גישות גנטיות בקדימה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע אנליזה גנטית של chlamydia tritus באמצעות ביצוע מוטגנזה כימית וקביעת קשרים בין הגנוטיפ לפנוטיפ. זאת מושג תחילה על ידי יצירת זני מוטנטים של chlamydia tracom באמצעות מוטגנזה כימית. לאחר מכן, כל המוטציות שנוצרו באופן כימי מזוהות באמצעות ריצוף גנומי מלא, ולאחריו הרכבת הגנום בהנחיית רצף ייחוס.

לאחר מכן, מזוהים הקשרים בין הפנוטיפ לגנוטיפ בזני המוטנטים. לבסוף, הקשרים בין הפנוטיפ לגנוטיפ מאומתים על ידי יצירת זנים רקומביננטיים וניתוחם. בסופו של דבר, ניתן להגיע לתוצאות המראות כי מוטציה בגן מסוים של החלאמידיה מובילה לפנוטיפ הרלוונטי, וזאת באמצעות שילוב של גישות קלאסיות של מוטגנזה כימית וטכנולוגיית רצף דור הבא.

נכון לעת זו, לא קיימות שיטות זמינות להחלפת גנים בחламиדיה, והכלים הגנטיים-מולקולריים למחקרה נמצאים בשלביהם הראשוניים. שיטה זו אינה דורשת טרנספורמציה עם DNA רקומביננטי או פיתוח של כלים גנטיים-מולקולריים, אך היא משיגה את אותה המטרה: שיוך פונקציה לתוצרי גנים בודדים.

להכנת תאים בתרבית, זרעו כ-1 × 10⁶ תאי vir לכל 25 סנטימטרים רבועיים בשלושה מיליליטר של DMEM מועשר ב-10% FBS והדגירו ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני. כאשר התאים יגיעו למצב של התמזגות (confluency) כ-24 שעות לאחר מכן, שאבו את המצע והדביקו את התאים ב-chlamydia בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) של חמישה. בנפח כולל של שלושה מיליליטר של D-M-E-M-F-B-S המכיל 200 ננוגרם למיליליטר של cycloheximide. כדי להתחיל את המוטגנזה ב-18 שעות לאחר ההדבקה, הכינו תחת מꗪ כימי 20 מיליגרם למיליליטר של ethyl methane sulfonate או EMS ב-PBS עם calcium chloride ו-magnesium chloride.

EMS הוא מוטגני וקרצינוגן חזק. לכן, יש לעיין בפרוטוקול הכתוב לגבי סילוקו. שאבו את המצע מתאי ה-Vero ושטפו אותם פעם אחת עם שלושה מיליליטר של PBS עם מגנזיום כלוריד וסידן כלוריד.

לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של תמיסת EMS והדגירו למשך שעה אחת במכסה המנוע בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, הסירו את ה-EMS והעבירו את הדגימה למכל המכיל נתרן הידרוקסיד בריכוז מולארי אחד כדי לנטרל את המוטגן, לפני שטיפת התאים שלוש פעמים להסרת שאריות EMS. לאחר מכן, הוסיפו שישה מיליליטר של DMEM 10%FBS עם 200 ננוגרם למילליטר של cyclo heide ו-25 מיקרוגרם למילליטר של Gentamycin, והדגירו ב-37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 48 עד 72 שעות.

ההכלילים נראים נטולי חיידקים כ-36 שעות לאחר מוטגנזה ב-72 שעות. כ-10% מההכלילים מלאים בחיידקים בעוד שהשאר נותרים ריקים. כדי להפיק גופי תאי ראשוניים (elementary bodies או EBS) באמצעות ליזיס היפוטוני, שאבו את המצע לחלוטין. הוסיפו מיליליטר אחד של מים וניעו למשך 10 דקות כדי לשחרר את התאים, ובצעו ליזיס לתאים על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים.

לאחר איסוף הליזט לשפרועת מיקרו-צנטריפוגה, הוסף 0.25 מיליליטר של בופר סוכרוז, פוספט גלוטמט בריכוז 5x (או SPG) כדי להגיע לריכוז סופי של 1x, ואחסן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. הכן שכבות מונו-שכבתיות צפופות של תאי VES בלוחות בעלי 6 בארות על ידי זריעה של כ-0.4 × 10⁶ תאים ב-3 מיליליטר של DMEM עם 10% FBS לכל בארה; אפשר לתאים להוות מונו-שכבה הומוגנית במהלך 24 השעות הבאות. לאחר מכן, הנח על קרח תמיסת מלאי של מוטגן חламиדיה.

לאחר מכן, הכינו שש מבחנות של דילול סדרתי בעשרה שניות, בנפח כולל של 200 µL לכל דילול ב-DMEM 10%FBS, והניחו אותן על קרח. השתמשו ב-3 mL של PBS לכל באר כדי לשטוף את תאי ה-Vero פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו 3 mL של DMEM לכל באר בלוחות של שש בארות, ו-100 µL של הדילול הבקטריאלי בשכפול.

