דור וQuantitation 3 ממדים של עורקי פצעים בעכברים באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית
26 במאי 2015
ניתוח Ex vivo של נגעים עורקיים ממודלים של בעלי חיים של מחלות לב וכלי דם מסתמך באופן קלאסי על טכניקות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיות. אלה מספקים מדידות דו-ממדיות בנגעים תלת מימדיים. כתב יד זה מתאר יצירת נגעים עורקיים לניתוח כמותי בתלת מימד באמצעות טומוגרפיה של הקרנה אופטית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש בטומוגרפיה של הקרנה אופטית להדמיה וכימות תלת מימדי של נגעים טרשת עורקים וניאו-אינטימיים בעכבר. זה מושג על ידי יצירת נגעים עורקיים בעכברים, בניתוח או על ידי האכלת תזונה עתירת כולסטרול לעכברים עם נטייה לפתח טרשת עורקים. השלב הבא הוא לבודד את עורק המטרה ולסרוק אותו באמצעות טומוגרפיה של הקרנה אופטית.
השלבים האחרונים הם ביצוע שחזור תמונה, זיהוי הנגע ומדידת נפח הנגע. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שחזורים אנטומיים של הנגע וכימות נפח הנגע והיצרות העורקים באמצעות ניתוח תמונה. הקבוצה שלנו מתעניינת בהבנת המנגנונים העומדים בבסיס היווצרות נגעים הגורמים להיצרות עורקים המובילים לסיבוכים מסכני חיים כגון התקף לב ושבץ מוחי.
יישום זה של טומוגרפיה של הקרנה אופטית פותח בקבוצה שלנו על ידי ד"ר ניקולס קירקבי, בעבודה עם ד"ר לוסי לאו, והוא יודגם על ידי ד"ר ג'ונג שי וו, שהוא מדען פוסט-דוקטורט שעובד במעבדות שלנו. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה, הוא שהיא פחות אינטנסיבית לעבודה והיא מאפשרת ניתוח תלת מימדי ולא דו מימדי. טכניקה זו לגרימת נגעים בעורק הירך שונה מאלה של R והחברה ו-Sada ושות'.
פרוטוקול הטקסט מסביר כיצד לגרום לנגעים טרשת עורקים על ידי מניפולציה תזונתית. התחל עם עכבר בן 10 עד 12 שבועות C 57 שחור במשקל של בין 25 ל -30 גרם. לאחר ההרדמה, הניחו את העכבר על כרית חמה כדי לשמור על טמפרטורת גופו ולספק איזוף פלואור ב-2% עד 3% דרך חרוט האף.
כאשר העכבר אינו מגיב לצביטה בבוהן, יש לתת בופרנורפין במינון של 0.1 מיליגרם לקילוגרם. לאחר מכן, הניחו את העכבר על גבו וגלחו את פני הגחון של הגפה האחורית השמאלית. לאחר מכן בצע חתך כדי לחשוף את שרירי הגפה האחורית העליונה בין התפצלות העורק הפופליטאלי לדופן הבטן.
בצע דיסקציה קהה כדי לבודד את עצב הירך מעורק הירך והווריד לאורך כל ההליך. שמור על הרקמות לחות עם 1% משקל בנפח לכלבים. המקום הבא קשירה זמנית של משי 6.0 Mers סביב עורק הירך והווריד קרוב לדופן הבטן ומיד מתחת לענף עם העורק הפופליטאלי.
אלה נועדו לשלוט בזרימת הדם. לאחר מכן בודד את העורק הפופליטאלי, שניים עד חמישה מילימטרים דיסטלי לענף עם עורק הירך, וקשר את העורק הפופליטאלי מתחת לעורק הפופליטאלי. הנח קשירה שנייה.
כעת, בצע חתך קטן להחדרת החוט בעורק הפופליטאלי מיד לענף עם עורק הירך. הפעל לחץ על הקשירה הזמנית הפרוקסימלית כדי למנוע דימום דרך החתך ולתוך עורק הירך לכיוון דופן הבטן. הכנס חוט G בגודל 0.014 אינץ 'בערך סנטימטר עד 1.5 סנטימטר.
