מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח חלבונים שלמים הגדולים מ-100 קילודלטון בצורה רגישה על ידי ספקטרומטריית מסה מאלדי. זה מושג על ידי הכנת פתרונות המטריצה. השלב השני הוא להפקיד את תמיסת השכבה הדקה על המטרה.

לאחר מכן, הדגימה ותערובת המטריצות מופקדות על המטרה. השלב האחרון הוא התבוננות בכתמי הדגימה מתחת למיקרוסקופ. בסופו של דבר, ספקטרומטר רב למסה משמש לניתוח חלבונים שלמים ולתיעוד ספקטרום מסה.

היתרון העיקרי של ספקטרומטריית מסה מאלדי על פני גישות אנליטיות אחרות, כגון יינון ריסוס אלקטרו, הוא בכך שהוא סובלני יותר למלח, מזהמים וחומרי ניקוי. יתרון נוסף של מאלדי הוא שהוא מייצר יונים הנושאים פחות מטענים בהשוואה לתרסיס אלקטרו. לכן, רכישה ופרשנות של נתוני MDI היא די פשוטה.

כדי להתחיל את התגבשות ה-rech, שפכו 10 מיליליטר של 40% אתנול ב-Pyrex que. ואז ב 600 מיליגרם של מטריצה באמצעות אמבט מים ותנור התנגדות. מחממים את תמיסת המטריצה ומערבבים אותה עד להמסה מלאה של המטריקס

חזור על השלבים הקודמים עד שהפתרון רווי. הניחו לתמיסה להתקרר לאט בטמפרטורת החדר במשך מספר שעות, ולאחר מכן אחסנו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. אם לא נוצרים גבישים, גרדו את החלק הפנימי של הכוס ממש מתחת לפני השטח של התמיסה, באמצעות מוט זכוכית כדי לגרום להתגבשות.

לבסוף, אסוף את גבישי המטריצה על ידי סינון. שוטפים את הגבישים שנותרו בבקבוק בכמות מינימלית של ממס קר כקרח ומסננים אותם. לאחר השלמת הסינון, הניחו לגבישים להתייבש כדי לנקות את לוחית המטרה של מאלדי.

שוטפים אותו עם מתנול ומנגבים אותו בעדינות עם מגבון קים. לאחר מכן שטפו אותו במים ונגבו אותו במגבון קים. הכנס את יעד המלדי בכוס של 600 מיליליטר וכסה אותו באתנול של 50%.

לאחר מכן, סוניקציה של המטרה בתמיסת האתנול למשך 10 דקות באמבט קולי. אם נותרו שאריות על הצלחת, חזור על השלבים הקודמים. שטפו את המטרה במתנול או במים שהממס השתמש בו, קובע כמה הדגימה מתפשטת.

לאחר מכן הטה את המטרה כך שכל הנוזל ייאסף על מגבון קים. יבש את המטרה באמצעות זרימת גז חנקן. בשלב הבא, ממיסים אלפא CHCA באצטון.

על מנת ליצור תמיסה רוויה, טבלו קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר בתמיסה הרוויה אלפא CHCA כך שכמות קטנה מהתמיסה תזרום בקצה. גע במטרה המאלדי במהירות עם קצה הפיפטה כדי להפקיד את תמיסת האלפא CHCA על המטרה המלדי באמצעות צינור פלסטיק של 1.5 מיליליטר. הכן תמיסת אלפא CHCA של 20 מיליגרם למיליליטר על ידי המסת אלפא CHCA ביחס של שבעה עד שלושה נפחים של אצטוניטריל לחומצה פורמית 5%, המסומנת כתמיסת אלפא CHCA.

לאחר מכן, הכינו תמיסת DHB של 20 מיליגרם למיליליטר על ידי המסת DHB ביחס של שבעה עד שלושה נפחים של אצטיל ניטריל לחומצה אצטית של 0.1% טרי פלואורו, המסומנת כתמיסת DHB. מערבבים את תמיסת אלפא CHCA ותמיסת DHB ביחס נפח של אחד לאחד. כדי להשיג את תמיסת C-H-C-A-D-H-B לפני תחילת הליך זה, שלב אופציונלי הוא טיהור דגימות החלבון על ידי חילופי חיץ המוצגים בהפניה המפורטת.

