ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell
18 בנובמבר 2013
אנחנו מציגים את פרוטוקול לדור של מספרים גדולים (אלפים למאות אלפים) של-וגודל הספרואידים אחידים בשליטת הרכב גידול, באמצעות צלחות microwell זמינות מסחרי.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר מספר רב של ספרואידים גידוליים מבוקרים בגודל אחיד. זה מושג על ידי הכנת לוחות המיקרו-באר כדי לאגד את התאים שייווצרו לסטרואידים. כשלב שני, נקצרת תרבית מסוג התא הרצוי, המספקת את תרחיף התאים הקובע את גודל והרכב ה-OIDs.
לאחר מכן, תרחיף התאים עובר צנטריפוגה לתוך בארות המיקרו ומודגר על מנת לאפשר לסטרואידים להיווצר לאחר הדגירה. הסטרואידים המתקבלים הם אחידים מאוד וניתן לאסוף אותם או לתרבית אותם בבארות המיקרו שבהן הם נוצרו. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שניתן לייצר מספר גדול מאוד של אגרגטים אחידים בו זמנית.
אנשים חדשים בשיטה זו עשויים לגלות שהדלק שלהם גדול מאוד. חשוב לוודא שמתלה התא מפוזר באופן שווה על פני הצלחת, ושנושאי הלוחות המתנדנדים בפוגה המרכזית נעים בחופשיות כך שהכוח יהיה בניצב לפני השטח. כדי להתחיל, הכינו צלחת באר אגרו סטרילית 400 על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של חומר פעילי שטח המכיל תמיסת שטיפה לכל באר.
שימוש בחומר פעילי שטח מבטיח שהתאים לא יתקשרו עם פני השטח של המיקרו באר. כדי להימנע מלכידת בועות אוויר בבארות המיקרו, הוסף נוזל בצד אחד ואפשר לו להתפשט על פני השטח במקום להפיל אותו אנכית על פני השטח. לאחר הוספת התמיסה לבארות, החזר את המכסה.
ודא שהרוטור מאוזן כראוי לפני צנטריפוגה של הלוחות למשך שתי דקות ב-2000 פעמים G.To הסר בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה נמוכה, ודא שהבועות הוסרו מבארות המיקרו. דגרו את הצלחת למשך 30 דקות לפחות עם מכסה בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את תמיסת השטיפה מהבארות ושטפו את הצלחת במים סטריליים או PBS מיד לפני השימוש.
אל תאפשר לצלחות להתייבש לאחר הקידוד. פרטי הכנת התא ישתנו בהתאם לסוג התא הספציפי הנחקר. עם זאת, ראינו שמצב זה יעיל עבור מגוון רחב של תאים, כולל הקווים שדנו בהם כאן, כמו גם תאי גזע עובריים אנושיים ונוירונים, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים, פיברובלסטים, אנדון משוער, פרימיטיבי ותאי סטרומה להכנת תאים, התחל עם בקבוק T 75 של תאי HT 29.
שאפו מצע גידול מהבקבוק, והוסיפו שלושה מיליליטר טריפסין. דגרו על התאים למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עצור את עיכול הטריפסין על ידי הוספת שלושה מיליליטר של מדיום גידול.
מעבירים את השאר לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לאחר מכן משפופרת של 15 מיליליטר, קח אליקוט לספירת תאים. צנטריפוגה של התאים למשך חמש דקות במהירות של 200 פעמים G בזמן שהצנטריפוגה בעיצומה.
ספור את התאים. לאחר מכן, שאפו את תערובת הטריין הבינונית והחליפו אותה בצמיחה טרייה. בינוני בנפח שנקבע על-ידי צפיפות התאים הנדרשת שחושבה בעבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט כשלב אופציונלי.
העבירו את מתלה התאים דרך מסננת על מנת להסיר גושים. ספרואידים עשויים להיווצר במגוון פורמולציות מדיום, אולם יש לבצע ניסויים ראשוניים באמצעות המדיום שבו התאים גודלו. כדי להבחין בין ההשלכות של מעבר למערכת תרבית תלת מימדית לבין השלכות של שינוי הרכב המדיום, התחל בהוספת 0.4 מיליליטר של מצע גידול לכל צנטריפוגת באר למשך שתי דקות ב-2000 פעמים G.To להסיר בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה נמוכה, לוודא שהבועות הוסרו מבארות המיקרו
.לאחר מכן, הוסף 0.4 מיליליטר של תרחיף תאים בצפיפות הנדרשת לבארות המיקרו. לאחר מכן ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות אוויר לבארות המיקרו, וודאו שהתאים מפוזרים באופן שווה בכל הבאר. כדי להשיג סטרואידים עקביים.
