מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את הטרנספורט של מערכת להובלת תרופות או של הסוכן הטיפולי. היא מעבירה אותם דרך מחסום תאי, כגון מודל של אפיתלליום הגסטרו-אינטסטינלי הרלוונטי להובלת תרופות דרך הפה. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול של תאי caco two על תבניות transwell כדי לאפשר התמיינות של התאים ויצירה של שכבת מונולייר תאית.

השלב השני הוא תיקוף העובדה שדגם זה מייצג מחסום חדירות, וזאת על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתלית (TEER), צביעה אימונולוגית של צומתים תאיים, והערכת חדירות פסיבית של מולקולת סמן גלויה. השלב הבא הוא הכנת מערכת הובלת התרופה; בדוגמה זו נעשה שימוש בננו-נשאי פולימרים ממוקדים. הנשאים עשויים להכיל מטען של תרופה או לא, ויש לכלול בקרות כגון נשאיים שאינם ממוקדים או תרופה חופשית.

רכיבים אלו מסומנים באיזוטופים רדיואקטיביים כדי לאפשר את גילוים. לאחר האינקובציה, מוסיפים את הנשאים לתא האפיקלי שמעל לשכבת התאים החד-שכבתית. בנקודות זמן שונות, אוספים את הנשאים מהתא האפיקלי, מהתא הבסולטרלי ומשכבת התאים, ובודקים אם חל פירוק של הרכיב המסומן.

בסוף, מחשבים את ההובלה של הננו-נשאיים דרך השכבה התאית החד-שכבתית, כדי לחקור את מנגנון ההובלה. יש לבצע ניסויים דומים בנוכחות של מעכבים פרמקולוגיים של טרנסציטוזה דרך תאים, או באמצעות סמני הובלה פארא-צלולרית בין תאים. הטכניקה המתוארת כאן היא התאמה של שיטות מבוססות המשמשות להערכת קצב ומנגנון ההובלה של תרופות ונשאי תרופות ננומטריים דרך שכבות תאים חד-שכבתיות בתרבית, המייצגות מחסומים תאיים בגוף.

אף על פי שהדוגמה עליה התמקדנו כאן מתקפת הובלה של ננו-חלקיקי פולימר ממוקדים דרך מודל של אפיתליום גסטרו-אינטסטינלי, ניתן להחיל שיטות דומות גם כדי לבחון מעבר של מערכות שונות להובלת תרופות דרך שכבות תאים אלו או שכבות תאים אחרות, כגון תאים אנדותליאליים המהווים בדרך כלל מחסום בין זרם הדם לרקמות ואיברים. לדוגמה, במקרה של מחסום דם-מוח. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקושי בשל מורכבות הבחירה של סמנים למעקב מדויק אחר מערכות הובלת תרופות במחקרים אלו, במיוחד אם הן מובלות דרך תאים בכמויות קטנות.

בהקשר זה, נשתמש ברדיואיזוטופים כדי לסמן מערכות להובלת תרופות במחקריהם; סוגיה מרכזית נוספת היא תיקוף של שלמות מחסום התאים של המודל ושימוש בביקורות מתאימות כדי לאשש זאת לאורך הניסויים. נוהל זה מבוצע בתוך מנדף תרבית תאים סטרילי ברמת בטיחות ביולוגית 2 (biosafety level two), וכל החומרים הנכנסים למנדף חייבים להיות מקומים באתנול; באמצעות פינצטה, מקמו רשמים של Transwell העשויים Polyethylene terephthalate עם נקביים של 0.8 µm לתוך פלטה בעלת 24 בארות כדי להשיג תוצאות בעלות מובהקות סטטיסטית.

כל תנאי ניסויי דורש ארבע חזרות לפחות. דללו תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי או תאי caco two במצע תאים שהוכן מראש. העבירו 200 עד 400 µL מתמיס התאים לתא העליון או לאפﺇקס (apical chamber) של ה-transwell.

השתילו בצפיפות של 1.5 times 10 to the five תאים לסנטימטר רבוע. מלאו את התא התחתון או הבזולטרלי ב-700 עד 900 µL של מצע תרבית תאים. דגרו את התאים ב-37 °C, 5% CO2 ו-95% לחות למשך 16 עד 21 ימים, והחליפו את המצע בתאים העליונים והתחתונים מדי שלושה עד ארבעה ימים.

