ניתוח התוכן של חומצות שומן והרכב בMicroalgae

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את תכולת חומצות השומן הכוללת ואת הרכבן במיקרו-אצות. הדבר מושג תחילה על ידי הכנת דגימה המכילה כמות ידועה של ביומסה של אצות שעברה ליופיליזציה. השלב השני הוא פירוק ביומסת המיקרו-אצות.

בשלב הבא, הרכיבים הליפופיליים מופקים ומבודלים. השלב הסופי הוא טרנס-אסטריפיקציה של ליפידי ה-ACell לאסטרים של מתיל חומצות שומן. לבסוף, נעזרים בכרומטוגרפיה גזית כדי לכמת את חומצות השומן.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קביעות tric, הוא ששיטה זו מדויקת מאוד ומודדת באופן ספציפי את כל החומצות השומניות ואת כל הרכיבים הליפופיליים האחרים. את הפרוצדורה תדגים NDI Afer, טכנאית מהמעבדה שלנו. לפני תחילת פרוצדורה זו, קבעו את ריכוז המשקל היבש של האצות בגרמים לליטר במצע התרבית, כפי שמפורט במקור המצוין. העבירו נפח של מצע תרבית המכיל 5 עד 10 milligrams של משקל יבש של אצות לשפופרת צנטריפוגה מזכוכית.

חשבו את הכמות המדויקת של הביומסה שהועברה באמצעות ריכוז הביומסה שנקבע קודם לכן, וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1200 Gs. השליכו חלק מהנוזל העליון (supernatant), והשאירו בערך 0.25 milliliters במבחנה. לאחר מכן, השעיו את האצות בנוזל העליון שנותר על ידי שאיבה עדינה של המשקע (pellet) מעלה ומטה באמצעות פיפטה, והעבירו את תערובת התאים למבחנת bead beater.

באמצעות פיפטה של 200 microliter, שטפו את מבחנת הצנטריפוגה ואת קצה הפיפטה עם plus or minus 0.15 milliliters של milli cube water והעבירו את הנוזל למבחנת ה-bead beater. צנטריפגו את מבחנת ה-bead beater למשך דקה אחת ב-RPM מקסימלי כדי לוודא שלא נותרו בועות אוויר בתחתית המבחנה. בסיום, לייריקו את החומר במבחנה בהתאם להנחיות הבאות.

הכינו תמיסה בריכוז של 50 milligram per liter של trip Penta Deano ביחס נפחים מחוזק של כלורופורם למתנול. באמצעות פיפט עם דחיקה חיובית (positive displacement pipette), הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת ה-tripod, no למבחנה בעלת חרוצים (beading tube). ודאו שלא נותרו חרוצים בתוך הפקק של מבחנת ה-bead beater, שכן הדבר יגרום לדליפה של חרוצי המבחנה.

הפעילו את צינור ה-beater שמונה פעמים במהירות של 2,500 RPM למשך 60 שניות בכל פעם, עם מרווח של 12 שניות בין פעולת beading אחת לשנייה. לאחר מכן, העבירו את התמיסה עם החרו지를 מצינור ה-bead beater לצינור צנטריפוגה מזכוכית נקי עמיד לחום בנפח 15 מיליליטר עם פקק הברגה הכולל רכיב טפלון. שטפו את צינור ה-bead beater עם מיליליטר אחד של תמיסת ה-tripod, והעבירו את מי השטיפה לצינור הצנטריפוגה מזכוכית.

חזור על הפעולה פעמיים נוספות. ערבב את הדגימה ב-Vortex למשך חמש שניות ולאחר מכן בצע סוניקציה למשך 10 דקות. לאחר הסוניקציה, הוסף למבחנת הצנטריפוגה 2.5 milliliters של תמיסת milli cube water ב-pH 7 המכילה 50 millimolar triss ו-one molar sodium chloride.

לאחר שהדגימה עברה ערבוב במכשיר vortex וסוניקציה פעם שנייה, סבבו אותה בצנטריפוגה למשך חמש דקות במהירות של 1200. בסיום, העבירו בזהירות את פאזת הכלורופורם התחתונה למבחנה מזכוכית נקייה באמצעות פיפטה מסוג Pasteur מזכוכית, וחזרו על תהליך המיצוי עם 1 mL של כלורופורם. בסיום, אספו את פאזת הכלורופורם באמצעות פיפטת Pasteur מזכוכית ואחדו אותה עם פראקציית הכלורופורם הראשונה.

