Name: Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-07T22:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: למד מתודולוגיית דה-סלולריזציה לייצור מטריקס טבעי אצלולרי ממעי דגנים לשימוש בהנדסת רקמות. שיטה זו שומרת על הארכיטקטורה והרשת הווסקולרית לטיפול בכשל מעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים וייק פורסט המכון לרפואת רגנרטיבית לעזרתם עם פיתוח של פרוטוקול זה. אנו מכירים תמיכה על ידי תרומות של הצדקה רחוב גרייט אורמונד בבית החולים, הקרן Eugenio Litta (ז&#39;נבה, שוויץ), המועצה למחקר הרפואי, מכללת מנתחים המלכותית של אנגליה, הצדקה הרפואית של ניצוצות הילדים, משרד החוץ הבריטי לבריטניה / ארה&quot;ב גזע פרס שיתוף פעולה נייד וקרן המחקר למיטאל. כמו כן, אנו רוצים להודות לקרן החברה המלכותית / וולפסון למענק שיפוץ מעבדת הנדסת רקמות שהתקבל למחלקה לכירורגיית הילדים במכון לבריאות ילד. PDC ו SE נתמך על ידי הצדקה של רחוב אורמונד בית החולים לילדים הגדולים.

1. בידוד של עכברוש מעי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1 ליטר של בופר פוספט (Sigma, בריטניה) עם 1% אנטיביוטיקה / antimycotic (Sigma, בריטניה) (PBS / AA). להתאים את משאבת peristaltic (מהירות משתנה L Masterflex / S) עם שני צינורות. הפעל 70% אתנול (EtOH) דרך הצינורות של משאבת peristaltic ל15 דקות במהירות המרבית, ואחריו PBS / AA לעוד דקות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדות ספראג-Dawley בוגרת במשקל של כ 250-350 גר &#39;על ידי CO 2 שאיפה ונקע בצוואר הרחם על פי הנחיות מקומיות של בעלי חיים ואישורים (בבריטניה, הנחיות משרד פנים תחת בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מכשירי הניתוח לפני השימוש. ספריי ולנגב את הבטן של החיה באמצעות EtOH 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך laparotomic xifo-ערווה על הבטן כדי להבטיח שדה ניתוחי ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסחת את המעי הדק בצד ימין של החיה על מגבת נייר ריססה עם EtOH 70%. Takטיפול בדואר להרטיב ברציפות המעי עם PBS / AA כדי למנוע התייבשות של הרקמות וdenaturation של מטריקס תאי (ECM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את עורק mesenteric מעולה (SMA), שנובע בזווית של ° 90 מאב העורקים לכיוון המעי. השתמש בצינורית G 27 להיכנס SMA מאב העורקים ובמהירות למשוך את המחט כדי למנוע את קריעת הקיר של כלי השיט. לקדם את צינור הפלסטיק של הצינורית לתוך SMA ומאובטח באמצעות תפרים (Vicryl 5/0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר cannulation על ידי הזרקת 1 מיליליטר של PBS / AA. השתמש במספריים באביב כדי לחתוך הפרוקסימלי אב העורקים ודיסטלי SMA כדי לשחרר את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע דליפה של צואה כאשר לנתח את המעי גס, במקום אחד (משי 5/0) קשר תפר בקצה הפרוקסימלי של צומת ileocaecal ואחד בקצה הדיסטלי של המעי הגס סיגמואיד. ואז לחתוך את מעי סופני ומעי גס בין שני קשרים ולהסיר את המעי גס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי בצומת jejuno-התריסריוןnd לשחרר את המעי מכל חיבורי רקמות חיבור זה יכול להיות עם הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המעי הדק בצלחת פטרי עם PBS / AA. Cannulate הקטע הפרוקסימלי של המעי עם טפטפת פלסטיק פסטר (מתכלה המעבדה