ניתוח התוכן של חומצות שומן והרכב בMicroalgae

שיטה לקביעת תכולת חומצות שומן והרכב באצות המבוססות על הפרעה מכאנית של תאים, מיצוי שומנים מבוסס ממס, transesterification, וכימות וזיהוי של חומצות שומן באמצעות גז כרומטוגרפיה מתוארת. תקן פנימי tripentadecanoin משמש כדי לפצות על ההפסדים האפשריים בחילוץ וtransesterification שלם.

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את תכולת חומצות השומן וההרכב הכולל במיקרו אצות. זה מושג על ידי הכנת דגימה המכילה כמות ידועה של ביומסה של אצות ליופיליות. השלב השני הוא לשבש את הביומסה של מיקרו אצות.

לאחר מכן, הרכיבים הליפופיליים מופקים ומבודדים. השלב האחרון הוא טרנס-אסטריפיקציה של שומני ACell לאסטרי מתיל של חומצות שומן. בסופו של דבר, כרומטוגרפיה של גז משמשת לכימות חומצות השומן.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו קביעת טריקים, הוא ששיטה זו מדויקת מאוד ומודדת באופן ספציפי את כל חומצות השומן וכל שאר המרכיבים הליפופיליים. הדגמת ההליך תהיה NDI Afer, טכנאי מהמעבדה שלנו לפני שתתחיל בהליך זה, קבע את ריכוז המשקל היבש של האצות בגרמים לליטר במרק התרבית כמפורט בהפניה הרשומה. העבירו נפח של מרק תרבית המכיל חמישה עד 10 מיליגרם אצות צינור צנטריפוגה מזכוכית זרדים במשקל יבש.

חשב את הכמות המדויקת של ביומסה המועברת באמצעות ריכוז הביומסה שנקבע בעבר צנטריפוגה את הדגימה למשך חמש דקות ב-1200 Gs.השלך חלק מהסופרנטנט והשאיר כ-0.25 מיליליטר בצינור. החזרה הבאה. השעו את האצות בסופרנטנט שנותר על ידי פיפטינג עדין של הכדור למעלה ולמטה, והעבירו את תערובת התאים לצינור מקצף חרוזים.

בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר יש לשטוף את צינור הצנטריפוגה וקצה הפיפטה בפלוס מינוס 0.15 מיליליטר מים מילי-קוביות ולהעביר את הנוזל לצינור מקצף החרוזים. צנטריפוגה את צינור מקצף החרוזים למשך דקה אחת בסל"ד מקסימלי כדי לוודא שלא יישארו בועות אוויר בתחתית הצינור. בסיום, ליופיליזציה של החומר בצינור לאחר מכן.

הכן תמיסה של 50 מיליגרם לליטר של טריפ פנטה דיאנו ביחס נפח מועשר של כלורופורם למתנול. בעזרת פיפטה תזוזה חיובית, הוסף מיליליטר אחד של החצובה, ללא פתרון לצינור החרוזים. בדוק שלא נותרו חרוזים בתוך המכסה של צינור מקצף החרוזים מכיוון שהדבר יגרום לדליפה של חרוז הצינורות.

מקציפים את צינור המקצף שמונה פעמים ב -2, 500 סל"ד למשך 60 שניות בכל פעם עם מרווח 122 בין כל חרוז. לאחר מכן, העבירו את התמיסה בחרוזים מצינור מקצף החרוזים לצינור צנטריפוגה מזכוכית נקי עמיד בחום של 15 מיליליטר עם מכסה בורג להכנסת טפלון. שטפו את צינור מקצף החרוזים עם מיליליטר אחד של החצובה, ללא תמיסה, והעבירו את הכביסה לצינור הצנטריפוגה מזכוכית.

חזור על הפעולה פעמיים נוספות. מערבל את הדגימה למשך חמש שניות ולאחר מכן סוניקציה למשך 10 דקות. לאחר סוניקציה ב-2.5 מיליליטר של תמיסת מים של pH של שבעה מילי-מילי-קובייה המכילה 50 מילי-מולארי, ונתרן כלורי מולארי אחד לצינור הצנטריפוגה.

לאחר שהדגימה עברה מערבולת וסוניקציה בפעם השנייה, צנטריפוגה אותה למשך חמש דקות ב-1200. בסיום, העבירו בזהירות את שלב הכלורופורם התחתון לצינור זכוכית נקי באמצעות פיפטת פסטי זכוכית, חזרו על המיצוי עם מיליליטר אחד של כלורופורם. בסיום, אוספים את שלב הכלורופורם באמצעות פיפטה אחורית מזכוכית ובריכה עם שבר הכלורופורם הראשון.