יש לאייד את הכלורופורם באמצעות זרם של גז חנקן לקבלת הליפידים המופקים המיובשים. לאחר מכן, יש להוסיף למבחנה המכילה את הליפידים המופקים המיובשים שלושה מיליליטר של מ इथेנול המכיל 5% sulfuric acid ולסגור אותה היטב. יש לערבב את הדגימה ב-Vortex למשך חמש שניות.

דגרו את הדגימות במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 70 °C בבלוק חימום. ודאו מעת לעת שהדגימות אינן רותחות, ובצעו ערבוב במכשיר וורטקס (vortex) למבחנה לאחר כל בדיקה של הדגימות. לאחר קירור הדגימה לטמפרטורת החדר, הוסיפו למבחנה 3 mL של מים מזוקקים (milli-Q water) ו-3 mL של n-hexane, ולאחר מכן ערבבו במכשיר וורטקס.

ערבבו את הדגימה במשך 15 דקות באמצעות מסובב מבחנות. לאחר הוצאת הדגימות מהמסובב, סובבו אותן בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1200 Gs. באמצעות פיפטת זכוכית, אספו שני מיליליטרים של פאזת ההקסאן העליונה והעבירו אותה למבחנת זכוכית נקייה. כדי לשטוף את פאזת ההקסאן שנאספה, הוסיפו שני מיליליטרים של milli Q water למבחנת הזכוכית.

לאחר מכן, ערבבו את הדגימה במערבל Vortex למשך חמש שניות וסבבו אותה בצנטריפוגה למשך חמש דקות. ב-1200 Gs, העבירו את פאזת ההקסאן מהמבחנה מזכוכית לבקבוק GC באמצעות פיפטת פסטיר מזכוכית. לאחר מכן, סגרו את בקבוק ה-GC במכסה והדקו אותו כדי למנוע התאיידות של הממס.

הנח את מבחנת הדגימה במדגמן האוטומטי של מכשיר ה-GC fit. לבסוף, הרץ את הדגימה במכשיר באמצעות עמודה חדשה, תוך שימוש בספיקה כוללת של 20 milliliters per minute ונפח הזרקה של one microliter. עיין בפרוטוקול הכתוב למפרטי העמודה ולתנאי הכרומטוגרפיה.

כאן מוצג כרומטוגרמה טיפוסית המתקבלת באמצעות תהליך זה. מתילים של חומצות שומן מופרדים לפי גודלם ומידת הרוויה שלהם על ידי עמודת ה-GC, ובפרוטוקול שבו נעשה שימוש, לחומצות שומן בעלות שרשרת קצרה יותר ולחומצות שומן רוויות יותר יש זמני שהייה קצרים יותר. עמודת ה-GC והפרוטוקול ששימשו אינם נועדו להפריד בין איזומרים של חומצות שומן, אך ניתן להשיג זאת באמצעות שימוש בעמודת GC ובפרוטוקול שונים.

תכולת החומצות השומניות והרכבן של C Desus UEX 3 93 תחת תנאים של מספיק חנקן ומחסור בחנקן מוצגים כאן. תכולת החומצות השומניות הכוללת הייתה 8.6 ± 0.5% ותחת תנאי גידול של שפע בחנקן ו-44.7 ± 1.7% תחת תנאי מחסור בחנקן, בהתאמה. ערכים אלו מדגימים כי הרכב ותכולת החומצות השומניות מושפעים מאוד מרעב בחנקן.

ב-ESBL, חומצה פלמיטית וחומצה אולית הן שתי חומצות השומן השכיחות ביותר. עיינו בפרוטוקול הכתוב לפרטים על חישוב תכולת חומצות השומן והרכבן. תכולת חומצות השומן והרכבן של Odum Trico UEX 6 4 0 תחת תנאים של שפע בחנקן ותנאי חסר בחנקן מוצגים כאן.

בדומה ל-UUs אלכסוניים, תכולת חומצות השומן והרכבן מושפעות מאוד מהרעבה בחנקן. בתנאים של מספיק חנקן ובתנאי מחסור, תכולות חומצות השומן הכוללות היו 11.7 פלוס או מינוס 0.9% ו-30.5 פלוס או מינוס 1.1%, בהתאמה. P trium מייצר גם כמויות משמעותיות של חומצות שומן לא רוויות מאוד, כגון I csap ו-Penta IC acid.

בנוסף, ניתן לזהות בשיטה זו גם חומצות שומן בעלות שרשרת ארוכה מאוד, כגון ligner acid. ניתן להרחיב הליך זה על ידי הוספת שלב של הפרדת קריש ליפידים בין שלב מיצוי הליפידים לשלב התראסטריפיקציה, כדי לקבל תובנות נוספות על הרכב מחלקות הליפידים של micro LG, כפי שמתואר במקורות המופיעים בטקסט הפרוטוקול.