LSL) ולאבטח אותו במקום עם תפרים. חותכים את פיפטה כך שהוא יתאים Luer-לוק של מזרק 60 מיליליטר (BD Plastipak). סומק לומן המעיים 2X עם 60 מיליליטר של PBS / AA להסיר את הצואה ופסולת. </li></ol> 2. מתודולוגיה Decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינורית כלי הדם לברזלי שלוש דרך. זה יקל טיפול, לצמצם את המתח על העץ בכלי הדם ומאפשר הסרת בועות מהצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מים זורמים deionized (18.2 MΩ / סנטימטר התנגדות) באמצעות משאבת ההרים מהירות משתנה L Masterflex / S ב0.6 מיליליטר / שעה. ודא שאין בועות נמצאות בתוך צינורות לפני חיבור עם ברזלים חלל מעי. בועות מסוימות עשויות להיות נוכחת בתוך לומן מצעד1.9, אשר עלול לפגוע בתהליך decellularization. לשנות את המהירות של המשאבה ולטפל ברקמות עם מלקחיים בזהירות כדי להבטיח את יציאת בועות מהקצה הדיסטלי. אל תחבר את צינורית כלי הדם עד שתהליך זה יסתיים מאז מהירויות גבוהות עלולות לגרום נזק לעץ בכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המכשיר לחדר הקר, שכן הצעד של decellularization הבא מתבצע ב 4 ° C. הטמפרטורה הנמוכה מאפשרת הסרת התאים תוך מזעור פירוק רקמות. מניחים את צלחת פטרי במכל שיאסוף את הפתרון שעלה על הגדות. תנקב שניהם חלל המעי והעץ בכלי הדם במי deionized (התנגדות 18.2 MΩ / סנטימטר) ל24 שעות ב0.6 מיליליטר / שעה. בשעה הראשונה לבדוק את המנגנון באופן קבוע על מנת להבטיח את כל החיבורים מאובטחים, דליפה היא מינימאלית ואין בועות נמצאות בתוך המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של טיפול במי deionized, להעביר מנגנון decellularization מחוץ לחדר הקר כמו שאר השלבים הםמתבצע בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל deoxycholate נתרן (Sigma, בריטניה) כדי להכין 300 מיליליטר של פתרון 4% במי deionized. שוקל deoxycholate נתרן מתחת למכסת מנוע יניקה, כפי שהוא גירוי אוראלי ועין. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. הפתרון עשוי להישמר על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את פתרון deionized לdeoxycholate נתרן, בדוק את החיבורים, להסיר כל בועות וינקבו ב0.6 מיליליטר / שעה במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף צעד deoxycholate נתרן עם PBS / AA ל30 דקות, כדי למנוע אינטראקציה בין deoxycholate נתרן וDNase-I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את deoxyribonuclease-I (DNase-I, Sigma) ולהכין 250 מיליליטר של פתרון 2,000 KU בנתרן כלורי 1 מ &#39;, pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. פתרון זה חייב להיות מוכן מייד לפני השימוש ולא יכול להיות מאוחסן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנקב עם DNase-במשך 3 שעות ב RT במהירות של 0.6 מיליליטר / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות DNase-אני הצעד, להעביר אתפיגום לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה ולשנות צלחות ומכשירים. הוא הציע להשתמש בטכניקה מזוהמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS / AA ל30 דקות כדי להבטיח את כל השאריות של פתרונות decellularization יוסרו. הנח את הפיגום בצלחת פטרי חדשה ולהעביר לcrosslinker UV (Spectroline, ארה&quot;ב). להפעיל שני מחזורי עיקור. אחסן ב5% PBS / AA ולשנות את הפתרון כל 3 ימים. </li></ol>