צנטריפוגה את הצלחת למשך חמש דקות בשעה 200 פעמים. G, הצלחת חייבת להיות מאוזנת מבפנים כמו גם כנגד הצלחת השנייה כך שהמשקל יתפזר באופן שווה לשני צידי מנשא הצלחת. זה מבטיח שהצלחת מתיישבת במהלך הצנטריפוגה, כך שזרמי הסעה לא יתעוררו ויגרמו לפיזור לא אחיד של תאים על פני בארות המיקרו
.באמצעות מיקרוסקופ הפוך, ודא שהתאים התקבצו בתוך בארות המיקרו ושהם מפוזרים באופן שווה על פני הבאר לפני הדגירה של התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. התבונן בתהליך היווצרות הכדור באמצעות מיקרוסקופ הפוך. חלק מקווי התאים ייצרו סטרואידים קומפקטיים תוך 24 שעות.
אחרים עשויים לקחת זמן רב יותר. ההתקדמות מאשכול לצבירה בתאי HT 29 מוצגת כאן. החלק הקשה ביותר בהליך זה הוא להוציא את סטרואידים האינטקס מבלי להפריע למבנים כדי לחלץ סטרואידים מבארות מיקרו צנרת למעלה ולמטה בעדינות רבה כדי לאפשר לספרואידים לצאת מבארות המיקרו
.לאחר מכן הטה את הצלחת כדי לשאוב את תערובת הסטרואידים הבינונית. השתמש בקצות פיפטה רחבות לסטרואידים בגודל גדול יותר כדי למנוע פירוק הסטרואידים. לאחר החזרת הסטרואידים מבארות המיקרו, העבירו לתרבית המתלים על ידי סילוקם בעדינות החוצה עם פיפטה.
לחלופין, ניתן לשמור על הוורד החמור בהתקף עם תחליף בינוני. משך הזמן תלוי בגודל ההתחלתי ובקצב הגידול, המגדיר את הזמן עד שהם גדלים מעבר לבארות המיקרו. ובכן, הם נוצרו כדי להחליף את המדיום מבלי לאבד סטרואידים.
שאפו את המדיום בקצה הבאר. בעזרת פיפטת מרעה, הורידו לאט את הקצה כלפי מטה עד שהוא מתחיל לשאוב נוזלים מהמניסקוס ועקבו אחר המניסקוס כלפי מטה כשהוא יורד. לאחר מכן מוסיפים מדיום טרי על קיר הבאר באותו מקום.
בעת הוספת המדיום הטרי, זכור לדחוף את הצנרת בעדינות ולהשאיר את הקצה צמוד לקיר כדי למנוע הפרעה של ה-PHE במיקרו-בארות. כמה סטרואידים עלולים ללכת לאיבוד. עם זאת, אם תמיד שואבים מדיום ומוחלפים באותו מיקום, מספר זה יישאר קטן.
בהשוואה למספרים הגדולים בבאר, סטרואידים מקווי גידול מרובים ממקורות אנטומיים שונים עשויים להישלף בקלות לתרחיף. בקרת הגודל העקבית שניתן להשיג בשיטה זו מודגמת כאן עם אוכלוסיות סטרואידים אחידות מאוד. תחת כל תנאי נוצר מ-700 או 1,500 תאים.
הבדלים ברורים בהתנהגות נראים גם עם תאי סרטן המעי הגס HT 29 ושישה תאי סרטן הוושט TE היוצרים סטרואידים צפופים עם גבולות מוגדרים בחדות. לעומת זאת, תאי סרטן הערמונית מולידים סטרואידים פחות קוהרנטיים עם גבולות לא סדירים. הכוחות הפנימיים החזקים יותר באגרגטים הקוהרנטיים יותר הביאו גם הם לקריסה לצורה סימטרית יותר, גם בעודם במיקרו-בארות שבהן הם נוצרו.
עם זאת, אגרגטים של כובע הלין, במיוחד בגודל הגדול יותר, שומרים באופן גלוי על הגיאומטריה הפרמטאלית המרובעת של בארות המיקרו לאחר שליטה, תהליך זה יכול להתבצע תוך כשעה בתוספת תקופת הדגירה הנדרשת לתאים להיצמד ולייצר נוזלים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לוודא שמבעבע עוד אחד, נוסע בבארות המיקרו לפני הוספת התאים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירה של מספרים גדולים של ספרואידים גידוליים אחידים, עם בקרה על הגודל וההרכב, באמצעות פלטות מיקרו-בארים (microwell plates) הזמינות מסחרית. שיטה זו מאפשרת יצירה סימולטנית של אלפים עד מאות אלפי ספרואידים, ומספקת יתרון משמעותי על פני טכניקות קיימות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אונקולוגיה
רקע
- ספרואידים של גידולים אחידים חיוניים למחקרים ביולוגיים שונים.
- שיטות קיימות ליצירת ספרואידים סובלות לרוב מחוסר ביכולת להרחבה (scalability).
