינות ובזהירות, הסר את בלוטות הרוק של גוף השומן, המעיים, קומפלקס דיסק הכנף וכל צינורות קנה הנשימה. כעת ניתן לראות את הקומפלקס הצפלי מחובר לוו הפה. חצאי המוח וה-VNC עדיין מחוברים לאפידרמיס הזחל באמצעות עצבים הנובעים מה-VNC.
בעזרת מלקחיים, שברו בעדינות את החיבורים הללו. לאחר מכן הסר את כל עודפי השומן, הגוף או רקמות אחרות כך שהקומפלקס הצפלי ייראה בבירור. מחובר לאפידרמיס הזחל בקרסי הפה.
השאירו את הקומפלקס הצפאלי כפי שהוא להמשך עיבוד לפני ההדמיה. אחרת, כדי לדמיין ישירות את הקומפלקס הצפלי, נתק אותו מהאפידרמיס והנח אותו בטיפה של אמצעי הרכבה מבוססי גליצרול כגון מגן וקטור. באמצעות הפרוטוקול המתואר, הושרו גידולים בעין.
אנין דיסק, גידולים שפירים נותרו ממוקמים בעין אנין דיסק שם הם מושרים. שימו לב שהרקמה המסומנת ב-GFP לא נדדה לאיברים רציפים כמו חוט העצב הגחוני בקומפלקס הצפאלי הנושא גידולים פולשניים מיום 10 של צמיחת יתר של רקמת הגידול. כמו כן, כפי שצוין על ידי החץ האדום, הגידולים פלשו לאיברים רציפים כמו ה-VNC והווים בפה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום גנטית לגידולים שפירים ופולשניים, ולאחר מכן לדמיין אותם על ידי ניתוח הקומפלקס הצפאלי בתוך גסטרו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להשראה ולצפייה בגידולים שפירים ופולשניים ב-Drosophila, תוך התמקדות בשיתוף הפעולה בין אונקוגנים מופעלים לבין מוטציות בגנים של קוטביות תאית. ההליך כולל דיסקציה של המכלול הצפלי (cephalic complex) של הזחל כדי להמחיש את מאפייני הגידול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אונקולוגיה
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- אונקוגנים מופעלים כגון RAS V12 תורמים לצמיחת הגידול.
- מוטציות בגנים של קוטביות תאית, כגון scribbled, ממלאות תפקיד בהתנהגות גידולים סרטניים.
- Drosophila משמשת כאורגניזם מודל לחקר דינמיקת גידולים סרטניים.
- הבנת הפולשנות של הגידול חיונית למחקר הסרטן.
מטרת המחקר
- השראת גידולים שפירים ופולשניים ב-Drosophila.
- הדמיות של מאפייני הגידול באמצעות דיסקציה של זחלים.
- בחינת האינטראקציות בין אונקוגנים לבין מוטציות של קוטביות תאית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכלאה של זני Drosophila רצויים לצורך בידוד צאצאים בשלב הזחל.
- ביצוע דיסקציה לזחלים כדי לחשוף את הקומפלקס הצפלי (cephalic complex).
- ניקוי רקמות גוף השומן ומערכת העיכול מהזחלים שעברו דיסקציה.
- דימוי של הקומפלקס הצפלי לצורך ניתוח נוסף.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של גידולים שפירים ופולשניים ב-Drosophila.
- ויזואליזציה של מאפייני הגידול באמצעות נתיחה של זחלים.
- תובנות לגבי תפקידם של אונקוגנים ומוטציות של קוטביות תאית בהתנהגות הגידול.
- השלכות פוטנציאליות להבנת הביולוגיה של הסרטן.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר דינמיקת גידולים ב-Drosophila.
- הממצאים תורמים להבנת הפולשנות של הגידול.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון מטרות טיפוליות המבוססות על אינטראקציות אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך מנהלים
פרוטוקול זה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של נתיבי פלישה של גידולים על ידי מידול התקדמות משפירה לזדונית במערכת ניתנת לתפעול גנטי. הוא תומך בתיקוף מטרות באמצעות חקירה תפקודית של אינטראקציות בין גנים אונקוגניים לגני קוטביות. גישה זו מספקת ביטחון חיזוי לצורך תיעדוף של מודיפיירים גנטיים של התנהגות הגידול בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי בדיקת שיתוף הפעולה בין RasV12 מופעל לבין אובדן של הגנים scribble, discs large או lethal giant larvae.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגית של נתיבי פלישה באמצעות מדידה כמותית של התקדמות הגידול מגידול מקומי להתרחבות לרקמות סמוכות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנה של קומפלקסים צפליים (cephalic complexes) נושאי גידולים שעברו תיקוף, לצורך סריקה פנוטיפית של מדכאים או מחזקים גנטיים בשלבים הבאים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי הניתוח וההדמיה כדי להבטיח תוצאות כמותיות הדירות של מיקום הגידול וההסתננות שלו.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי מידול אינטראקציות גנטיות שמורות בפלישתיות של גידולים, הישירות למסלולים של סרטן בבני אדם.
- ערך תפעולי: תומך בהתאמה של סממנים ביולוגיים תרגומיים על ידי מתן אפשרות לניתוח של דפוסי התפרקות ונדידה של רקמת גידול המסומנת ב-GFP.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, מבדיקת השערות על מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה לגנומיקה תפקודית בביולוגיה של גידולים.
- ביולוגיה של התגליות: תומך בהבהרת מסלולים על ידי ויזואליזציה של התרחבות הגידול במכלולים צפליים (cephalic complexes) שלמים להערכת משנים גנטיים של פלישה.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות בידוד סטנדרטי של רקמת גידול המסומנת ב-GFP לצורך הערכת תרכובות או מדכאים גנטיים.
- אנליטיקה: מייצר מדידות כמותיות של גדילת יתר של הגידול ופלישה לאיברים כדי להשוות תנאים על רקעים גנטיים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין התגליות להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול של שלבים שמורים בהתקדמות הגידול הרלוונטיים למערכות יונקים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת לשימוש חוזר לצורך תיקוף מטרות בין-פרויקטלי בקווי מחקר של גילוי אונקולוגי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במודלים של פלישת גידולים על ידי קישור הפרעות גנטיות מוגדרות לתוצאות פנוטיפיות נצפות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות נתיחה סטנדרטית של זחלים והכנה של המכלול הצפלי (cephalic complex) לצורך דימות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת ביטחון פנוטיפי בשלבים מוקדמים לגבי מועמדים למדכאי גידולים או אונקוגנים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכונים על ידי הבחנה בין פנוטיפים של גידולים שפירים לפנוטיפים פולשניים בסריקות פונקציונליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וטכניקות של דיסקציה מיקרו-כירורגית.
- תלוי במיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי ובמערכות הרדמה בקירור לצורך קיבוע זחלים וטיפול ברקמות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים לתחזוקת זנים, תזמון ההכלאות ושלבי התפתחות הזחלים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום המודל על סוגי גידולים אחרים או רקעים גנטיים שאינם מקוריים מהדיסק של העין והמחוש.
- מוגבל על ידי הצורך בתיחום שלבים מדויק (יום 5–6 עבור גידולים שפירים, יום 10 עבור גידולים פולשניים) כדי להבטיח חלונות זמן ברי השוואה של התקדמות הגידול.