אחרת, הפקידו דגימת חלבון לא מטוהרת על יעד MALDI. לאחר מכן, הפקידו 0.5 מיקרוליטר מדגימת החלבון על השכבה הדקה המוכנה של אלפא CHCA. מיד לאחר מכן, הוסף 0.5 מיקרוליטר מתמיסת C-H-C-A-D-H-B.

הפקידו 0.5 מיקרוליטר מתקן קין על צלחת MALDI, ולאחר מכן הוסיפו 0.5 מיקרוליטר מתמיסת המטריצה. לאחר ייבוש הדגימות והקין, ניתן לצפות בכתמים תחת מיקרוסקופ, להכניס את המטרה למכשיר ולבחור את מערך המכשיר המתאים. לאחר מכן בחר את טווח יחס המסה לטעינה המתאים.

רכוש את הספקטרום של ה-ca וכיול את המכשיר באמצעות עוצמת הלייזר המתאימה. רכוש את הספקטרום של דגימות החלבון. ניתוח MALDI toff של אזור הכרומוזום השלם תחזוקה חלבון אחד מוצג כאן.

תערובת C-H-C-A-D-H-B הניבה ספקטרום מסה באיכות גבוהה יותר מבחינת יחס אות לרעש ורגישות. בפרט, ניתן היה לזהות 0.5 פיקומולים של חלבון שהופקדו על מטרת MALDI, בעוד שאותה כמות של חלבון בקושי הייתה ניתנת לזיהוי באמצעות חומצת SINO NIC המשתמשת בתערובת C-H-C-A-D-H-B, נצפו יונים טעונים כפולים של החלבון, מה שמאפשר את קביעת המסה בדיוק גבוה יותר מכיוון שרזולוציית השיא עומדת ביחס הפוך ליחס המטען הראשי במקרה של מכשיר מולטי טוף צירי. יתר על כן, באמצעות תערובת C-H-C-A-D-H-B, שיטת הבחירה שלנו לתצהיר המטריצה הייתה גישת השכבה הדקה.

בשיטת הטיפות המיובשות לא זוהו חלבונים בעלי מסה גבוהה מ-100 קילודלטון. חלבון הבטא המונומרי לאסוף aase נותח גם על ידי multi TOF. ספקטרום C-H-C-A-D-H-B היה טוב יותר מספקטרום חומצות SINO NIC מבחינת רגישות ורזולוציה.

יתר על כן, נוכחותם של יונים טעונים מוכפלים אפשרה אישור של מסת החלבון בדיוק גבוה יותר. MALDI לניתוח של אימונוגלובולין שלם מוצג כאן. הספקטרום שהתקבל באמצעות תערובת C-H-C-A-D-H-B היה הרבה יותר אינטנסיבי מספקטרום SA ואלפא CHCA.

ליתר דיוק, אותות החלבון היו גבוהים יותר והיו בעלי רזולוציה טובה יותר בספקטרום C-H-C-A-D-H-B. השימוש בתערובת C-H-C-A-D-H-B ובשיטת שקיעת השכבה הדקה הראה שיפורים משמעותיים באיכות החלבון השלם הגדול. Mass Spectra נרכש באמצעות MALDI למכשיר.

הפרוטוקול המוצג ממחיש כיצד לרכוש ספקטרום מסה באיכות גבוהה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה באמצעות רב מכשירים. בזמן שאתה מבצע ניתוח מסוג זה, שלושה דברים חשובים. ראשית, להשתמש בפתרון מדדים טרי שהוכן מראש.

שנית, להפקיד כראוי את הדגימה שלך ביעד מאלי. ושלישית, להשתמש בהגדרה האינסטרומנטלית המתאימה כמו עוצמת לייזר.