הקמתה של

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבסס מערכת מודל של תרבית in vitro כדי לחקור התנהגות תוך-תאית של פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי אנושי, *Candida labarta*, במקרופאגים המופקים מקו תאי מונוציטים אנושיים TP-1. כדי להשיג זאת, מונוציטים של TP-1 מטופלים תחילה ב-PMA כדי לגרום להם להבדיל למקרופאגים.

בשלב הבא, מאקרופאגים THP-1 מודבקים בתאי Candida GTA שעתיים לאחר ההדבקה. תאי Candida GTA שלא נבלעו מוסרים על ידי שטיפות PBS, ותאי ה-e התוך-תאיים מופקים למחקרים נוספים באמצעות אוסמוז של המאקרופאגים המודבקים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להעריך הן את היחס הוויראלי לתאי Candida GTA במאקרופאגים, והן את תהליכי הבשלת ה-faiz ותגובת הציטוקינים במאקרופאגים THP-1 בעקבות הדבקה ב-Candida GTA.

בנוסף, ניתן להרחיב פרוטוקול זה כדי לסרוק את ספריית המוטנטים של candida collaborator עבור פרופילי הישרדות משתנים במקפגים של THP-1 באופן חצי-גבוה של תפוקה (semi high throughput). היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שהוא זול יחסית, בעל הדירות גבוהה וניתן להתאמה קלה לסוגי תאי חיסון שונים וכן לפתוגנים פטרייתיים. כדי להתחיל את הפרוcedure, יומיים לפני ההדבקה, יש להביא את תאי ה-THP-1 המונוציטיים ל-80% התאכיות (confluency); ביום הראשון, הוציאו את תרבית התאים ושקשקו אותה באיטיות ובעדינות כדי להביא את כל התאים לסביבת סספנסיה.

העבירו את תרחיף תאי המונוציטים מסוג DHP 1 למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 ml. צנטריפגו את תרחיף התאים בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות במהירות של 1000 RPM. שפכו את המדיום למכל פסולת, הוסיפו 5 ml של מדיום pre API למבחנה וערבבו. השהו את משקע תאי THV 1 על ידי פיפטינג עדין של המדיום שלושה עד ארבע פעמים.

קח 10 µL מתרחיף התאים כדי לקבוע את צפיפות התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer) והתאם את צפיפות התאים ל-1 מיליון תאים למל. הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת סטוק PMA בריכוז 60 µM לתרחיף התאים כך שהריכוז הסופי יהיה 16 nM וערבב היטב. חלק 1 ml של תרחיף תאים, המקביל למיליון תאים, לכל באער של פלטת תרביות רקמה בעלת 24 באערים והעבר אותה לאינקובטור המכוון ל-37 °C ו-5% CO2.

לאחר 12 שעות של דגירה, יש להסיר את המצע הישן. הוסף 1 ml של מצע pre RPI לכל באר ודגור את הפלטה למשך 12 שעות נוספות. תאים אלו ישמשו להדבקה בשיטת Canada atory, שתוצג בהמשך.

בהשתמש בשיטות עבודה מיקרוביולוגיות נאותות, זרעו מושבה אחת של EA לתוך בקבוק המכיל 1 ML של מצע YPD. דגרו את הבקבוק למשך 14 עד 16 שעות באינקובטור המכוון ל-30 Degrees Celsius. לאחר הדגירה, סבבו במערך צנטריפוגה 1 ML של התרבית ב-4,000 RPM למשך חמש דקות.

יש להשליך את הנוזל העליון (supernatant) ולשטוף את התאים שלוש פעמים ב-PBS סטרילי. לאחר השלכת בופר השטיפה, יש להשעות את משקע התאים ב-1 ml של PBS סטרילי באמצעות פיפוט עדין. לאחר מכן, יש למדוד את הבליעה (absorbance) של תרחיף התאים בספקטרופוטומטר באורך גל של 600 nanometer ולהתאים את צפיפות התאים ל-2 מיליון תאים ל-ml באמצעות PBS.

קח 50 µL של תרחיף התאים ודלל אותו פי מאה ב-PBS; פזר 100 µL מהתרבית על מצע YPD AGA. דגור את הצלחת בטמפרטורה של 30 °C וספור את מספר המושבות שהופיעו בצלחת ה-YPD לאחר יום או יומיים; הכפל מספר זה במקדם הדילול המתאים כדי לחשב את מספר היחידות יוצרות המושבות (colony forming units) בשעה אפס. מספר יחידות יוצרות המושבות אלו של Canada Reta ישמשו להדבקת DHE על מקרופגים.