השאירו אותו במקומו למשך 30 שניות ואז הסירו אותו. לאחר מכן באמצעות הקשרים מתקשרים, העורק הפופליטאלי מעל החתך. היזהר להימנע מחסימת עורק הירך.
כעת הסר את הקשרים הזמניים. סגור את הפצע בתפרי ריצה לא רציפים באמצעות 5.0 מרקל. לאחר מכן מרחו קרם EMLA.
אפשרו לבעל החיים להחזיר את ההכרה והתנועה בכלוב ההתאוששות לפני החזרתו לכלוב הביתי. הרגל צפויה להראות צליעה במשך יומיים או שלושה, אך אין זה אומר שיש לבודד את העכבר. עבור OPT, יש להמית את העכבר, לגרום להרדמה סופנית מפנטוברביטל.
לאחר מכן בצע קיבוע זלוף לב טרנס עם אקסנגינציה. כעת בודדו את עורקי הירך או את קשת אבי העורקים וענפיה. הסר כל חומר פריאלי זר בתהליך.
לאחר מכן יש לתקן את הרקמה בפורמלין ניטרלי של 10% בן לילה. למחרת או לאחסן את הרקמה ב-70% אתנול או להמשיך על ידי הטמעת העורקים באירוסים מסוננים של 1.5% LMP. הורד בעדינות את הרקמה לתוך האווירוס המותך בכ-40 מעלות צלזיוס.
חתוך את האירוס כדי ליצור צורה חרוטית. כעת יש לייבש את התכשיר הזה ב-100% מתנול למשך 12 שעות לפחות. לאחר ההתייבשות, נקה את הכלים בתערובת אחת או שתיים של אלכוהול בנזו ובנזואט.
תנו לכלים לדגור בתמיסה זו למשך 12 עד 24 שעות. למחרת, טען את הדגימה שנוקה לטומוגרפיה, אותה יש לכייל מראש. הרזולוציה נקבעת על 1024.
ב-1024 פיקסלים. הגדר את ההגדלה עבור אזור העניין. ציר Z יוגדר אוטומטית לאותה רזולוציה.
גודל הווקסל יהיה כ-200 מיקרון. לאחר מכן, באמצעות ערוץ Brightfield מקם את הדגימה כך שהיא תסתובב סביב הציר שלה במרכז שדה הראייה. השתמש בערוץ פליטת מסנן אחד של GFP, הגדר את המיקוד והתאם את החשיפה כדי למקסם את הטווח הדינמי של התמונה.
הימנע מרוויית יתר. כעת סרוק את כלי השיט ב-GFP תעלת פליטה אחת בלבד בצעדים של 0.9 מעלות. לאחר מכן יש להחזיר את הדגימות ל-100% מתנול למשך 24 שעות לפחות לפני ההטמעה בשעווה.
לניתוח היסטולוגי, פתח את התמונות שנרכשו בתוכנת n recon או בתוכנה דומה באמצעות תוכנת מציג נתונים. בדוק את איכות שחזור התמונה, שפר את איכות התמונה, התאם את עוצמת התמונה ובקש מהתוכנה לפצות על כל חוסר יישור של הדגימה מציר הסיבוב האידיאלי שלה. עבור כל סריקה, הגדר את אזור העניין האנכי המכיל את הנגע.
בכל קו סריקה 50, עקוב אחר הגבול בין המדיה למיקום הלמינה האלסטית הפנימית. לאחר מכן התוכנה יכולה לבצע אינטרפולציה של הגבול בכל הסריקות האחרות, לבדוק ידנית את האינטרפולציות הללו ולתקן אותן לפי הצורך. כעת צור ערכת תמונה בינארית עם הפיקסלים הלבנים המייצגים ניאואינטימה ופיקסלים שחורים המייצגים לומן פטנט.