החליפו את המצע בסדר הבא כדי לשמור על הלחץ מעל שכבת התאים המונו-שכבתית: שאבו את המצע מהתא התחתון, ולאחר מכן שאבו את המצע מהתא העליון. מלאו את התא העליון ב-200 עד 400 µL של מצע טרי ומלאו את התא התחתון ב-700 עד 900 µL של מצע טרי כדי לתקף את מחסום החדירות האפיתליאלי באמצעות TEER. כוונו את הוולט-אומיטר להגדרת התנגדות והניחו אנכית את האלקטרודות בבאר המכילה את תבנית ה-transwell.

האלקטרודה הקצרה צריכה להיות בתא העליון והאלקטרודה הארוכה בתא התחתון, כאשר היא נוגעת בתחתית הבאר. לאחר שקריאת הוולטומטר תתייצב, רשמו את ערך ההתנגדות באוהמים עבור כל באר. חזרו על המדידות מדי יום אחד עד יומיים עד שערכי ה-TEER יעלו למקסימום ויגיעו לרמה קבועה (plateau), דבר המעיד על היווצרות מחסום חדירות, תהליך שארך בדרך כלל שבועיים עד שלושה שבועות מרגע זריעת התאים.

כדי לאמת את נוכחותם של צמתים הדוקים (tight junctions) בשכבות תאים חד-שכבתיות עם רמה גבוהה תחילה, קבע את התאים, שאב את המצע משני התאים ושטוף את התאים שלוש פעמים ב-DMEM חם, ואז הדגר עם 2% paraform aldehyde קר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, הסר את ה-paraform aldehyde ושטוף את התאים שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן, הוסף מיקרוגרם אחד למיליליטר anti occludin לכל אחד.

נשתמש בבארים עם קרע נמוך כביקורת שלילית ליצירת מחסום. הדגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, שטפו שוב את התאים ב-PBS ולאחר מכן הוסיפו לכל באר נוגדנים שניים מסומנים בריכוז של 7.5 micrograms per milliliter. הדגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחשכה. לבסוף, שטפו את התאים ב-PBS וגזרו בזהירות את ממברנת המסנן שעליה מודבקת השכבה החד-שכבתית המקובעת; הרכיבו אותן על שקף לצורך דימות באמצעות מיקרוסקופיית epi, פלורסצנציה או קונפוקלית.

הליך זה מתחיל בסימון הנוגדן המכוון באמצעות יוד-125 ובחישוב הפעילות הספציפית של הנוגדן המסומן ביחידות של ספירות לדקה למיקרוגרם, תוך שימוש בפרוטוקולים שפורסמו בעבר. בדוגמה זו, הנוגדן המכוון הוא נוגדן מונוקלונלי של עכבר נגד מולקולת היצמדות בין-תאית אנושית 1, או anti-ICAM-1, לצורך בקרת ספציפיות. IgG של עכבר המסומן ביוד-125 ישמש להכנת נשאים ננומטריים מצופים שאינם מכוונים, במטרה לחקור את ההובלה של מטען טיפולי.

המטען מסומן גם ביוד 1 25. בדוגמה זו, המטען הוא alpha galacto SASE או Alpha G, אנזים טיפולי המשמש לטיפול במחלת פברי, הפרעה גנטית של אגירה ליזוזומלית. אחד ההיבטים הקשים ביותר של פרוצדורה זו הוא הבטחת גילוי הולם של החומרים המועברים.

כדי להבטיח הצלחה, יש לסמן את רכיבי הננו-נשא (nanocar) בכמות מספיקה של איזוטופים בעדיפות סגולית גבוהה. השלב הבא הוא שזירה של ה-anti ICAM המסומן אל פני השטח של נשאי הננו. במקרה זה, אנו פשוט מערבבים את ה-anti ICAM המסומן ביוד 1 25 עם ננו-חרוזי פוליסטירן בקוטר 100 ננומטר כמודל לבקרת בקרה לא-ספציפית.

