בידוד ללא תווית והעשרה של תאים דרך מגע dielectrophoresis

dielectrophoresis מגע (cDEP) משיג מיון והעשרה של חלקיקים באמצעות מאפייני דיאלקטרי הפנימיים שלהם. ערוצי האלקטרודה Fluidic להחליף אלקטרודות מתכתיות מסורתיות לDEP, אריג cDEP למים שאינם פוגע באפיון סטרילי ומיון של חלקיקים ביולוגיים. אנו מדגימים כיצד להכין microdevice cDEP ולערוך אפיון תא וניסויים מיון.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום לתנועה תרגומית של תאים התלויים בזרימה מונעת לחץ באמצעות אלקטרופורזה של צבע מבלי ליצור קשר עם אלקטרודות לדגימה. זה מושג על ידי השעיית התאים המעניינים תחילה במאגר מוליכות נמוכה. השלב השני הוא להעמיס את המכשיר המיקרופלואידי עם מתלה התא ולהכניס נוזל מוליך מאוד לתעלות האלקטרודות.

לאחר מכן, המכשיר המוכן מחובר לאלקטרוניקה במתח גבוה ותגובת התדר של תנועת התא נרשמת על ידי וידאו המוזן ממצלמה המחוברת למיקרוסקופ הפוך. השלב האחרון הוא ניתוח תמונות הווידיאו כדי לחזות כמותית את התכונות החשמליות של התאים. בסופו של דבר, אלקטרופורזה ללא מגע משמשת כדי להראות שניתן למיין תאים בעלי תכונות חשמליות שונות בצורה נטולת תוויות ולא מזיקה, באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים זולים ופשוטים לייצור.

לכן שיטה זו שימושית ליישומים כגון מיון תאים חיים ממתים, בידוד גידול, ייזום תאים, הפרדת תאים סרטניים על סמך שלב ובחינת ההשפעות של תרופות על תאים שונים בתכונותיהם הדיאלקטריות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, הוא שניתן למיין ולאפיין תאים על סמך התכונות הביופיזיקליות המהותיות שלהם ללא צורך בתיוג על סמך סמנים ביולוגיים וכן שניתן לשמור על סטריליות הדגימה על ידי ביטול מגע בין האלקטרודות לדגימה. ובכן, היה לנו את הרעיון הזה לראשונה כשרצינו לפתח טכניקה שנמנעת מכמה מהנושאים כמו זיהום דגימות, ייצור יקר של אלקטרוליזה, וזה קשור למכשירים אלקטרופורטיים מסורתיים.

לבידוד תאי יונקים. עקוב אחר נהלים שדווחו בעבר באמצעות פוטו-רזיסט ותחריט יונים תגובתי עמוק כדי לחרוט את עיצוב התעלה הרצוי לתוך פרוסת סיליקון, והפקיד שכבה דקה של טפלון כדי לשפר את שחרור מכשיר המיקרו מהרקיק. עטפו את הוופל בנייר אלומיניום כדי למנוע זליגה.

מערבבים פולימתיל אלאן או PDMS ביחס של 10 לאחד של אלסטומר לחומר ריפוי DGAs למשך כ-20 דקות ויוצקים על הוופל. לאחר מכן מחממים את הוופל למשך 45 דקות בחום של 100 מעלות צלזיוס כדי למנוע פגיעה בציפוי הטפלון של החותמת לאחר הקירור. הסר את נייר האלומיניום.

חתוך את ה-PDMS באמצעות להב כירורגי ונקב חורי גישה ביציאת כניסת התעלה. באמצעות אגרוף קהה המתאים לגודל הצינור כאן, נעשה שימוש באגרוף קהה של 1.5 מילימטר. לאחר מכן, נקה שקופית מיקרוסקופ זכוכית לפי ההוראות בפרוטוקול הטקסט.

נקה את מכשיר ה-PDMS באמצעות סקוטש מג'יק טייפ. בדוק במיקרוסקופ כדי לוודא שהתעלות נקיות. לאחר מכן חשוף את השקופית ומכשיר ה-PDMS לפלזמת אוויר למשך שתי דקות לחץ בחוזקה על צד הערוץ של המכשיר למגלשת הזכוכית, הימנע מהיווצרות בועות אוויר בין המכשיר למגלשה.