<ol><li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li>
<li>Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li>
<li>Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+transplantation+of+a+bioengineered+airway+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiov.+Surg%22%5BJournal%5D)">First human transplantation of a bioengineered airway tissue.</a> J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li>
<li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+a+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li>
<li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multicellular+Approach+Forms+a+Significant+Amount+of+Tissue-Engineered+Small+Intestine+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+optimizes+the+formation+of+tissue-engineered+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine.</a> Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).</li>
<li>Chen, M. K., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+bowel+tissue+engineering+using+small+intestinal+submucosa+as+a+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold.</a> J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).</li>
<li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+assessment+of+small+intestinal+submucosa+as+a+small+bowel+graft+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model.</a> J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).</li>
<li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+evaluation+of+regenerated+small+bowel+by+small+intestinal+submucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa.</a> J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).</li>
<li>Hori, Y., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+on+tissue+engineering+of+the+small+intestine+by+mesenchymal+stem+cell+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding.</a> J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).</li>
<li>Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+tissue-engineered+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in tissue-engineered small intestine.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).</li>
<li>Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+matrices%2C+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method%2C+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Int%22%5BJournal%5D)">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).</li>
<li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , 1-8 (2010).</li>
<li>Uygun, B. E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).</li>
<li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li>
<li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li>
<li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+lung+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).</li>
<li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li>
<li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li>
<li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הצעדים הקשים ביותר בהקמת ניסוי זה כרוך cannulation של SMA והקמה והתחזוקה של עקרות. Cannulating SMA במכרסמים ללא פקיעת הקיר יכול להיות די קשה בשל הגודל והמיקום של כלי השיט. לחלופין, תפר ניתן להציב סביב אב העורקים הפרוקסימלי לפני המוצא SMA, ואחריו cannulation של אב העורקים עצמו distally, בימוי צינורית הפלסטיק לתוך SMA. במהלך decellularization שילוב של מיקום צינורית עני וספיקות גבוהות עלול לגרום לאבד את הגישה של כלי הדם. עקרות היא בעיה רצינית עקב כמות של חי חיידקים הנמצאים במעי הדק. שטיפה עם PBS / AA הבאה קציר היא מאוד חשובה, וכל סימן של עניין או פסולת בצואה יש להסיר מלומן. הצבת חלק מהפיגום בצינור בז עם DMEM בחממה הבאה עיקור UV צריכה להיות אינדיקטור אם עקרות הושגו. במקרההקולוניזציה חיידקים, התקשורת תשנה את ה-pH עם הצבע שלו הופך מאדום לצהוב. כדי להתמודד עם זה, מחזורי UV נוספים מומלץ וכן כביסה עם PBS המכיל ריכוז גבוה של האנטיביוטיקה / antimycotic. שינוי להסיג לך פיגום עם גישת שני כלי דם וורידים יהיה cannulate נחות הווריד הנבוב (IVC), כמו גם מחברת SMA. Decellularization מצדדי ורידים וכלי דם צריך להיות ניסיון לסירוגין במשך כל שלושת הפתרונות. decellularization המתמשך עלול להתפוצץ נימי הדם על ידי שיש לחץ חיובי על שני הצדדים. במהלך השנים היו מספר ניסיונות במעיים TE באמצעות שילובי תא פיגום שונים במבחנה in vivo 6,9,12. רוב העבודה שבוצע באמצעות פיגומי PLGA צינורי 95%% PGA-5 לא ארוגים מצופים בסוג אני 6,7,13,22 קולגן. הזריעה הבאה עם מעייםיחידות אפיתל organoid (יחידות ארגוניות) ותקופה של השתלה לתוך omentum של עכברים, הם יוצרים ציסטות בשרירים בצד החיצוני והאפיתל בחלק הפנימי אשר לאחר מכן ניתן tubularized. עם זאת, הנקבוביות והפשטות בעיצוב של פיגומים אלה אינם מאפשרים לדור של חתיכות גדולות של מעי מלאכותי בסביבה במבחנה כמו זו של bioreactor. בנוסף, המחסור ברשת כלי דם מולדת שיכול להיות מחוברת לנמען נוסף מגבילה את השימוש בפיגום הזה לתרגום קליני. חוץ מהניסויים עם פיגומי PGA-PLGA, קבוצות אחרות השתמשו בפיגומי קולגן או SIS, אשר שניהם לא לשכפל את המורכבות של מערכת העיכול. SIS בפרט הוא המתודולוגיה שפורסמה קודמת רק של הנדסת רקמות מעיים וכבר בשימוש בלמעלה מ 150 הגדרות רפואיות, הממחיש את יכולתה של פיגומי decellularized לספק יציבות מכאנית ולקדם את צמיחת תאים תוך הובלהing לשום תגובת immunogenic. עם זאת, חוסר ארכיטקטורת מיקרו מקרו ומתאים, הוביל לתוצאות גרועות בשימוש בו &quot;למטרות TE מעיים 9-11,23. היתרונות של מתודולוגיה decellularization שתארנו כוללים את שימור מאפיינים מיקרוסקופיים כגון ארכיטקטורת קריפטה-סיסי luminal המייצגים את הסביבה מתאימה לאכלוס על ידי הנישה תאי גזע במעי. בהיבט מאקרוסקופי, הנוכחות של רשת כלי דם היררכית תאפשר קובץ מצורף לנמען, המאפשרת מתן חומרי מזון וחמצן לכל השכבה של TE-המעי 21. מה הוא יותר, התחזוקה של רכיבי ECM כגון קולגן, אלסטין וglyocosaminoglycans יש תפקיד חשוב לא רק למאפיינים מכאניים, אלא גם מכוונים את הריבוי והתמיינות תאיים. והכי חשוב, את היכולת של המתודולוגיה decellularization להיות מדורגת עד לגדולרקמות r תוך שמירה על אותם המאפיינים היא תכונה חשובה לתרגום קליני של TE. הפיתוח של מטריקס מעיים טבעי עם רשת כלי דם מאפשר יצירה של מגזרים גדולים יותר של מעי מלאכותי שיכול להיות מחובר למחשב המארח.

