Biosensors רציומטרי שלמדוד את מצב חיזור מיטוכונדריאלי וה-ATP בתאי שמרי חיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את תפקוד המיטוכונדריה בתאי שמרים חיים באמצעות שתי גרסאות חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP. חישת חמצון חיזור GFP מכיל ציסטינים חשופים על פני השטח, העוברים חמצון והפחתה הפיכים ותלויי סביבה ומשנים את ספקטרום העירור של השורה המופחתת של החלבון. ל-GFP יש עירור מקסימלי ב-470 ננומטר, בעוד של-GFP בשורה מחומצנת יש מחסור מוגבר בעירור ב-365 ננומטר.

מצב ה-redoc נמדד כפליטת RO GFP בעירור של 470 ננומטר על פליטת RO GFP בעירור של 365 ננומטר go צוות הוא בדיקת שריג שבה תת-יחידת האפסילון של סינתאז F zero F1 A TP נדחקת בין GFP תורם פריט לחלבון פלואורסצנטי כתום או קשירת OFP של TP לתת-יחידת האפסילון מביאה לאישור שינויים בחלבון שמביאים התורם והמקבל בסמיכות, מה שמאפשר העברת אנרגיה מהתורם למקבל. רמות TP נמדדות לאחר מכן כפליטת OFP בעת עירור ב-488 ננומטר על פליטת GFP בעירור ב-488 ננומטר. מתקבלות תוצאות המנטרות שינויים במצב חמצון חיזור או רמות TP המתרחשות בתנאים פיזיולוגיים.

היתרון העיקרי של שיטות אלה על פני השיטות הקיימות הוא שכביש GFP וללכת. צוות מקודד גנטית וניתן להחדיר אותו ולתחזק אותו ביציבות בתאים חיים. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש בהם למדידת מצב חמצון חיזור מיטוכונדריאלי ו-TP בתאים חיים מבלי להשפיע על כושר התאים או האברונים.

שתי הבדיקות עוקבות אחר שינויים במצב חמצון חיזור או רמות TP בתנאים פיזיולוגיים. שתי הבדיקות הן גם מדד יחס כתוצאה מכך. מדידות שבוצעו עם בדיקות אלו אינן מושפעות משינויים בריכוז החיישן הביולוגי או בתאורת הדגימה או בעובי.

שני החיישנים הביולוגיים מספקים רזולוציה ברמה של אברונים בודדים. למעשה, גרסאות RO GFP כוונו למיטוכונדריה, er, אנדוזומים ופרוקסיזומים שם הם זיהו שינויים במצב חמצון חיזור, במידה רבה ללא תלות ב-pH. שיטות אלו עשויות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים הנוגעים לבקרת איכות המיטוכונדריה וכיצד המיטוכונדריה משתנה עם הגיל.

הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון ששלבי הסף והיחס במהלך ניתוח התמונה קשים ויש לבצע אותם באמצעות הנחיות מוגדרות עקביות כדי להתחיל בהליך זה. בצע טרנספורמציה של שמרים עם חיישנים ביולוגיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. גדל תאים לשלב היומן האמצעי בחמישה מיליליטר של אמצעי נשירה מלא סלקטיבי בצינור תחתון חרוטי של 15 מיליליטר.

השתמש באותה אצווה של מדיה עבור כל הניסויים. לאחר ריכוז מיליליטר אחד של תרבית ל -20 מיקרוליטר, יש למרוח שני מיקרוליטר של התאים התלויים על שקופית ולכסות את התאים בתלוש כיסוי. לאחר מכן ממיסים כמות קטנה של VAP על מרית מתכת ומורחים לאורך שולי החלקת הכיסוי כדי לאטום.

לחלופין, ניתן להשתמש בלק שקוף להדמיית mito RO GFP one במיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה רחב. השתמש במטרה עם הצמצם המספרי הגבוה ביותר האפשרי המעבירה אור ב-365 ננומטר כגון תוכנית 100 x 1.3 NA EEC. עדשת אובייקטיבית ניאו פלואור.

הגדר את המיקרוסקופ כך שירגש ב-365 ו-470 ננומטר כדי לזהות GFP מחומצן ומופחת בשורת הכפפה בהתאמה. השתמש בנורות LED כדי לשנות את אורך גל העירור וקוביית מסנן פליטה המתאימה ל-GFP. כאשר מסנן העירור הוסר, הגדר את המצלמה בזה אחר זה לרזולוציה מרחבית אופטימלית.