אידוי הכלורופורם באמצעות זרם גז חנקן כדי לאפשר את השומנים המופקים המיובשים. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר מתנול המכיל 5% חומצה גופרתית לצינור המכיל את השומנים המופקים המיובשים וסגור אותו היטב. מערבולת הדגימה למשך חמש שניות.

דגרו את הדגימות במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס בתנור בלוקים. ודא מעת לעת שהדגימות אינן רותחות ומערבל את הצינור לאחר כל פעם שהדגימות נבדקות. לאחר קירור הדגימה לטמפרטורת החדר בשלושה מיליליטר מים מילי-קובייה ושלושה מיליליטר של n heane לצינור לאחר ערבוב מערבולת.

מערבבים את הדגימה למשך 15 דקות בעזרת מסובב מבחנה. לאחר הוצאת הדגימות ממסובב המבחנה, צנטריפוגה אותן למשך חמש דקות ב -1200 Gs.בעזרת פיפטה מעבר זכוכית, אספו שני מיליליטר משלב ההקסאן העליון והעבירו אותו לצינור זכוכית טרי. כדי לשטוף את שלב ההקסאן שנאסף, הוסף שני מיליליטר מים מילי Q לצינור הזכוכית.

לאחר מכן מערבל את הדגימה למשך חמש שניות וצנטריפוגה אותה למשך חמש דקות. ב-1200 Gs, העבירו את שלב ההקסאן מצינור הזכוכית לבקבוקון GC באמצעות פיפטה פסטייר זכוכית. לאחר מכן הניחו מכסה על בקבוקון ה-GC והדקו אותו כדי למנוע אידוי ממס.

הנח את בקבוקון הדגימה בדגימה האוטומטית של מכשיר ה-GC fit. לבסוף, הפעל את הדגימה על המכשיר עם עמודת קריאה חדשה תוך שימוש בקצב זרימה כולל של 20 מיליליטר לדקה ונפח הזרקה של מיקרוליטר אחד. עיין בפרוטוקול הטקסט עבור מפרטי עמודות ותנאים כרומטוגרפיים?

כרומטוגרמה טיפוסית המתקבלת בתהליך זה מוצגת כאן. אסטרי מתיל של חומצות שומן מופרדים לפי גודל ומידת הרוויה על ידי עמודת ה-GC, ולפרוטוקול המשמש חומצות שומן באורך שרשרת קצר יותר ולחומצות שומן רוויות יותר יש זמני שמירה קצרים יותר. עמודת ה- GC והפרוטוקול המשומשים אינם מתכוונים להפריד איזומרים של חומצות שומן, אך ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בעמודת GC ופרוטוקול שונים.

תכולת חומצות השומן וההרכב של C Desus UEX 3 93 בתנאים מספיקים של חנקן וחסרי חנקן מוצגים כאן. תכולת חומצות השומן הכוללת הייתה 8.6 פלוס או מינוס 0.5% ו-44.7 פלוס או מינוס 1.7% בתנאי גידול מלאי חנקן ונטול חנקן בהתאמה. ערכים אלה מדגימים כי הרכב ותכולת חומצות השומן מושפעים מאוד מרעב חנקן.

ב-ESBL חומצה פלמיטית וחומצה אולאית הן שתי חומצות השומן הנפוצות ביותר. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים על חישוב תכולת חומצות השומן והרכבן? תכולת חומצות השומן וההרכב של Odum Trico UEX 6 4 0 בתנאים מספיקים של חנקן ומקופחים מוצגים כאן.

בדומה ל-UUs אלכסוניים, תכולת חומצות השומן והרכבן מושפעים מאוד מרעב חנקן. בתנאים של מספיק חנקן ומחסור, תכולת חומצות השומן הכוללת הייתה 11.7 פלוס או מינוס 0.9% ו-30.5 פלוס או מינוס 1.1% בהתאמה. P trium מייצר גם כמויות משמעותיות של חומצות שומן בלתי רוויות מאוד כגון I csap, חומצת Penta IC.

בנוסף, ניתן לזהות גם חומצות שומן ארוכות שרשרת כמו חומצת ליגנר בשיטה זו. ניתן להרחיב הליך זה על ידי הכללת שלב הפרדת קרישי שומנים בין מיצוי השומנים לשלב טרנס-אסטריפיקציה כדי לקבל תובנה נוספת לגבי הרכב מחלקת השומנים של מיקרו LG כמתואר בהפניות בטקסט הפרוטוקול.