הנדסת רקמות (TE) מספקת אלטרנטיבה טיפולית להשתלת איברים, תוך עקיפת סוגיות של דיכוי חיסוני ומחסור באיברים. TE היה לאחרונה יישומים מוצלחים במרפאת, עם החלפה של איברים כגון שלפוחית ​​השתן 1, 2 שופכה ואת קנה הנשימה, הן במבוגרים 3,4 וילדים 5. בניית איבר רקמות מהונדסות מחייבת שילוב של פיגום עם התאים המתאימים. פיגום ניתן להכין באמצעות טבעית הנגזר (למשל קולגן) ו( חומצה למשל פולי-L-גליקולית; PLGA) סינתטית חומרים, או להשיג על ידי decellularization של איברים ורקמות מקומיים. פיגומים שהיו בשימוש עד כה לTE מעיים היו בעיקר שני decellularized (submucosa מעי הדק) או סינטטי (חומצת פולי-L-גליקולית וחומצה לקטית פולי) 6-13. חומרים ביולוגיים אלה הם פשוטים מאוד בשתי ארכיטקטורת מיקרו מקרו ו, אשרלא יכול להיות אידיאלי אם מעי רקמות מהונדסות הוא להיות מתורגם מבחינה קלינית. ביולוגי אופטימלית למעי צריך עץ בכלי דם מולדת שיכול להיות מחובר לאספקה ​​של מארח דם, קיר צינורי שכבתי עם מאפיינים שונים על מנת לשקף את שכבות דופן המעי וציר סיסי-קריפטה בצד luminal כדי לסייע עם אכלוס על ידי תאי גזע אפיתל. Decellularization הוא מתודולוגיה חדשנית שמייצרת פיגומים על ידי הסרת תאים מאיברים שלמים תוך שמירה על הארכיטקטורה המקורית שלהם 14. זה עדיף על קיים כבר פיגומים שכן הם לא רק לשכפל את המבנה של האיבר אבל גם מכילים אותות כימיים המוטבעים בתוך המטריצה ​​תאית (ECM) שהתרבות תאי סיוע ובידול. בשנת 2008 קנה הנשימה מגופות היה decellularized 14, נזרע עם תאים של החולה עצמו, ומושתל להחליף את הסמפונות השמאל העיקרית בבחור צעיר <sup&gt; 3. מאז, מספר הקבוצות דיווחו הייצור של פיגומי decellularized ללב 15, הכבד 16,17, וריאות 18-20 בבעלי חיים קטנים וגדולים. יש לנו גם להתאים אותן השיטות כדי לייצר פיגום decellularized מעי דק 21. המטרה של השיטה המתוארת במסמך זה היא לייצר מטריצות מעיים decellularized, כי לשמור על המאפיינים מקרוסקופית של רקמה המקורית כגון אספקת הדם, כמו גם את הארכיטקטורה המיקרוסקופית של הציר סיסי-קריפטה בחלל המעי. אנו מאמינים במתודולוגיה זו סופו של דבר יכולה להיות מאומץ על איברים אחרים כדי לשפר את היעילות של decellularization.

<table><tbody><tr><td>תמיסת אתנול, 70% ב-H20</td><td>Sigma</td><td>02877</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מלח חומצות פוספט</td><td>Sigma</td><td>79382</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אנטי-פטריית אנטיביוטית (100x)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>מגרה את הפה והעיניים; הגנת שימוש</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקר</td><td>סיגמא</td><td>D5025</td><td></td></tr></tbody></table>

decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

הנדסת רקמות מוצלחת כרוכה בשילוב של פיגומים עם תאים מתאימים במבחנה או in vivo. פיגומים עשויים להיות סינטטיים, באופן טבעי, שהופק או שמקורם ברקמות / איברים. האחרון מתקבלים באמצעות טכניקה המכונה decellularization. Decellularization עשוי להיות כרוך בשילוב של פיזי, כימי, ושיטות האנזימטית. המטרה של טכניקה זו היא להסיר את כל העקבות הסלולריות תוך שמירה על ארכיטקטורת מיקרו מקרו ושל הרקמה המקורית. הנדסת רקמות מעיים עד כה השתמשה בפיגומים פשוטים יחסית שלא ישכפל את הארכיטקטורה המורכבת של האיברים הילידים. המוקד של מאמר זה הוא לתאר טכניקת decellularization יעילה למעי דק חולדה. הבידוד של המעי דק, כדי להבטיח השמירה על חיבור של כלי דם מתואר. השילוב של פתרונות כימיים והאנזימטית כדי להסיר את תאי whilst שימור הציר סיסי-קריפטה בהיבט luminal של הפיגום הוא גם יצא לדרך. לבסוף, הערכה של פיגומים הופקו עבור מאפיינים המתאימים לדיון.

על decellularization המוצלח (איור 1), הפיגום צריך להיות מראה מאקרוסקופי דומה לזה של המעי המקומי, אבל עם (איור 2 א) קירות שקופים. שימור המאקרו הארכיטקטורה צריך להיות גם לידי ביטוי על ידי patency של העץ בכלי הדם. כאשר הצבע מוזרק דרך צינורית SMA, יש לפזר באופן אחיד לאורך כל הפיגום ולהגיע לעץ הנימים (איור 2). הפיגום צריך להיות חופשי של חומר גרעיני וcytoplasmic, משהו שניתן להעריך באמצעות ערכת כימות DNA וניתוח היסטולוגית פשוט. Hematoxylin ומכתים eosin (H &amp; E) צריכה להוכיח היעדר חומר גרעיני וcytoplasmic תוך שמירה על שכבות המעי הדקות (איור 3 א). בפרט, התחזוקה של villi ומאורות בצד luminal צריכה להיות ברורה הבאה מיקרוסקופיית אלקטרונים (איור 4).גם שימור של רכיבי מטריצה ​​תאיים כגון קולגן, אלסטין וglycosaminoglycans צריך להיות צפוי. לדוגמא, רקמת חיבור ללא פגע מציג מכתים Trichrome של האסון בפיגום (איור 3 ב). <img alt="איור 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. . תכנית ניסיונית ציר זמן של הליך decellularization; PBS / א.א.: פוספט שנאגרו מלוח עם NaDeoxy האנטיביוטיקה antimycotic,: deoxycholate נתרן, RT: טמפרטורת חדר, DNAse-I: deoxyribonuclease-I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. macroscopi פיגוםג מאפיינים. מראה מקרוסקופית של המעי הדק העכברוש הבא decellularization המוצלח (). הזרקה של רוסו Ponceau לצבוע באמצעות SMA מדגימה רשת שלמה של כלי דם (B); SMA: עורק mesenteric מעולה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> איור 3. . היסטולוגיה H &amp; E () ומכתים MT (ב &#39;) מצביעים על העדרו של חומר תאי עם שימור ארכיטקטורת רקמת חיבור; H &amp; E: hematoxylin ו eosin, MT: Trichrome של מייסון. בר סולם:. 100 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> </p&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> איור 4. . מיקרוסקופ אלקטרונים מיקרוסקופית אלקטרונים סריקה מציין את הארכיטקטורה סיסי-קריפטה השתמרה בלומן הפיגום; בר סולם:. 100 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

המאמר מתאר מתודולוגיה לייצור מטריצת acellular ממעי חולדה. הגזירה של פיגומי מעיים חשובה ליישומים עתידיים בתחום הנדסת רקמות, ביולוגיה של תאי גזע ובדיקות סמים.

Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פיגום (scaffold) א-תאי טבעי להנדסת רקמות מעי. זאת משיגים תחילה על ידי קנולציה של העורק המזנטרי העליון (SMA) של חולדה, וקצירה של המעי הדק יחד עם הגישה הווסקולרית. בשלב השני, השאריות בתוך הלומן נשטפות, והקנולות האינטרא-לומנליות והווסקולריות מחוברות למשאבה פריסטלטית.בשלב הבא, המעי הדק עובר פרפוזיה עם מים דה-יוניים למשך 24 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. בשלב האחרון, המעי הדק עובר פרפוזיה עם sodium deoxy, coate, ו-DNAs בטמפרטורת החדר. לבסוף, ניתן להדמיאן את דה-צלולריזציה מלאה של המעי הדק, כמו גם את המבנה והמרכיבים שלו, באמצעות היסטולוגיה ומיקרוסקופיה אלקטרונית בהתאמה.אנו ניצבים כיום בפני הבעיה הקלינית של אי-ספיקה של המעי, מצב הרסני המשפיע הן על ילדים והן על מבוגרים. תזונה פרנטרלית והשתלה קונבנציונלית אינן מספקות ריפוי מלא. ייצור של פיגום מעי תלת-ממדי בעל כלי דם, כפי שמוצג בסרטון הבא, מכוון לעבר הטיפול באי-ספיקה של המעי.הדבר המרשים בטכניקה זו הוא שהשימוש בחומרים כימיים עדינים לדיגיטליזציה משמר את המיקרו-ארכיטקטורה של המעי, כפי שעולה מתוצאות המיקרוסקופ האלקטרוני. בנוסף, השמירה על רשת כלי הדם ההיררכית בעקבות התהליך מאפשרת זריעה של מבנה שניתן לחבר מחדש למארח. אספקת דם: התחלו בהתקנת שתי שפודות במשאבה פריסטלטית, לאחר מכן העבירו 70% ethanol דרך שפודות המשאבה הפריסטלטית למשך 15 דקות במהירות מרבית, ולאחריהם PBS AA שהוכן רגע לפני השימוש למשך 15 דקות נוספות.לאחר שטיפת משאבת התרסס, נקה את בטן החולדה (סוג spra dolly) שהורדמה, במשקל 250 עד 350 גרם, באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, באמצעות מכשירים כירורגיים שעברו עיקור באוטוקלאב, בצע חיתוך לפרוטומיה פוביקה בצורת XO בבטן כדי להבטיח שדה כירורגי נקי, והוצא את המעי הדק לצד ימין של בעל החיים על גבי נייר סופג שהורסס ב-70% ethanol. הקפד להרטיב את המעי באופן רציף ב-P-B-S-A-A כדי למנוע התייבשות של הרקמה ודנטורציה של המטריצה החוץ-תאית.בשלב הבא, אתרו את ה-SMA, שיוצא בזווית של 90 מעלות מהאאורטה לכיוון המעי. הניחו תפר סביב ה-SMA והכינו קשר. השתמשו בקנולה בכיול 27G כדי להיכנס ל-SMA מהאאורטה, ולאחר מכן משכו את המחט במהירות כדי למנוע קריעה של דופן כלי הדם.כעת העבירו את צינור הפלסטיק של הקנולה אל תוך ה-SMA, קבעו את הצינור באמצעות תפרי Vicryl 5-0, ולאחר מכן התיזו 10 milliliters של P-B-S-A-A כדי לוודא את הקנולציה. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לבצע חתך באורטה פרוקסימלית ודיסטלית ל-SMA כדי לשחרר את הקנולה ולמנוע דליפת צואה בעת דיסקציה של המעי הגס; קשרו תפר silk 5-0 אחד בקצה הפרוקסימלי של הצומת האיליאו-צקאלית (ileocecal junction) ואחד בקצה הדיסטלי של המעי הסיגמואידי. לאחר מכן, חתכו את האיליאום הטרמינלי ואת המעי הגס בין שני הקשרים והסִירו את המעי הגס.כעת חתכו את המעי הדק בחיבור ה-Juno duodenal ושחררו את המעי מכל קשרי רקמה חיבורית שעשויים להיות לו עם הבטן. העבירו את המעי הדק אל צלחת פטרי המכילה PBS aa. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה פלסטית אחורית כדי לבצע קנולציה של החלק הפרוקסימלי של המעי, וקבעו אותו במקומו באמצעות תפרים.