Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פיגום א-תאי טבעי להנדסת רקמות מעיים. זה מושג על ידי קנולציה ראשונה, עורק מזנטרי עליון של חולדה או SMA, וקצירת המעי הדק יחד עם הגישה לכלי הדם. בשלב השני, הפסולת התוך-לומינלית נשטפת החוצה והצינוריות התוך-לומינליות וכלי הדם מחוברות למשאבה פריסטלטית.

לאחר מכן, המעי הדק מוזרם במים נטולי יונים למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. בשלב האחרון, המעי הדק מועשר בנתרן דאוקסי, קואט ו-DNA בטמפרטורת החדר. בסופו של דבר, ניתן לדמיין את הדה-סלולריזציה המלאה של המעי הדק, כמו גם את הארכיטקטורה והמרכיבים שלו על ידי היסטולוגיה ומיקרוסקופ אלקטרונים בהתאמה.

אנו מתמודדים כיום עם הבעיה הקלינית של אי ספיקת מעיים, מצב הרסני המשפיע על ילדים ומבוגרים כאחד. תזונת הורים והשתלות קונבנציונליות אינן מספקות ריפוי מלא. הייצור של פיגום מעיים תלת מימדי כלי דם כפי שמודגם בסרטון הבא, משתרע לקראת טיפול באי ספיקת מעיים.

מה שמדהים בטכניקה זו הוא שהשימוש בכימיקלים דיגיטליים עדינים משמר את ארכיטקטורת המיקרו של המעיים כפי שניתן לראות בתוצאות מיקרוסקופ האלקטרונים. בנוסף, תחזוקת רשת כלי הדם ההיררכית בעקבות הציוויליזציה מאפשרת זריעה של מבנה שניתן לחבר מחדש למארח. אספקת דם התחל בהתקנת משאבה פריסטלטית עם שני צינורות, ולאחר מכן העביר 70% אתנול דרך צינורות המשאבה הפריסטלטית למשך 15 דקות במהירות מרבית, ולאחר מכן PBS AA טרי שהוכן למשך 15 דקות נוספות.

לאחר שטיפת המשאבה יש לרסס ולנגב את הבטן של חולדה בהמתת חסד של 250 עד 350 גרם ספרה דולי עם 70% אתנול. לאחר מכן, באמצעות מכשירים כירורגיים מעוקרים בחיטוי, בצע חתך לפרוטומיה של ערווה XO על הבטן כדי להבטיח שדה כירורגי ברור להוציא את המעי הדק לצד ימין של החיה על מגבת נייר מרוססת באתנול 70%. הקפד להרטיב את המעי ברציפות עם P-B-S-A-A כדי למנוע התייבשות של הרקמה ודנאטורציה של המטריצה החוץ-תאית.

לאחר מכן, אתר את ה-SMA, שנוצר בזווית של 90 מעלות מאבי העורקים לכיוון המעי. הניחו תפר סביב ה- SMA והכינו קשר. השתמש בצינורית בגודל 27 כדי להיכנס ל-SMA מאבי העורקים, ולאחר מכן משוך במהירות את המחט כדי למנוע קריעת דופן הכלי.

כעת קדם את צינור הפלסטיק של הצינורית לתוך ה- SMA, אבטח את הצינור עם תפרי ויקריל חמישה או, ולאחר מכן הזריק 10 מיליליטר של P-B-S-A-A כדי לאשר קנולציה. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את אבי העורקים הפרוקסימלי והדיסטלי ל-SMA כדי לשחרר את הצינורית כדי למנוע דליפת צואה בעת ניתוח המעי הגס, הנח קשר תפר משי אחד בקצה הפרוקסימלי של צומת האילאו-צקלי ואחד בקצה הדיסטלי של המעי הגס. לאחר מכן חותכים את האילאום הסופי והמעי הגס בין שני הקשרים ומסירים את המעי הגס.

כעת חתכו את המעי הדק בצומת התריסריון של ג'ונו ושחררו את המעי מכל חיבורי רקמת החיבור שיש לו עם הבטן. מעבירים את המעי הדק לצלחת פטרי המכילה PBS aa. לאחר מכן השתמש בפיפטה אחורית מפלסטיק כדי לקנול את החלק הפרוקסימלי של המעי, ואבטח אותו במקומו בעזרת תפרים.