לאחר מכן, הגדר את התוכנה לרכוש Zack המורכב מ-11 פרוסות עם מרווח של 0.5 מיקרומטר, ואוסף את שני הערוצים בכל מיקום Z. אתר את מישור המוקד של התאים באמצעות אור מועבר כדי למזער את ההלבנה של הגשושית הפלואורסצנטית. לאחר מכן אסוף סדרת Z בכל העומק של תא טיפוסי באמצעות גודל צעד של 0.5 מיקרומטר כדי להגדיר להדמיה.

אולי תלך קבוצה שתיים על מיקרוסקופ קונפוקלי ספקטרלי. השתמש בעדשת הצמצם המספרי הגבוהה ביותר הזמינה כאן. נעשה שימוש בעדשת דשא APO בגודל 100 x 1.49.

הגדר את המיקרוסקופ כך שירגש מיגו צוות שני ב-488 ננומטר ולאסוף פליטה מ-500 עד 520 ננומטר עבור TP חסום ומ-550 עד 580 ננומטר. עבור טפסים לא מאוגדים של TP. הערכים האופטימליים בפועל עשויים להשתנות בהתאם למאפייני מערכת ההדמיה.

הגדר את חור הסיכה ל-1.0 יחידות שטח, ולאחר מכן הגדר. סרוק זום כדי להתקרב למגבלת הדגימה של nyquist. כדי להגביר את מהירות ההדמיה, חתוך את השדה ל-512 על 256 פיקסלים.

השתמש במידת הצורך בממוצע סריקה כדי להפחית רעש. השתמש בכמה שפחות כוח לייזר תוך הפקת תמונה הניתנת לפרשנות. השתמש במד מתח פנימי או חיצוני כדי לנטר שינויים בעוצמת הלייזר המתרחשים בדרך כלל לאורך זמן בכל מערכת אופטית.

התאם את רווח הגלאי ועוצמת ההארה כדי למקסם את הטווח הדינמי. אבל הימנע מרוויה. אל תנתח תאים המכילים יותר מ- 1% פיקסלים רוויים.

אתר את מישור המוקד של תאים באמצעות אור מועבר לפני איסוף סדרת Z דרך עומק ההחזקה של תא טיפוסי באמצעות גודל צעד של 0.5 מיקרומטר תמונה של כל הדגימות באמצעות אותה סריקת כוח לייזר אובייקטיבית, גודל פיקסל זום, רווח והיסט. פתח את התמונות שנרכשו ושנה את הסוג ל-32 סיביות כדי לקבוע את הרקע. צייר אזור עניין או החזר ROI באזור שבו אין תאים.

בחר, נתח, מדוד כדי להוסיף את העוצמה הממוצעת בהחזר ROI זה לחלון התוצאות. להפחתת ערך זה מהערימה, בחרו Process math ו-Subtract. לאחר מכן הזן את עוצמת הממוצע של הרקע ובחר תצוגה מקדימה.

אוקיי וכן, סף הוא ההיבט הקשה ביותר של ההליך. כדי להבטיח הצלחה, הגדירו פרמטרי סף כך שהתמונה המתקבלת תשמור על הגודל האמיתי של העצם הפלואורסצנטי בתמונה המקורית. שימוש באותם תנאי חשיפה בדיוק עבור כל ניסוי יעזור לייצר סף עקבי לאורך עיבוד התמונה.

סף נמוך מדי יכלול פיקסלים ברקע. סף גבוה מדי יסיר חלקים מהמיטוכונדריה מהניתוח באמצעות הזאק החסר, ימצא את הפרוסה האמצעית ויבחר התאמת תמונה וסף ולאחר מכן סף את המיטוכונדריה לאחר מציאת ערך סף מתאים. לחצו על Apply כדי להחיל סף זה על כל הפרוסות בערימה.

לאחר מכן סמן הגדר פיקסלים ברקע ל-NAN או לא מספר ולחץ על אישור וכן, חזור על תהליך זה עבור התמונה השנייה. צור את היחס Z stack על ידי לחיצה על תהליך ולאחר מכן על מחשבון תמונה. חלקו את הערימה המופחתת במחסנית C המחומצנת לניתוח MIT O-R-G-F-P אחד.

אותו פרוטוקול משמש לניתוח migo AAM שתיים. במקרה כזה, חלקו את התמונה של 560 ננומטר קשורה A TP בתמונה של 510 ננומטר לא מאוגד A TP. צייר החזר ROI סביב אזור העניין.