זה מושג על ידי הגדרת סף האינטנסיביות. לאחר ביצוע זה, נפח האובייקט הוא נפח הנגע הכולל, והנפח הלומינלי הוא הנפח הכולל, פחות נפח האובייקט. לפיכך, מוערכת התפלגות הנגע והלומן לאורך הציר.
עורקי הירך של העכברים נקצרו 28 ימים לאחר פציעה שנגרמה על ידי חוט או קשירה. עיבוי ניאו-אינטימי ניכר בהקרנות הפליטה בשקופיות דו-ממדיות משוחזרות. ניתן היה להבחין בנגעים ניאו-אינטימיים קונצנטריים.
תמונות פליטת טומוגרפיה של הקרנה אופטית של קשת אבי העורקים השלמה מעכבר חסר APOE זיהו את הנגעים הצפויים בעקמומיות הנמוכה יותר של קשת אבי העורקים, בעורק הברכיוצפלי ובמקורות העורקים הצוואר השמאלי והתת-בריחי. אותו נגע היה מפולח והוצג באדום. כדי להדגיש את התפלגות הפלאק כאשר הם מונחים על גבי התמונה המקורית, ניתן היה להבחין בין המדיה והלומן בתמונות חתך המראות כי מדובר בנגעים אקסצנטריים.
כאן, כאשר הסריקה נעה דיסטלית לאורך ענפים אלה, הנגעים מצטמצמים בהדרגה ונעלמים תחילה בעורק התת-בריחי, לאחר מכן בצוואר, ולבסוף בעורק הברכיוצפלי. מעניין שהנגע הזה בעורק הברכיוצפלי עובר למחלק הזרימה כאשר כלי זה מתחלק לעורקים הצוואר הימני והתת-בריחי הימני. לאחר הליך OPT, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מהו הרכב הנגע?
אז לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך למדענים העובדים בתחום חקר כלי הדם לחקור את תפקידם של קולטני אנדותל, לקטינים ואנזימים מטבוליים סטרואידים בהתפתחות נגעים ניאו-אינטימיים וטרשת עורקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג ולנתח נגעים מעורקי רין באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית.
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את השימוש בטומוגרפיה של השלכה אופטית (OPT) לצורך ויזואליזציה וכימות של נגעים עורקיים בעכברים. השיטה מאפשרת ניתוח תלת-ממדי של נגעים אתרוסקלרוטיים וניואינטימליים, ומספקת תובנות לגבי המנגנונים של היצרות עורקית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מחלות קרדיווסקולריות
- טכניקות של דימות אופטי
- מודלים חייים של טרשת עורקים
רקע
- שיטות מסורתיות מתבססות על היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה.
- שיטות אלו מספקות מדידות דו-ממדיות מוגבלות.
- OPT מציעה חלופה הדורשת פחות עבודת כפיים.
- הבנת נגעים עורקיים היא קריטית לטיפול בסיכונים להתקפי לב ושברה.
מטרת המחקר
- להדמיה וכמותית של נגעים עורקיים בתלת-ממד.
- לשיפור ההבנה של מנגנוני היווצרות הנגעים.
- להדגמת טכניקה חדשנית שפותחה על ידי צוות המחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראה של נגעי עורקים בעכברים באמצעות ניתוח או תזונה עשירה בכולסטרול.
- בידוד עורקים מטרה לסריקה באמצעות OPT.
- שחזור תמונה וניתוח למדידת נפח הנגע.
- השוואה בין OPT לשיטות היסטולוגיות מסורתיות.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של נגעים אתרוסקלרוטיים בשלושה ממדים.
- ביצוע כימות של נפח הנגעים וההיצרות העורקית.
- הדגמת היתרונות של OPT על פני טכניקות קיימות.
- אספקת שחזורים אנטומיים של נגעים עורקיים.
מסקנות
- OPT הוא כלי בעל ערך לחקר נגעים עורקיים.
- הוא משפר את ההבנה של מנגנוני מחלות קרדיווסקולריות.
