מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הקלטות מהדק תיקון של עד 12 תאים במצב תא שלם. זה מושג על ידי סימון המיקום של כל תא מעניין והקצאת פיפטה לכל תא. השלב השני הוא לאתר את הקצה של כל פיפטה ולהזיז אוטומטית את הפיפטות ליד התאים שהוקצו להן.

לאחר מכן, התקרב לכל תא עם פיפטה אחת בכל פעם. כדי ליצור אטמים הדוקים עם קרום התא, השלב האחרון הוא לקרוע את קרום התאים ולבצע הקלטות של תאים שלמים. בסופו של דבר, הקלטת מהדק תיקון מרובה אלקטרודות בעזרת מחשב משמשת להצגת מאפייני הרשת של מעגלים עצביים קטנים ברזולוציה גבוהה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מהדק תיקון ידני הוא שמספר הקשרים שניתן לראות ברשת גדל עם ריבוע מספר הנוירונים שנרשמים. הדגמה חזותית של טכניקה זו חשובה מכיוון ששלבי מהדק התיקון יכולים להיות קשים ללימוד בגלל המורכבות והמהירות שבה יש לבצע אותם. התחילו בהליך זה על ידי הצבת פרוסת מוח עם אזור העניין במרכז טווח התזוזה של המיקרוסקופ.

לאחר מכן, זהה את התאים המעניינים. לאחר מכן שמור את מיקום התאים על סמך מערכת הקואורדינטות של המיקרוסקופ. הממשק הגרפי יציג את התאים שנבחרו כמו גם את המיקרו פיפטות לסקירה גלובלית, והתוכנה תוסיף סמן על מיקום התא שיוצב על התמונות.

בנוסף, תמונה של התא מצולמת לעיון עתידי. לאחר בחירת התאים המעניינים, הקצה את הפיפטות שישמשו להקלטת התאים הבודדים על ידי הגדרת פקדי ההקצאה בממשק הגרפי. הצג תצוגה מקדימה של התצורה הסופית באופן חזותי על-ידי בחירה בתיבת הסימון הצג מיקומים סופיים.

כעת הכינו את הפיפטות בתמיסה תוך-תאית והניחו אותן על מחזיקיהן. הנח את שלבי הראש בקיבועים שלהם, אך אל תחליק אותם קדימה. כדי להימנע מנגיעה באמבטיה עם קצה הפיפטה, הפעל את בקרת הלחץ החיובי ובחר את כל הפיפטות.

כדי להבטיח שהטיפים יישארו נקיים, החלק בעדינות כל שלב ראש למקומו. לאחר מכן, מקם את המיקרוסקופ למיקום מרכזי עם מיקוד של שני מילימטרים מעל הפרוסה על ידי לחיצה על כפתור R two תוך כדי לחיצה על כפתור A. השתמש במיקום המתאים לכל מניפולטור כפי שנשמר מהניסוי הקודם על ידי לחיצה על כפתור L two תוך כדי לחיצה על כפתור A.At נקודה זו, צריך להיות צל מובהק של הפיפטה במבט או שתנועה קטנה לאורך ציר הפיפטות אמורה להספיק להתבונן בו. פיצוי על ההבדלים הקלים בצורת הפיפטה צריך להתבצע באופן ידני.

לאחר מכן, הבא את קצה הפיפטה למיקוד. לאחר מכן הנח את הקצה על הנקודה המרכזית האדומה של תצוגת הווידאו. מבלי להזיז את המיקרוסקופ, הודע לתוכנה שהפיפטה נמצאת במרכז התצוגה על ידי לחיצה על כפתור Z תוך כדי לחיצה על כפתור C של הבקר.

לאחר איתור קצה הפיפטה הבודד, שלח את הפיפטה לאחור כך שניתן יהיה לאתר את הפיפטה הבאה על ידי לחיצה על כפתור L one תוך כדי לחיצה על כפתור a. לאחר שכל קצות הפיפטה אותרו במדויק וכל פיפטה מיוחסת לתא. מקם אוטומטית את הפיפטות קרוב לתאים שלהן על ידי לחיצה ימנית על מרכז קבוצת התאים בחלון הייצוג הגרפי ובחירת אשכול האפשרויות בתפריט המוקפץ.

בחלון אפשרויות האשכול, בחר את כל הפיפטות שברצונך למקם בשלב זה ולחץ על עבור עם הפיפטות המסומנות. חזור על הליך זה עבור כל אשכול תאים מעניין. כדי לבצע את הגישה הסופית, ציין את מיקום הפיפטות ביחס לתאים במרחק של 200 מיקרון מהתא בציר הפיפטה ו-200 מיקרון מעליו בכיוון האנכי, וזה מספיק כדי לשמור על קצה הפיפטה מחוץ לרקמה.

לאחר מכן המתן עד לסיום מיקום הפיפטות. לאחר מכן הזז את המיקרוסקופ לכיוון הפיפטה על ידי לחיצה על כפתור R אחד תוך כדי לחיצה על כפתור C.כייל מחדש כל מיקום פיפטה על ידי מיקוד המיקרוסקופ בקצהו בכל מקום בתצוגת הווידאו ולחיצה על כפתור B תוך כדי לחיצה על כפתור C.רשת מרובעת אמורה להופיע בקצרה המציינת את המיקום המזוהה של הפיפטה. אם המיקום שגוי, מקם את הקצה על הנקודה המרכזית של תצוגת הווידאו ולחץ על כפתור Z תוך כדי לחיצה ממושכת על כפתור C של הבקר.