בחר כלי ניתוח. מנהל החזר ROI ולחץ על הוסף כדי להקליט את החזר ה-ROI ואז בחר עוד רב מדידה ובסדר. לבסוף, העתק את שטח מספר הפרוסה וממוצע וייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח, השתמש בגיליון האלקטרוני כדי לחשב את זמני השטח כלומר הסכום המשוקלל והתאים הממוצעים המשוקללים המבטאים את המיטוכונדריה GFP ממוקד ושורה GFP אחד גדלים בקצב נורמלי.

קצב הגידול המרבי דומה בתאים המבטאים מיטו GFP ושורת MIT GFP אחת. יתר על כן, מיטוכונדריה ושמרים המבטאים MIT RO GF P הם צינוריים מיושרים לאורך ציר ניצני האם ומצטברים בקצות תאי האם והבת. מורפולוגיה נורמלית זו מצביעה על כך ש-MIT RO GF P אחד אינו מפריע לתפקוד המיטוכונדריה.

כדי להעריך את הטווח הדינמי של מיטג FP שלב אחד של תאי שמרים מסוג בר טופלו במי חמצן ודיהי שלושה אטול ונמדד היחס הממוצע בין מופחת למיטוכונדריה למחומצן כדי להעריך טיטרציה של מצב חמצון חיזור מיטוכונדריאלי עם מי חמצן או DTT מאפס ל -10 מילימולרית מביא לשינוי תלוי מינון. בממוצע יחס מיטוכונדריה מופחת למחומצן עם טווח נמדד מ-0.6 בתנאי חמצון ל-1.23 בתנאי הפחתה. לפיכך, מיטג FP אחד הוא חיישן ביולוגי יעיל לניתוח תאריך מחדש של המיטוכונדריה בתאים חיים.

Mito RO GFP one מציע גם רזולוציה תת-תאית של מצב חמצון חיזור מיטוכונדריאלי. רזולוציה תת-תאית זו מגלה כי מיטוכונדריה בתוך תאי שמרים בודדים נבדלים זה מזה במצב חמצון חיזור יחסי אור יכול לגרום לשינויים ב-GFP Chromo 4 עם חשיפה לשורת אור בעוצמה גבוהה של 400 ננומטר GFP אחד עובר המרת תמונה למין עם ספקטרום פליטה שונה באמצעות עירור בעוצמה נמוכה. אין המרת תמונות משמעותית במהלך התקופה המנותחת.

הדרך המועדפת להפחית את המרת התמונות היא לעורר את הצורה המחומצנת של שורה GFP ב-365 ננומטר MIGO AAM שני ממוקדים עם DNA מיטוכונדריאלי מוכתם DAPI בשמרים ונמצא במבנים צינוריים האופייניים למיטוכונדריה של שמרים מסוג בר. בנוסף, קצב הגדילה של תאים המבטאים MIGO AAM 2 דומה לזה של תאים המבטאים מיטוכונדריה GFP ממוקד הן בתקשורת הגלוקוז והן במדיה של הגליצרול. לפיכך, ביטוי של מיגו A 2 אינו נראה מזיק לתא או למיטוכונדריה כדי לבדוק אם מיגו A 2 מגיב לשינויים ברמות ה-TP המיטוכונדריאליות A התאים טופלו באנטי-מיצין A, חומר המעכב ייצור TP מיטוכונדריאלי A.

יחס הפריט החציוני יורד בתאים שטופלו באנטימיצין. מעניין לציין שהנתונים הראשוניים מצביעים על כך שייתכנו הבדלים ברמות TP במיטוכונדריה שונות בתוך אותו תא. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות.

יתר על כן, בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על פרמטרי הדמיה קבועים תוך ניטור תאים לאיתור פיצול מיטוכונדריאלי וסימנים אחרים של פוטוטוקסיות. הימנע מהלבנת אור ופתח קריטריונים עקביים לסף. ניתן להשתמש בחיישנים ביולוגיים אלה כדי לנטר שינויים מיטוכונדריאלים בפטריות צמחים חיות ובתאי יונקים.

הם יכולים לשמש גם לניטור שינויים מיטוכונדריאלים בניוון עצבי, מחלות מטבוליות ומחלות אחרות הקשורות לפגמים בתפקודי המיטוכונדריה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל להשתמש בצבעים פלואורסצנטיים מטריים ביחס ממוקד של מיטוכונדריה כדי לנטר את מצב החמצון החיזור המיטוכונדריאלי ו-TP בתאים חיים.