לבסוף, חתו את הפ pipette כך שיתאימה לחיבור ה-lure lock של מזרק בנפח 60 milliliters, ולאחר מכן שטוף את חלל המעי בשתי שטיחות של 60 milliliters של P-B-S-A-A כדי להסיר צואה ופסולת. לפני תחילת תהליך הדה-צלולריזציה, ודא כי אין בועות בתוך חלל המעי ובקנולות של כלי הדם. לאחר מכן, חבר ברז תלת-כיווני (three-way stop cock) לקנולה של כלי הדם והנח את פטרי את המאגנה בתוך מיכל לאיסוף כל תמיסה שעלולה לגלוש. לאחר מכן, התחל להזרים מים דה-יונזים באמצעות משאבת גלגללים בעלת מהירות משתנה מדגם master flex LS בקצב של 0.6 milliliters לשעה.טפלו ברקמה בזהירות כדי להבטיח שהבועות יצאו מהקצה הדיסטלי. לאחר שכל הבועות הוסרו מהקניולות, העבירו את המערך לחדר הקירור. לאחר מכן, התחילו את תהליך הדה-צלולציה (decellularization) על ידי פרפוזיה של both luminal lumen ושל העץ הווסקולרי במים דה-יוניים זורמים למשך 24 שעות, בקצב של 0.6 milliliters per hour במהלך השעה הראשונה.יש לבדוק את המערכת באופן קבוע כדי לוודא שכל החיבורים מאובטחים. הדליפה מינימלית ואין בועות בתוך המעי. לאחר 24 שעות, העבירו את מערכת הדה-צלולריזציה בחזרה לטמפרטורת החדר.צבע המעי אמור להשתנות לוורוד בהיר תחת מכסה שאיבה. שקלו כמות מספקת של sodium deoxy coate להכנת תמיסה בריכוז 4% ב-300 milliliters של מים דה-יוניים. השתמשו בוורטקס כדי לערבב את התמיסה עד שיהיה היא תהיה צלולה.כעת, החליפו את התמיסה דה-יונית בנתרן דאוקסיכולאט. בדקו את החיבורים. הסירו בועות אוויר והזרמו נוזלים למעי הדק בקצב של 0.6 milliliters לשעה למשך ארבע שעות.לאחר שלב הסודיום דוקסיקולאט, הרקמה הופכת לשקופה. השמירה על הרשת כלי הדם הופכת גלויה גם היא לאחר הוספת PBS AA למשאבה. שטפו את המעי עם PBS AA למשך 30 שניות כדי למנוע אינטראקציות בין הסודיום דוקסיקולאט לבין ה-DNA.לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לרקמה באמצעות DNAs שהוכנו טרי, אחד בטמפרטורת החדר במהירות של 0.6 milliliters per hour. לאחר שלוש שעות, העבירו את הפיגום (scaffold) למנדף תרביות רקמה ובאמצעות טכניקה סטרילית, החליפו את המצע. סטריליזרו שוב את צינורות משאבת הפריסטלטיקה על ידי העברת ethanol דרכם.שטפו את המעי פעם אחרונה עם P-B-S-A-A למשך 30 דקות כדי להבטיח שכל שאריות תמיסות הדה-צלולריזציה הוסרו. לבסוף, העבירו את הפיגום למכשיר הצלבה ב-UV והפעילו שני מחזורי סטריליזציה. לאחר מכן, אחסנו את הפיגום ב-P-B-S-A-A.החלפת התמיסה מדי שלושה ימים. לאחר דה-צלולריזציה מוצלחת, הפיגום אמור להיראות במבטו המקרוסקופי בדומה למעי טבעי, אך עם דפנות שקופות. שימור הארכיטקטורה המקרוסקופית אמור לבוא לידי ביטוי גם בנתיבות פתוחות של מערכת כלי הדם.בעת הזרקת צבע דרך הקנולה של ה-SMA, הוא אמור להתפזר באופן שווה בכל הפיגום (scaffold) ולהגיע לעץ הנימיים. הפיגום צריך להיות נקי מחומר גרעיני וציטופלזמי, דבר שניתן להעריכו. באמצעות ערכה לכימות DNA ואנליזה היסטולוגית פשוטה, צביעת hematin and eosin צריכה להראות היעדר של חומר גרעיני וציטופלזמי תוך שימור שכבות המעי הדק, כפי שמוצג בתמונה זו.בפרט, השמירה על ה-villi וה-crypts בצד הלומנלי צריכה להיות ניכרת לאחר מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת. כמו כן, יש לצפות לשימור נוסף של מרכיבי המטריצה החוץ-תאית, כגון קולגן, אלסטין וגליקוזאמינוגליקנים, כפי שמוצג כאן. לדוגמה, צביעת Masson's Trichrome מאפשרת להדגים את רקמת החיבור השלמה בפיגום.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו יוצרים פיגום תאי מעי טבעי.