כעת אשר כי התא המעניין עבור הפיפטה הנוכחית מסומן כהלכה, מסומן באופן פעיל. אחרת, הזז את המיקרוסקופ כך שיתאים לתא המעניין עם הנקודה האדומה המרכזית סמן את התא על ידי לחיצה על כפתור Y תוך כדי לחיצה על כפתור C.לאחר מכן לחץ על כפתור L two תוך כדי לחיצה על כפתור C.To מקם את הפיפטה במרחק של 200 מיקרון מהתא שהוקצה לו, המיקרוסקופ יעבור אוטומטית למיקום המתאים. התאימו את מיקום הפיפטה כך שתתאים לנקודה האדומה.

לאחר מכן כוונן את היסט הפיפטה על ידי לחיצה על כפתור R one. תוך כדי לחיצה ממושכת על כפתור x. הפעל את דופק הבדיקה על ידי לחיצה על כפתור L one תוך כדי לחיצה על כפתור x.

לאחר מכן, העבירו לאט את הפיפטה לתא המיוחס לה. לאחר התבוננות בהיווצרות גומה על פני קרום התא, הפעל דופק קצר של לחץ שלילי על ידי לחיצה על כפתור Y תוך כדי לחיצה על כפתור Z כדי לאפשר ללחץ המופעל להגיע לתא. יש ליצור פוטנציאל החזקה של כ-65 מילי-וולט שלילי בשלב זה על ידי לחיצה על כפתור L two תוך כדי לחיצה על כפתור x.

לאחר שנוצר אטם ג'יגה לכל תא, התחל לקרוע את הממברנות על ידי הפעלת לחץ שלילי. לאחר מכן, השתמש במערכת רכישת הגירוי כדי לבצע הקלטה. החל פולסים או רכבות של פולסים על תאים בודדים בזה אחר זה, והתבונן בתגובות התאים הנותרים כדי למפות את הקישוריות בין התאים המוקלטים הללו.

לאחר סיום ההקלטות, הסירו את הפיפטות לאט מהרקמה על ידי לחיצה ימנית על כפתור הבחירה של השולחן. בחר פיפטות נסיגה 500 מיקרון כדי שהפיפטות ייסוגו למרחק קצר לאורך ציריהן. לאחר מכן התבונן בסחף בפוטנציאל של התאים לסגת פיפטות כל הדרך חזרה.

הגדר את מהירות המיקום למהירה וחזור על אותה פעולה, אך בחר באפשרות הכל. הסר את הפיפטות המשומשות על ידי החלקה עדינה החוצה של שלבי הראש ושחרור הפיפטות מהמחזיקים. הנה דוגמה לרשתות של קשרים סינפטיים ישירים שמופו בניסויים בודדים.

שלושת דיאגרמות הקישוריות הללו הן קבוצות של 12 תאי פרמטאל שנרשמו בשכבה חמש עם מרחקים סומטיים בהתאמה. והנה דיאגרמת הקישוריות המונחת על גבי צביעה מורפולוגית של תאי פרמטאל מתועדים. נתון זה מראה את אפקט השכן הנפוץ.

עמודות כחולות מציינות את זוגות הנוירונים שמחוברים בו-זמנית לפחות לנוירון אחד אחר ברשת שנדגמה. נספח א': עלייה משמעותית בהסתברות לחיבור הדדי. כאן מראה שזוגות הנוירונים החולקים מספר שכנים משותפים מתרחשים לעתים קרובות מהצפוי במקרה ברשתות שנדגמו, הסתברות החיבור בתוך זוגות נוירונים עולה כפונקציה של מספר השכנים המשותפים המשלם.

מאפיינים אלה בתורם מולידים רשתות אשכולות עולמיות קטנות. איור זה מראה את כימות הגיוס של תאי מרטין nty. זהו ייצוג גרפי של תא פרמטאל באדום היוצר סינפסות על תא מרטין בכחול, אשר בתורו יוצר סינפסה על תא פרמטאל שני.

בשחור גירוי סף של תא הפרה-מתכת מוביל לגיוס של תא מרטין nty. באמצעות שילוב של הקלה על פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים, תא מרטין nty המגויס מעכב את התא הפרה-מתכתי השני. דיאגרמה זו מייצגת את הגירוי של מספר הולך וגדל של תאי פרמטאל מהודקים טלאי ואת ההשפעות על תא פרמטאלי אחר.

להלן הפוטנציאלים הפוסט-סינפטיים המעכבים הממוצעים שנרשמו מתא פרה-מתכתי כפונקציה של מספר תאי הפרה-מתכת הסמוכים האחרים שמעוררים. המשרעת של עיכוב סינפטי DYS במעגל מקומי נוטה לרוויה כאשר מגרים תשעה או יותר תאי פרמטאל וחלק התאים המקבלים עיכוב סינפטי של DYS עולה במהירות לאחד ככל שמספר הולך וגדל של תאי פרמטאל מגורים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על קצות הפיפטות נקיים ולמזער את עיוות הרקמות על ידי הימנעות מכלי דם ותאים אחרים בשלב הגישה.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות נוספות כגון גירוי פוטו כדי לענות על שאלות נוספות כגון חידוש תאי המהדק הטלאים על ידי סוג תא אחר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להאיץ ולבצע את הליך הידוק התיקון עבור מספר נוירונים.