בשלב הבא, הוסיפו 50 µL של תרחיף תאי Canada clater לשכבה מונו-מולקולרית של מקרופאגים בצלחת תרבית של 24 בארות. נערו את הצלחת כדי להפיץ את התאים באופן שווה והדגרירו בטמפרטורה של 37 °C. לאחר הדגירה של שעתיים, השליכו את המצע על ידי הפיכת צלחת התרבית לתוך מכל. שטפו כל בארה בצלחת התרבית עם 1 ml של PBS סטרילי בזהירות לאורך דופן הבארה, שטפו את הבארות ביסודיות והשליכו את הבאפר.

חזור על שלב זה פעמיים נוספות. לאחר מכן, למעט בבאר הראשונה, הוסף 1 mL של מצע RPI לכל שאר הבארים, שבהן ניתן יהיה לנטר רפליקציה תוך-תאית של תאי candida atory בנקודות זמן של 4, 6, 12 ו-24 שעות לאחר ההדבקה. כדי להפיק תאים תוך-תאיים לאחר שעתיים של הדבקת מקרופגים, הוסף 1 mL של sterile water לבאר. לאחר שתי דקות, גרד בעדינות את הבאר באמצעות טיפ של פיפט של 1 mL כדי להסיר את שאריות המקרופגים מהבאר.

שטפו את הבאר ואספו את הליזאט לשפופרת מקרו-צנטריפוגה. הכינו מהילה של פי מאה של ליזאט תאי microFIT ב-PBS ופזרו 100 µL על מצע YPD AGA. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 30 °C למשך יום עד יומיים וספרו את מספר היחידות יוצרות המושבות.

הכפילו מספר זה במקדם הדילול המתאים כדי לספור את מספר תאי ה-canida ator שעברו פגוציטוזה על ידי T two ומקרופאגים לאחר שעתיים של זיהום. באופן דומה, ניתן לקבוע את מספר תאי ה-canida ator התוך-תאיים בנקודות זמן שונות. ניתן לייצג זיהום לאחר ההדבקה ושכפול תוך-תאי כעלייה ב-CFUs ב-24 שעות בהשוואה ל-CFUs שהופנמו לאחר שעתיים, כפי שמוצג כאן.

תוצאות אחרות של ניסוי טיפוסי שבו המספר הכולל של תאי canida gator שהודבקו למקרופאגים של TV one הוא 6×10⁴. מספר התאים שהוחזרו לאחר 24 שעות הוא 3.76×10⁴. בכך מודגם כי תאים עוברים פגוציטוזה בקצב של 62.66% במהלך תקופת דגירה משותפת של 24 שעות.

תאי canida TER הראו שחזור פי 5.2 ככל שמספר תאי ה-e התוך-תאיים עלה מ-3.76 times 10.4 ל-1.96 times 10.5. בניסוי זה, ניתן להעריך את השחזור התוך-תאי של תאי canida TER גם באמצעות תאי E המבטאים GFP, תוך שימוש במיקרוסקופ קונפוקאלי לצורך כך. הכינו והדביקו THV ומקרופאגים ב 슬ייד בעל ארבעה תאים (four chamber slide) באמצעות הפרוטוקול שתואר קודם לכן עבור פלטת תרבית של 24 בארות.

שעתיים לאחר ההדבקה. השליכו את המצע על ידי הפיכת השקופית אל תוך מיכל פסולת והוסיפו 500 microliter PBS לכל תא בשקופית. שטפו היטב והשליכו את ה-PBS.

חזור על שלב זה פעמיים נוספות באמצעות 500 µL של 3.7% formaldehyde כדי לקבע את התאים. דגרי את השקופית בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות והסיר את ה-formaldehyde. שטוף כל באר בעזרת 500 µL PBS כדי להגמיש את המקרופאגים באמצעות 500 µL Triton X; לאחר דגירה של חמש דקות, הסר את ה-Triton X ושטוף את הבאר ב-PBS.

פרקו בזהירות את שקופית התאים (chamber slide) באמצעות שקופית להסרת תאיים ומגביה אוויר. טפטפו טיפה אחת של מדיום קיבוע vector Shield המכיל DPI על כל מגזר בשקופית, הניחו כיסוי זכוכית ואטמו את הקצוות באמצעות לק ציפורניים; הדמיעו את התאים תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי. מוצגות כאן תמונות קונפוקאליות מייצגות של מקרופאגים TP1 שהודבקו בתאי canida laboratory מסוג wild type המבטאים GFE; עלייה של כשישה מ साथियों במספר תאי ה-e התוך-תאיים בין 2 ל-24 שעות מעידה על רפליקציה של canida laboratory במקרופאגי TP one. גישת מוטגנזה של תגי חתימה (signature tag mutagenesis) נמצאת בשימוש נרחב לזיהוי גורמי וירולנציה בפתוגנים מיקרוביאליים, שבה מספר רב של מוטנטים נסרקים בו-זמנית לליקויים בצמיחה באמצעות רצף תג אוליגוניוקלאוטיד ייחודי.