- פרוטוקול זה נותן מענה לצורך ביצירת ספרואידים בתפוקה גבוהה.
- פלטות מיקרו-בארים (Microwell plates) מאפשרות אגרגציה מבוקרת של תאים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה אמינה ליצירת ספרואידים של גידולים אחידים.
- שיפור היעילות של ייצור ספרואידים עבור יישומים מחקריים.
- אספקת פרוטוקול שניתן להתאים לסוגי תאים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פלטות מיקרו-בארים עם תמיסת שטיפה המכילה חומר פעילי שטח.
- צנטריפוגציה של תרחיפי תאים להבטחת פיזור אחיד.
- אינקובציה של הפלטות לאפשר התגבשות ספרואידים.
- הוצאה ותחזוקה של הספרואידים בתרבית.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של ספרואידים גידוליים אחידים בכמויות גדולות.
- הדגמה של קיבץ תאים יעיל בתוך מיקרו-בארים.
- תצפית על דינמיקת היווצרות הספרואידים בקווי תאים שונים.
- תיקוף של התמימות של השיטה לסוגי תאים מגוונים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר יצירה בשטח רחב (high-throughput) של ספרואידים של גידולים סרטניים.
- הוא מציע פתרון ניתן להרחבה עבור חוקרים בביולוגיה של התא ובאונקולוגיה.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול בדיקת תרופות ומודלים של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ספרואידים של גידולים, אחידים ובשליטת גודל המיוצרים בקנה מידה רחב, הם קריטיים לגילוי תרופות אונקולוגיות חזויות ולמחקר תרגומי. הפרוטוקול המבוסס על מיקרו-בארים מאפשר יצירה בש throughput גבוה של מודלים תלת-ממדיים של גידולים בעלי רלוונטיות פיזיולוגית, התומכים בפיתוח בדיקות חסון ובצמצום סיכונים מכניסטיים. יכולת זו מחזקת את תהליכי הגילוי המוקדם, הסריקה וזרימות העבודה הפרה-קליניות על ידי אספקת מערכות ביולוגיות כמותיות וניתנות לשחזור.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של ביולוגיית הגידול בהקשר תלת-ממדי מבוקר לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מידול של אינטראקציות תא-תא ותא-מטריקס הרלוונטיות לגידולים in vivo.
- מעניק ביטחון חיזוי בהערכה של תרכובות בשלבים מוקדמים על ידי הפחתת השונות בקריאות הביולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק אוכלוסיות ספרואידים סטנדרטיות וניתנות לשחזור לצורך סריקה כמותית בתפוקה גבוהה.
- מאפשר התרחבות של הבדיקה (scalability) ושימוש חוזר בפלטפורמה על ידי יצירת מאות עד אלפי ספרואידים אחידים לכל פלטה.
- משפר את המהימנות של הערכות יעילות ורעילות של תרכובות במערכות רלוונטיות פיזיולוגית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים in vitro למבנה גידול הרלוונטי למחלה עבור מחקרי ביומרקרים תרגומיים.
- תומכת ברציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי מתן אפשרות ליצירת מודלים עקביים על פני קווי תאים שונים.
- מפחיתה את הסיכון לכשל ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי אספקת נתונים פרה-קליניים חזקים וניבויים.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
שיטה זו לייצור ספרואידים המבוססת על מיקרו-בארים משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד למחקר פרה-קליני, ובכך מאפשרת העברה רציפה של מודלים מתוקתקים בין צוותי מחקר ופיתוח.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים במודלים של גידולים בתלת-ממד.
- סריקה: מספק ספרואידים הניתנים לבדיקה וניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות ומיון פגיעות (hit triage).
- אנליטיקה: מספק פלטים כמותיים ומבוקרי גודל לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מסייע בהתאמת סממנים ביולוגיים ובבחירת מודלים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה לסוגי תאי גידול מגוונים ולצרכי מחקר שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים אונקולוגיים.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימת העבודה באמצעות ייצור ספרואידים סטנדרטי בעל תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך פיתוח (go/no-go) ויעילות הון על ידי הפחתת שונות ביולוגית.
- השפעה על הפורטפניו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום נכסי אונקולוגיה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים וטיפול במודלים תלת-ממדיים להשגת הדירות אופטימלית.
- נדרשת גישה לציוד צנטריפוגה, מיקרוסקופיה הפוכה ותשתית לטכניקה סטרילית.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים להכנת תרחיפי תאים ולטיפול בפלטות.
- ניתן להתאים למגוון סוגי גידולים ותאי גזע, אך עשוי להיות נדרש אופטימיזציה ראשונית עבור שורות תאים חדשות.
- נדרש טיפול זהיר כדי למנוע פריצה של הספרואידים במהלך החילוץ והחלפת המצע.