השתמש ב-IgG המסומן ב-iodine 1 25, וכדי לעקוב אחר הובלת המטען, השתמש בשילוב של anti ICAM ו-Alpha G המסומן ב-iodine 1 25. דגרי את התערובות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ספיחה לפני השטח; לאחר שעה, סבב במערך צנטריפוגה ב-13, 000 GS למשך שלוש דקות, ולאחר מכן הסר את הרכיבים שאינם מצופים מהעלייה באמצעות פיפטת שאיבה כדי להשעות את המשקע המכיל ננו-נשאים מצופים ב-1% Bovine serum albumin ב-PBS. לאחר מכן, בצע סוניקציה בעוצמה נמוכה כדי לפרק צברים פוטנציאליים של חלקיקים. הוסף ננו-נשאים של iodine 1 25 anti ICAM לתא העליון מעל שכבות Einconfluent של caco two עם tier גבוה. חזור על הפרוצדורה עבור הרכיבים הטיפוליים והבלתי ספציפיים לאחר מדידת ה-tear.

דגרו ב-37 °C למשך פרק זמן אחד או יותר לפי הרצוי. מדדו שוב את הדליפה לאחר הדגירה. מדידות הדליפה נועדו להערכת השפעות הנשאים הננומטריים על מחסום החדירות.

אספו את המצע מהתאים העליון והתחתון. שטפו את התא העליון עם 0.5 milliliters של DMEM בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ואת התא התחתון עם 1 milliliter של מים דה-יוניים. אספו את מי השטיפה למדידת תכולת הרדיו-איזוטופים הכוללת באמצעות מונה גמא למדידת פראקציית התאים.

הוצא את המסנן החדיר באמצעות להב תער על ידי חיתוך מסביב לקצוות. הדגר אותו במבחנה של מונה גמא עם 1%Triton X 100 למשך 10 דקות לשחרור תכני התאים, לפני מדידת רדיואקטיביות כוללת הקשורה לתאים, כדי למדוד iodine 1 25 ששוחרר מנשאי ננו במהלך ההובלה או עקב דגרדציה פוטנציאלית. ראשית, ערבב 300 µL מכל דגימה עם 700 µL של 3%BSA ב-PBS ו-200 µL של חומצה טריכלוראצטית או TCA; הדגר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

במהלך דגירה זו של 15 דקות, מדדו את הרדיאו-אקטיביות הכוללת של הדגימות במונה גמא. צנטריפוגו את דגימות ה-TCA ב-3000 GS למשך חמש דקות כדי להפריד את החלבון השלם מהחלבון המעובד או מחלקon ה-iodine 1 25. כמתו את הרדיאו-אקטיביות של חלקon ה-iodine 1 25 החופשי והפחיתו ערך זה מהרדיאו-אקטיביות הכוללת שנמדדה לפני הצנטריפוגה. פעולה זו תספק את כמות החלבון המסומן לעומת חלקon הרדיוטרייסר שהסיר ממנו. להערכת מעבר פארא-צלולרי באמצעות דליפה פארא-צלולרית של אלבומין, תרבתו מונו-שכבות של KCO two על מinserts של transwell כפי שהודגם קודם לכן; לתא העליון, מעל מונו-שכבת התאים, הוסיפו או אלבומין מסומן ב-iodine 1 25 לבדו כביקורת שלילית המראה את רמת הדליפה הבסיסית, או iodine.

אלבומין המסומן ב-1 25 ונוגדן שאינו מסומן רדיואקטיבית. נשאי ננו מטargeted מדגירים בטמפרטורה של 37 °C למשך פרקי הזמן הנבחרים, אשר צריכים להתאים לאלו שנבחנו בבדיקת nz.Transport. מדדו את הדמעות כפי שהודגם קודם לכן, לפני, במהלך ואחרי הדגירה.

אסוף את כל הפראקציות לאחר האינקובציה למדידות של יוד כולל 1 25 ויוד חופשי 1 25 כביקורת חיובית לפתיחת צומתים בין-תאיים. הוסף מצע תרבית תאים המכיל מימן פרוקסיד בריכוז five millimolar לתאים העליונים והתחתונים של ה-transwell. הכנס ואגרין ב-37 °C למשך 30 דקות.