כאן אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לסריקת STM של ספריית קנדה ושל ספריית מוטנטים, הכוללת את שלושת השלבים הבאים. ראשית, 96 פלסמידים, שכל אחד מהם נושא מחסנית ייחודית של רצפי אוליגונוקלאוטידים, מקובעים על ממברנת ניילון.

בשלב השני, מאגר של 96 מוטציות של *Candida albicans* נסרק לאיתור פרופילי הישרדות משתנים במקרופאגים של THP-1, ולאחריהם התאוששות של תאי שמרים מוטנטיים שגדלו ב-YPD והופנמו בתוך מקרופאגים, אשר יכונו דגימות קלט (input) ופלט (output), בהתאמה. לבסוף, תגי חתימת DNA מוגברים באמצעות PCR ומסומנים רדיואקטיבית מדגימות ה-DNA הגנומי של הקלט והפלט. תוצר ה-PCR עובר היברידיזציה לתגים ייחודיים, והאותות הרדיואקטיביים על הממברנה נמדדים ומנותחים.

להרכבת מכשיר לוח ה-96 12 dot, הניחו ממברנת ניילון רטובה מעל נייר swap wind tree לח, והדקו את ברגי היחידה. שטפו את הממברנה במים סטריליים, ולאחר מכן בביצוע שטיפה עם 0.4 mu sodium hydroxide. העבירו 200 nanogram של תמיסת PLA BDNA מהבלוק 96 12 לבארות המתאימות של ה-dot blood apptus, לאחר שטיפה ב-0.4 molar sodium Hydroxide.

הסר את הממברנה ממכשיר ה-dot blood לאחר הפרדה של שתי XXSC, תוך קישור צולב של ה-pDNA שהועבר לממברנה במכשיר UV crosslinker. הדגה את הממברנות במסייב פרה-היברידיזציה (pre-hybridization buffer) ובבקבוקי UNE של input ו-output למשך שעתיים בטמפרטורה של 42 °C. הכן גשים רדיואקטיביים באמצעות PCR תוך שימוש ב-DNA גנומי שהופק ממשקעי תאי input ו-output, ופריימרים נגד אזור השוליים ההפוך (invert flanking region) של תגים ייחודיים.

בצע דנטורציה לגששים המסומנים רדיואקטיבית ב-99 °C למשך חמש דקות והקפא אותם במהירות על קרח. העבר את הגששים לבקבוקי הקלט והפלט והדגרה למשך 14 עד 16 שעות ב-42 °C. לאחר ההיברידיזציה.

יש לשטוף את ממברנות הקלט והפלט כפי שמתואר בפרוטוקול. הוציאו את הממברנות מהבקבוקים, ייבשו אותן באוויר וחשפו אותן למסך הדמיה של זרחן. לאחר שעתיים עד שלוש שעות, סרקו את מסך הזרחן והוציאו את התמונות.

בדוגמה זו מוצגים שני מסנני ממברנה שעברו היברידיזציה, המייצגים סריקה של מאגר אחד של 96 מוטנטים של canida Gatory לבדיקת הישרדות משתנה. בבדיקת כימות מקרופאגים וקביעת היחס בין עוצמת האות של כל נקודה בממברנת הפלט (output) לממברנת הקלט (input), התגלה כי מספרי התגית 13, 26, 75 ו-85 תת-מיוצגים בפלט. נקודות אלו מוקפות בעיגול אדום ומשקפות את הצמיחה של ארבעה מוטנטים שונים.

בניגוד לכך, מוטנטים המצטברים עם הרצפים הייחודיים 11 ו-81 המודגשים בירוק נמצאים בייצוג יתר במדגמר הפלט. במילים אחרות, מתוך סריקה זו של מאגר של 96 מוטנטים, שני מוטנטים אמורים להגביר את ההישרדות בעוד שארבעה מוטנטים מראים צמיחה במקפגים. פנוטיפי הישרדות משתנים שזוהו בסריקת מאגר כזו צריכים להיות מאומתים בניסויי זיהום בודדים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפעיל מערכת פיתוסיס (in vitro) אוראלית כדי לחקור את פרופיל הצמיחה התוך-רקמתי של פתוגן פטרייתי הנמצא בענייןכם. בנוסף, תוכלו כעת לבצע סריקה רחבת היקף של מאגר מוטנטים באמצעות מערכת זו.