הכן מאגר מוליכות נמוכה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, שייקרא מאגר DEP. השעו את התאים במאגר DEP ב-3 מיליון תאים למיליליטר כאן משתמשים בתאי עכבר סרטניים, בשלב מאוחר, אפיתל פני השחלה או טחב L לאחר צביעת התאים באמצעות קרום פלואורסצנטי. צבע חדיר מודד את המוליכות של תרחיף התא

המוליכות צריכה להיות כ-100 מיקרוסימנים לסנטימטר. אם מדידת המוליכות גבוהה מדי, סובב את הדגימה כלפי מטה. החזר השהה במאגר עומק, וחזור על מדידת המוליכות.

ההיבט הקשה ביותר של פרוטוקול זה הוא הימנעות מבועות בתעלות האלקטרודות ובועות תעלת הדגימה בתעלות האלקטרודה יכולות למנוע חיבורי חורים חשמליים ובועות בתעלת הדגימה יכולות למנוע זרימה קבועה. הקפד לבצע את השלבים המודגמים כדי למנוע בועות ולהבטיח זרימה יציבה לפני טעינת השבב המיקרופלואידי C. הניחו אותו תחת ואקום למשך 30 דקות.

בינתיים, חתכו חתיכת צינור גמיש כדי לפרוש את המרחק ממשאבת המזרק לשלב המיקרוסקופ שבו ימוקם כאן השבב המיקרופלואידי. נדרש צינור באורך של שישה אינץ'. התקן את הצינור לקצה המחט במזרק.

לאחר מכן העריכו את האורך הנדרש לצינורות יציאה על ידי חלוקת נפח הדגימה שנאסף היעד בשטח החתך של הצינור. חותכים את אורך הצינור הנדרש. לאחר מכן, משוך את מתלה התאים למזרק.

בדוק שאין בועות בצינור או במזרק. עם הוצאת השבב מהוואקום, הכנס את צינור היציאה ופתח את תעלת הדגימה במהירות. כדי למנוע בועות אוויר כלואות בתעלות, הקש בעדינות על המזרק בעת ההתחלה.

כדי למנוע קרע של מחסום הבידוד הדק כדי לטשטש את תעלות האלקטרודות, הנח במהירות קצות פיפטות ריקות בשקע אחד של כל תעלת אלקטרודה נוזלית, פיפטה 200 מיקרוליטר PBS המכילה כמות קטנה של ברום B. והקש בעדינות כדי להכניס את הנוזל לקצה הנגדי של תעלת האלקטרודה. שמרו על לחץ עדין עד ש-PBS עם ברום B מתקדם באופן ניכר במעלה קצה הפיפטה הריק, חזור על הפעולה עבור כל אלקטרודה. ערוץ R דומין B משמש רק לפלואורסצנט.

דמיין את תעלות האלקטרודה הנוזלית לאחר ההתחלה. מלאו כל מאגר קצה פיפטה ב-PBS, עם R domine B.הימנע מהיווצרות בועות במאגרי קצה הפיפטה והסר כל בועה גלויה על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה. נתק את צינור היציאה והשליך כראוי.

לאחר מכן הכנס מאגר צינורות יציאה טרי. אסוף את נפח היעד. מקם את השבב על הבמה של מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה הדיגיטלית.

התקן את המזרק על משאבת המזרק והכנס את אלקטרודות החוט למאגרי תעלת האלקטרודות הנוזליות, שאבו את הנוזל במהירות של מיליליטר לשעה כדי להבטיח מגע טוב בין משאבת המזרק למזרק. בדוק ויזואלית את אורך התעלה כדי להבטיח זרימה ללא הפרעה של תאים והיעדר בועות או נזילות. לאחר מכן הפחיתו את קצב הזרימה לחמישה מיקרוליטר לשעה.

למען הבטיחות. בדוק את האלקטרוניקה על ידי הפעלת מחולל הפונקציות, מגבר מתח גבוה ואוסילוסקופ, והתאמה למתח ולתדר הרצויים. כאן פרמטרים אלה הם 200 וולט ו -20 קילו-הרץ.