מדדו את ה-TEER והוסיפו iodine 1 25 albumin לתא העליון עבור מרווחי הזמן הנבחרים. מדדו את ה-TEER בנקודות זמן שונות לאורך הדגירה כדי לזהות את ירידת ערכי ה-TEER הנגרמת מפתיחת חיבורים תאיים שרושמה על ידי מי חמצן (hydrogen peroxide). בניסויים מקבילים, העריכו את התובע התאי (transcellular transport) או את הטרנסציטוזיס (transcytosis) של נשאי ננו ממוקדי iodine 1 25 על ידי דגירה של מונושכבות Caco two סמיחות (confluent) עם כל אחד מהמעכבים הללו.

50 µM MDC, מעכב של אנדוציטוזה מתווכת קלתירין. 1 µg/mL פיליפין, מעכב של אנדוציטוזה מתווכת קאוויאות. 0.5 µM Wortmannin, מעכב של Phosphatidylinositol 3-kinase, המעורבת במקרופינוציטוזיס, ו-20 µM EIPA.

מעכב של מקרופינוציטוזיס ואנדוציטוזיס בתיווך כימי; נמדוד TEER לפני, במהלך ואחרי דגירה של תאים עם מעכבים וחומרים המסומנים רדיואקטיבית כבקרת נוספת להשפעת המעכבים על חדירות השכבה החד-שכבתיות (monolayer) כדי לתקף את שכבות ה-Caco-2 כמודל להובלה טרנס-אפיתליאלית של ננו-נשאים ממוקדים. תאי Caco-2 גודלו על תבניות Transwell בצפיפות של 1.5 × 10⁵ תאים לסנטימטר רבוע, וההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית (TEER) נמדדה כדי להעריך את שלמות השכבה. כפי שמוצג בגרף זה, השכבה הגיעה לקונפלואנציה ביום 12 ושמרה על שלמותה עד יום 18. תוצאה זו תוקפה בהמשך על ידי נוכחותם של צמתים מהודקים (tight junctions) חיוביים לאוקלודין בשכבות בעלות TEER גבוה של 380 ohms/cm² ביום 14, בהשוואה לסימון חלש של צמתים מהודקים ב-TEER נמוך של 17 ohms/cm². ביום החמישי, כדי להעריך את ההובלה של ננו-נשאי anti-ICAM דרך שכבות תאי Caco-2, דגרו שכבות קונפלואנטיות של Caco-2 שגודלו על תבניות Transwell עם ננו-נשאי anti-ICAM המסומנים ב-Iodine-125 שהתווספו לתא העליון (apical chamber).

תכולת Iodine 1 25 בתא הבזולטרלי נמדדה בנקודות הזמן המצוינות כדי לחשב את כמות הננו-נשאים שהועברו לתא, כפי שמוצג בפאנל העליון. בפאנל התחתון, אחוז הננו-נשאים שהועברו חושב כיחס בין הנשאים שנמצאו בפרקציה הבזולטרלית לבין אלו שנמצאו בשילוב של הפרקציות הבזולטרלית והתאית. פרמטרים אלו, שהוערכו בדוגמה זו עבור ננו-נשאי Iodine 1 25 anti ICAM, הושוו גם לאלו של ביקורת Iodine 1 25 IgG ננו-נשאיים כדי להדגים את יעילות ההובלה ביחס למקבילה שאינה ממוקדת, והתוצאות מוצגות בפאנל העליון.

חושבו גם מקדמי חדירות גלוים המשקפים את קצבי ההובלה של נשאי ננו-anti ICAM המסומנים ביוד 125 או נשאי ננו-IgG המסומנים ביוד 125, כפי שמוצג בפאנל התחתון, כאשר הסימון הרדיואקטיבי מוטמע במטען הנשאי. הפרמטרים המתוארים משקפים את הובלת המטען, שבמקרה זה הוא אנזים alpha GA המשמש לטיפול בהפרעה גנטית של אגירת ליזוזומים הידועה כמחלת פברי (Fabry Disease). תכולת הרדיו-איזוטופים במנות האפיקליות, הבזולטרליות ובשברי התאים נמדדה לאחר שלוש שעות ו-24 שעות, והומרת לערכים שונים הרלוונטיים להובלה, כפי שמוצג בטבלה זו.