a-decellularization-methodology-for-production-natural-acellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מטריקס רקמות ספציפיות (ECM) הוא מתווך המפתח תפקוד התא. מאמר זה מתאר שיטות סינתזת קצף טהור הנגזרות ECM ו- microcarriers כי הם יציבים בתרבות ללא צורך crosslinking כימי עבור יישומי 3D מתקדם במודלי תרבית תאים במבחנה או כפי bioscaffolds פרו-רגנרטיבית.

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

פרוטוקול זה מתאר את decellularization מלא של שריר הלב האנושי תוך שמירה על מרכיביו מטריצה חוץ-תאית. עיבוד נוסף של התוצאות מטריצה חוץ-תאית בייצור של microparticles ו הידרוג וההספק עצמית של cytoprotective.

עיבוד של רקמת הלב האנושי כלפי עצמי בהרכבת הידרוג במבחנה ויישומים In Vivo מטריצה חוץ-תאית

כאן אנו מציגים, ניגודיות שני פרוטוקולים נהגה decellularize רקמות הצמח: גישה מבוססת דטרגנט וגישה ללא חומרי ניקוי. שתי השיטות להשאיר מאחור את מטריצה חוץ-תאית של רקמות הצמח בשימוש, אשר אז יכול להיות מנוצל כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

פיגומים הסחוס, נגזר decellularized יכול לשמש בדומה לפיגום כדי לתקן סחוס מדריך וכאמצעי לחדש רקמות osteochondral. מאמר זה מתאר את התהליך decellularization בפירוט ומספק הצעות להשתמש פיגומים אלו בהגדרות במבחנה.

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של polycaprolactone (PCL) נימה עם microspheres חומצה (PLA) polylactic מוטבע אשר מכילים decellularized מטריצות (DM) עבור הדפסת תלת-ממד של רקמות מבניות הנדסת מבנים.

הרומן תהליך הדפסת תלת-ממד Decellularized מטריצות

המטרה של פרוטוקול זה הוא ייצור של סיבי מטריצה חוץ-תאית כל ממוקד עבור תיקון הפצע אשר מתאימים להערכה פרה כחלק שתל משובי לגרדום. סיבים אלו המיוצר על ידי התרבות של fibroblasts על ממברנות הולופייבר, שחולצו על ידי פירוק הממברנות.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

Decellularized מטריקס מסחטות (dECM) יכול לספק רמזים מיקרו סביבתי מתאים כדי ללכוד את הפונקציות הטמונות של רקמות היעד במבנה מהונדס. מאמר זה מהבהיר את הפרוטוקולים עבור decellularization של רקמת הלבלב, הערכה של רקמת הלבלב הנגזרת dECM ביודיו, והדור של בנייה רקמת הלבלב 3D באמצעות טכניקת ביוריטינג.

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

פרוטוקול זה נועד לבטל את הלב והריאות של עכברים. ניתן לחסן ולדמות את הפיגומים החוץ-תאיים (ECM) המתקבלים כדי למפות את המיקום והטופולוגיה של הרכיבים שלהם.

דקלולריזציה של קומפלקס הקרדיו-ריאות מורין

בעבודה זו, פרוטוקול דה-צלולריזציה עבר אופטימיזציה להשגת מטריצות דה-צלולריות של שרירי השלד של עכבר העובר. מיובלסטים C2C12 יכולים ליישב מטריצות אלה, להתרבות ולהבדיל. מודל זה במבחנה יכול לשמש לחקר התנהגות התא בהקשר של מחלות שרירי שלד כגון ניוון שרירים.

הכנת מטריצות תלת ממדיות דה-צלולריות משריר השלד של עכבר העובר לתרבית תאים

Decellularization זלוף היא שיטה חדשנית לייצור פיגומים כבד כל כך שומרת על הרכב תאי מטריקס של איברים ארכיטקטורה. בזאת, השיטה של ​​הכנת פיגומים איבר שלם באמצעות decellularization זלוף ואכלוס הבאים עם hepatocytes מתואר. שתלי כבד פונקציונליים להשתלה ניתן להפיק באמצעות טכניקה זו.

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

למד מתודולוגיית דה-סלולריזציה לייצור מטריקס טבעי אצלולרי ממעי דגנים לשימוש בהנדסת רקמות. שיטה זו שומרת על הארכיטקטורה והרשת הווסקולרית לטיפול בכשל מעי.

Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular

גלה סרטונים נוספים