סובב את הצלחת כדי להבטיח ערבוב אחיד. סובב את הצלחות המודבקות ב-2,700 GS למשך 30 דקות ב-15 °C. לאחר מכן, דגור אותן ב-37 °C באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide למשך שעה עד שעתיים.

בינתיים, הכינו 0.54%AROS ב-DMEM על ידי שילוב הרכיבים הבאים וערבובם. לאחר מכן, ערבבו פנימה 18.9 milliliters של 1.2%aros סטרילי וחם במים, תוך כדי ערבוב למניעת גושים. שמרו את התמיסה חמה במקלח מים בטמפרטורה של 55 degrees Celsius.

שאבו את תרחיף החיידקים מהצלחות והוסיפו שישה מיליליטר של תמיסת aro חמימה. המתינו להתמצקות מלאה בטמפרטורת החדר מחוץ למנדף. לאחר מכן, במנדף הביולוגי כאשר המכסים הוסרו, ייבשו את הצלחות למשך 15 דקות נוספות. כאשר הצלחות התייבשו, דגרו אותן בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור פחמן דו-חמצני למשך שבעה עד 10 ימים.

פלאקים צריכים להיות נראים בעזרת מיקרוסקופ דיססקציה יום אחד לפני בידוד המוטנטים. זריעה של 1×10⁴ תאים ב-100 µL לכל באר. בלוחית 96 בארות, התאים יגיעו למצב של התמזגות (confluency) תוך 24 שעות.

תחת מיקרוסקופ דיסקציה, סמנו את הפlaques המיועדים לבחירה ולאחר מכן השתמשו בפיפט עם טיפ מסנן בנפח מיליליטר אחד סטרילי כדי לאסוף רבדים של plaques. השביו את ה-plaques ב-100 µL של DMEM מועשר ב-10% FBS, 400 ng/mL cyclo, heide, ו-50 µg/mL Gentamicin כדי להרחיב את זני המוטנטים, והעבירו את התרחיף כשכבה מעל מונו-שכבות סמיכות (confluent monolayers) של תאי Vero.

סובבו את הפלטות ב-2,700 GS ובטמפרטורה של 15 degrees Celsius למשך 30 דקות לפני דגירת קציר dbs כאשר יותר מ-50% מהתאים נגועים, דבר שיכול להתרחש כבר 48 שעות לאחר ההדבקה ועד 14 ימים. כמות זו של תאים נגועים מאפשרת לאחסן מספיק חיידקים חיים כדי להפיק EVs על ידי ליסיס היפוטוני של תאים נגועים. לאחר שאיבת המצע, הוסיפו 160 microliters של מים סטריליים ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

השתמשו בטיפים עם מסנן (barrier tips) כדי לפרק את התאים באמצעות פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים, כדי להבטיח ליזיס מלא. לבסוף, העבירו 160 µL מכל ליזאט למבחנות צנטריפוגה (micro fuge tubes). הוסיפו 40 µL של XSPG בריכוז fiveX ואחסנו בטמפרטורה של 80- °C עד לביצוע הבדיקה וסריקת המוטנטים לפנוטיפים רלוונטיים.

חשיפה למוטגן מובילה להיווצרות של כוללות (inclusions) שנראות נטולות חיידקים, ככל הנראה עקב מוות של תאי החיידקים. בדרך כלל, serovar LGVL two ימיס לחלוטין תאים נגועים תוך 48 שעות לאחר ההדבקה, אך טיפול במוטגנים יכול להאריך מחזור זה ליותר מ-90 שעות, ובניסויים שלנו צפויות כ-10% מהכוללות להתאושש. תאי Vero נגועים שטופלו ב-20 mg/mL של EMS הובילו לירידה של 99% בהתאוששות של צאצאים זיהומיים בהשוואה לבקרות שלא טופלו, כפי שניתן לראות בדמות זו.

טיפול במוטגנים הוביל גם להופעת פלאקים בעלי מורפולוגיות משתנות, כולל פלאקים קטנים. מורפולוגיות נוספות כוללות פלאקים הנראים גרנולריים, גושיים, או בעלי מבנה של חלת דבש, כפי שמוצג כאן. המינונים של EMS שנעשה בהם שימוש במחקרים אלו יכולים להוביל לשלוש עד 30 מוטציות לכל גנום של KCL, כפי שהוערך ניסויית באמצעות NGS.

אף על פי ש-EBS שטוהרו במדרג הם במידה רבה נקיים מחומרים של תאי המאכסן, DNA של המאכסן עדיין מזוהה ומהווה כ-10 עד 15% מההכנות הגנומיות לאחר הליך זה. ניתן לבצע סריקות לפנוטיפים כגון רפליקציה לקויה בתרביות תאים, אובדן של פעילויות ביוכימיות או שינוי במורפולוגיות חיידקיות, במטרה לענות על שאלות נוספות כמו אילו גורמים חיידקיים נדרשים ליצירה ולשמירה של גורמי פתוגניות של chlamydia.