בנוסף לחישוב הובלת הננו-נשאים באמצעות מעקב אחר המטען, ניתן להעריך את המסירה התאי-אפיתלית של אנזים טיפולי זה על ידי ביטויו כמולקולות או פיקוגרמים של Alpha-gal המובלים לתא. כמו כן, נחקר מנגנון ההובלה של ננו-נשאי anti ICAM דרך שכבות מונושכבה של תאי Caco. הובלה טרנס-צלולרית (Transcellular Transport) של ננו-נשאי iodine 1 25 anti ICAM דרך שכבות מונושכבה של תאי Caco שניים שהגיעו למצב של confluent נבדקה לאחר 24 שעות, בהיעדרו או בנוכחותם של המעכבים הבאים: EIPA, Philippine, MDC או Wirt manin. EIPA הוא מעכב של מקרופינוציטוזיס ואנדוציטוזיס מתווכת. Philippine, MDC ו-WT menin הם מעכבים של אנדוציטוזיס מתווכת קלתירין, אנדוציטוזיס מתווכת קלתירין ומקרופינוציטוזיס, בהתאמה.

כפי שמוצג בגרף זה, EIPA הפחית את ההובלה של נשאי ננו anti ICAM המסומנים ב-125I דרך שכבות מונו-שכבה של תאי Caco-2. לעומת זאת, Filipin ו-Wortmannin לא הפחיתו את רמות ההובלה ביחס לתנאי הביקורת. נתון זה מרמז כי נשאי ננו anti ICAM משתמשים באנדוציטוזה מתווכת קבליות להובלה טרנס-תאית, אך לא בטרנסציטוזיס הקשורה ל-caveolae, קלתרין או מקרופינוציטוזיס.

כדי להעריך תעתוע פרא-צלול (Paracellular transport), נמדד ערך ה-TEER במהלך מעבר של ננו-נשאי Iodine 1 25 anti ICAM דרך שכבות Caco-2. ערכי ה-TEER של שתי שכבות מנוני (monolayers) בהיעדרו של ננו-נשאים מוצגים כביקורות, והמרווח המקווקו מסמן את ה-SEM של הממוצע. אינקובציה עם Hydrogen peroxide בריכוז 5 mM שימשה כביקורת חיובית לפתיחת חיבורים בין-תאיים, כפי שבא לידי ביטוי בירידת ה-TEER לרמות הבסיס.

בנוסף, נמדדה וחושבה דליפה של חלבונים בנתיב הפרה-תאי, שנמדדה כמקדם החדירות הנראה של iodine 1 25, albumin החוצה משכבת התאים בהיעדרו או בנוכחות של חמצון מימן בריכוז של five millimolar, נשאי ננו של IgG או נשאי ננו של anti ICAM. חמצון מימן הגביר באופן משמעותי את דליפת ה-iodine 1 25 albumin לתא הבזאלי-לטרלי ושימש כביקורת חיובית, כפי שמוצג בגרפים אלו. דגירה עם נשאי ננו של anti ICAM לא שינתה את הדליפה הפרה-תאית של tear או iodine 1 25 albumin לאורך תקופה של 48 שעות, בדומה לנשאי ננו של ביקורת IgG שאינם מובחלים.

תוצאות אלו שוללות מעבר פארא-צלולרי (paracellular transport) ועולות בקנה אחד עם תוצאות קודמות המצביעות על כך שנשאי ננו-חלקיקים אנטי-ICAM משתמשים באנדוציטוזה המתווכת על ידי CAM לצורך מעבר טראנס-צלולרי (transcellular transport). בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבחור סוג תא אחד או יותר המתאימים, ומסנן חדיר בעל גודל נקבים, קוטר חומר וכו' מתאימים עבור מודל ה-Transwell, וכן טכניקות סימון לצורך כימות יעיל של מערכת הולכת התרופות שלך לאחר ביצוע הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון פלואורסצנציה או מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (transmission electron microscopy), כדי לקבוע את מיקומם של החומרים שהועברו ובנוסף לבדיקת מצבם של החומרים שהועברו.

ניתן להשתמש ב-Western blot כדי למדוד פירוק חלבונים. ניתן להשתמש ב-EISA כדי לקבוע את יכולת הטרגוט של נשאי הובלה, ואת פעילות המטען התרופתי ניתן למדוד באמצעות בדיקות ספקטרופוטומטריות או טכניקות מתאימות אחרות.