לבסוף, חתוך את הפיפטה כך שתתאים למנעול הפיתוי של מזרק של 60 מיליליטר, ולאחר מכן שטוף את לומן המעי בשתי שטיפות של 60 מיליליטר P-B-S-A-A כדי להסיר צואה ופסולת לפני תחילת תהליך הדסלולריזציה, ודא שאין בועות בתוך לומן המעי וצינוריות כלי הדם. לאחר מכן חבר זין עצירה תלת-כיווני לצינורית כלי הדם והניח את צלחת הפטרי במיכל כדי לאסוף כל תמיסה שעולה על גדותיה. לאחר מכן, התחל להזרים מים נטולי יונים דרך משאבת הרולר במהירות משתנה של Master flex LS במהירות של 0.6 מיליליטר לשעה.

טפל ברקמה בזהירות כדי להבטיח שהבועות ייצאו מהקצה הדיסטלי. לאחר הוצאת כל הבועות מהצינוריות, העבירו את המכשיר לחדר הקירור. לאחר מכן התחל את תהליך הדה-סלולריזציה על ידי החדרת לומן המעי ועץ כלי הדם במים זורמים נטולי יונים למשך 24 שעות במהירות של 0.6 מיליליטר לשעה במהלך השעה הראשונה.

בדוק את המכשיר באופן קבוע כדי לוודא שכל החיבורים מאובטחים. הדליפה מינימלית ואין בועות בתוך המעי. לאחר 24 שעות, העבר את מנגנון הדסלולריזציה בחזרה לטמפרטורת החדר.

צבע המעי היה צריך להשתנות לוורוד בהיר מתחת למכסה המנוע. שקלו מספיק ציפוי נתרן דאוקסי כדי ליצור תמיסה של 4% ב-300 מיליליטר מים נטולי יונים. השתמש במערבולת כדי לערבב את התמיסה עד שהיא צלולה.

כעת, החלף את התמיסה נטולת היונים בנתרן דאוקסי קולאט. בדוק את החיבורים. הסר את כל הבועות והחדיר את המעי הדק ב -0.6 מיליליטר לשעה למשך ארבע שעות.

לאחר שלב איסוף הנתרן דאוקסי, הרקמה הופכת שקופה. תחזוקת רשת כלי הדם מתבררת גם לאחר הוספת PBS AA למשאבה. שטפו את המעי עם PBS AA למשך 30 כדי למנוע אינטראקציות בין הנתרן דאוקסי, הציפוי וה-DNA.

ואז לחלחל את הרקמה עם DNA טרי שהוכן, אחד בטמפרטורת החדר במהירות של 0.6 מיליליטר לשעה. לאחר שלוש שעות, העבירו את הפיגום למכסה המנוע לתרבית רקמות ובעזרת טכניקת ספיגה, החליפו את הצלחת. עקר מחדש את הצינור של המשאבה הפריסטלטית על ידי הזרמת אתנול דרכו.

שטפו את המעי בפעם האחרונה עם P-B-S-A-A למשך 30 דקות כדי להבטיח שכל שאריות תמיסות הדה-סלולריזציה יוסרו. לבסוף, העבר את הפיגום לקישור צולב UV והפעל שני מחזורי עיקור. לאחר מכן אחסן את הפיגום ב-P-B-S-A-A.

החלפת הפתרון כל שלושה ימים. לאחר דה-סלולריזציה מוצלחת, הפיגום צריך להיות בעל מראה מקרוסקופי הדומה לזה של המעי הילידי, אך עם קירות שקופים. שימור ארכיטקטורת המאקרו צריך להיות ניכר גם על ידי הסבלנות של עץ כלי הדם.

כאשר מוזרק צבע דרך צינורית ה- SMA, עליו להתפזר באופן שווה בכל הפיגום ולהגיע לעץ הנימים. הפיגום צריך להיות נקי מחומר גרעיני וציטופלזמי, דבר שניתן להעריך. באמצעות ערכת כימות DNA וניתוח היסטולוגי פשוט, צביעת המטין ואואין אמורה להדגים היעדר חומר גרעיני וציטופלזמי תוך שמירה על שכבות המעי הקטנות כפי שמודגם בתמונה זו.

בפרט, התחזוקה של הווילי והקריפים בצד הלומינלי צריכה להיות ניכרת לאחר מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. יש לצפות גם לשימור נוסף של רכיבי המטריצה החוץ-תאית כגון קולגן, אלסטין וגליקו אמין גליקנים כפי שמוצג כאן. לדוגמה, צביעת Massen Tri CHRO מאפשרת הדגמה של רקמת החיבור השלמה בפיגום.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור את פיגום המעי הטבעי של הסלולר.