לאחר אימות ביצועים מקובלים, כבה את החשמל. לאחר מכן חבר את האלקטרודות למגבר המתח הגבוה. עם השגת זרימה קבועה, הפעל את המתח הרצוי בתדר הרצוי בניסוי זה, המתח הוא 200 וולט RMS בתדרים שבין חמישה ל-60 קילו-הרץ.

הקלט את קבצי הווידאו של תגובת התא בטכניקות עיבוד תמונה כדי לכמת את התפלגות התאים בערוץ ולאפיין את תדר ההצלבה. לשם כך, שמור על מתח קבוע ושנה את התדר באופן שיטתי בתחילת הניסוי ובסיומו וכן באופן אקראי בין ריצות הניסוי. רשום את התפלגות תאי הבקרה, שהיא התפלגות התאים מבלי להפעיל שדה חשמלי כלשהו.

לאחר הגדרת תדר המתנה חדש, משך הזמן הנדרש לתאים לזרום מהכניסה למיקום המנוטר ולאחר מכן להתחיל להקליט, המשך לבצע את עיבוד התמונה לאפיון תדר ההצלבה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השהה את התערובת הרצויה במאגר DEP בריכוז כולל של 3 מיליון חלקיקים למיליליטר. כאן תערובת זו היא טחב L תאי עם ארבעה חרוזים פלואורסצנטיים מיקרומטר במאגר DEP מבצעים את השלבים שתוארו קודם לכן. כדי להכין מכשיר CEP, יש להפעיל את הניסוי בתדר בין שני תדרי ההצלבה שנקבעו של תאי המטרה וחלקיקי הרקע כך ששתי אוכלוסיות החלקיקים יחוו כוחות DEP בכיוונים מנוגדים.

כדי לאסוף את תכולת הדגימה המגוונת, הסר את צינור היציאה עם איסוף נפח היעד על ידי הנחת אצבע כפפה על פתח היציאה ומשיכה עדינה של הצינור. יוצקים את נפח היעד שנאסף למאגר להמשך ניתוח. עבור תאי סרטן יונקים, כמו רוב תאי L המשמשים כאן, DEP שלילי נצפה בחמישה קילו-הרץ ו-DEP חיובי חזק.

בקוטר של 60 קילו-הרץ לתאי MOS L יש קוטר של 17.7 פלוס מינוס 3.3 מיקרומטר, ולחרוזים יש קוטר נומינלי של ארבעה מיקרומטר. בנוסף לקביעת תדירות ההצלבה של תאים, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי למיין תערובת המומחשת כאן על ידי תערובת של תאי MO'S L וחרוזים. דוגמה זו מנצלת את הדיאלקטרופורזה השלילית המוצגת על ידי ארבעה חרוזי מיקרומטר בתדרים שבהם תאי MO'S L חווים דיאלקטרופורזה חיובית.

כאשר המכשיר הופעל ב-200 וולט RMS ו-10 קילו-הרץ, שני התאים המוצגים כאן בירוק והחרוזים המוצגים כאן באדום היו מעורבים מכיוון שהם חוו DEP שלילי ב-50 קילו-הרץ. נצפתה תנועה של תאי MOS L לראש התעלה בעוד שהחרוזים הוגבלו לחלק התחתון של התעלה, מה שאפשר הפרדת התערובת לשני רכיבים. אז בעקבות הליך זה, ניתן לבצע טכניקות אחרות במורד הזרם, כגון תרבית תאים והדמיה אימונופלואורסצנטית או בדיקות ביוכימיות כדי לענות על שאלות נוספות כגון כיצד התכונות הדיאלקטריות מתואמות למאפיינים הפיזיקליים של התאים.

אז לאחר פיתוחה, הטכניקה הזו באמת סללה את הדרך לביולוגים לחקור כיצד ניתן לתאם שינויים המושרים על ידי מטבוליט בשלד התא לתכונות הדיאלקטריות שלהם באמצעות מודל סרטן השחלות של עכבר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעשיר ולמיין תאים באמצעות אלקטרופורזה ללא מגע.