- הטכניקה עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טומוגרפיה של הקרנה אופטית (OPT) מאפשרת כימות תלת-ממדי של נגעים עורקיים במודלים פרה-קליניים, ובכך היא ממלאת פער קריטי במחקר של מחלות קרדיו-וסקולריות. באמצעות אספקת נתונים נפחיים המשלימים את ההיסטולוגיה, OPT משפרת את רמת הוודאות החזויה באפיון הנגעים ותומכת בהסרת סיכונים מכניסטית של מטרות טיפוליות. יכולת זו מחזקת את הרציפות התרגומית משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני, ומספקת בסיס לקבלת החלטות מותאמות סיכון בקידום תוכניות למחקר טריקוזיס והיצרות חוזרת (restenosis).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של היווצרות נגעים במודלים המושרים באופן כירורגי ובתזונתי.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות הערכה נפחית לא הרסנית של עומס נאו-אינטימלי ואתרוסקלרוטי.
- ערך חיזוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי כימות נפח הנגעים וההיצרות העורקית כנקודות קצה אובייקטיביות של יעילות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדדי נגעים כמותיים וסטנדרטיים המתאימים לפיתוח בדיקות במחקרי עיצוב מחדש של כלי דם.
- ערך תפעולי: מספק פלטי דימות ex vivo הניתנים לשחזור, המפחיתים את השונות בהשוואה לחיתוך היסטולוגי דו-ממדי.
- قابילית הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור מודלים שונים של נגעים (פגיעה באמצעות תיל, ליגציה, תזונה של עכברים חסרי apoE) לצורך הערכה עקבית של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני על ידי אספקת נתוני נגעים בתלת-ממד התואמים לניתוח היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה את ההפצה המרחבית של נגעים בענפי קשת האאורטה, ובכך תומכת במחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשרת השוואה אובייקטיבית של עומס הנגעים בין קבוצות ניסוי כדי לגבש קריטריונים להמשך או הפסקת המחקר (go/no-go).
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
OPT משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, ומספק כימות נפחי של נגעים המשלים את ההיסטולוגיה של נקודת הסיום. השיטה תומכת בבדיקת השערות בביולוגיה של כלי הדם על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של מנגנוני היווצרות נגעים במודלים רלוונטיים של עכברים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים על ידי הבחנה בין הרכבם של נגעים לבין פיזורם במודלים של עורק הירך וקשת האורטה.
- סינון: מספק פלטיים כמותיים המוכנים לבדיקה (נפח נגע, שטח הלומן) לצורך סינון מהימן של תרכובות במודלים של היצרות חוזרת (restenosis) ואתרוסקלרוזיס.
- אנליטיקה: מספק מדידות נפח וחישובים של שטח חתך המאפשרים השוואה סטטיסטית של השפעות הטיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות ניתוח מתאמי עם היסטולוגיה, ובכך משפר את התאימות של סמנים ביולוגיים לעומס הנגעים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת דימות הניתנת לשימוש חוזר עבור תוכניות גילוי קרדיו-וסקולרי הדורשות פנוטיפיה תלת-ממדית ex vivo.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בהיווצרות נגעים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של כימות נגעים בין מעבדות ואתרי מחקר.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשרות לקבלת החלטות מוקדמות יותר לגבי המשך הפרויקט (go/no-go) בהתבסס על נקודות סוף נפחיות אובייקטיביות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של טיפולים בכלי דם באמצעות הערכה מדויקת של נטל הנגעים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימוי אופטי, הבהרת רקמות ותוכנה לשחזור תלת-ממדי.
- תלוי במכשור OPT המסוגל להגיע לרזולוציה של 1024x1024 ולזיהוי ערוץ פליטת GFP.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת רקמות (קיבוע, דהידרציה, הבהרה) בין מערכות מודלים שונות.
- כולל שיקולי התאמה עבור מיטות עורקים שונות (פמורלי, קשת האורטה) וסוגי נגעים שונים (ניאו-אינטימלי, אתרוסקלרוטי).
- מוגבל ליישום ex vivo; לא ניתן לשימוש לצורך ניטור לאורך זמן in vivo.
