כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בפלואורסצנציה כדי לכמת את תגובת הפרץ הנשימתי. ראשית, העבירו את עוברי דג הזברה לבארות של פלטת 96 בארות. לאחר מכן, הוסיפו סובסטרט פלואורסצנטי והפעילו את הפרץ הנשימתי באמצעות חומר כימי.

לאחר מכן, כמת את הפלואורסצנציה היחסית באמצעות פלואורימטר. בסופו של דבר, הפלואורסצנציה משמשת להדגמת פוטנציאל הburst הנשימתי. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון כיצד מניפולציות ניסיוניות משפיעות על הבריאות הכללית של מערכת החיסון המולדת.

כאן אנו משתמשים בשיטה זו כדי לספק תובנות לגבי הפריצה הנשימתית (respiratory burst) של עוברי דגי זברה, אך ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות כגון דגי זברה בוגרים, תאי כליה והכנות תאים ממיני דגים אחרים. גדלו את העוברים בצלחות פטרי עמוקות בטמפרטורה של 28 °C במי ביצים עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. הסירו עוברים מתים מדי יום.

שפכו בזהירות את מי הביצים הישנים והחליפו אותם במי ביצים חדשים מדי יום. ביום הניסוי, הכינו תמיסת עבודה מדוללת של fluorescein בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.7 milliliter העטופה ברבד נייר אלומיניום. הכינו בנוסף תמיסת עבודה של PMA בריכוז סופי של 20 micrograms per milliliter.

לאחר מכן, הכינו חמישה מיליליטר של כל תמיסת מינון במבחנות קוניות בנפח 15 מיליליטר כפי שמתואר בטקסט המצורף. שמרו את תמיסות המינון על קרח, ראשית הפעילו את קורא המיקרו-פלייטים וחממו את מקור האור למדידת הפלואורסצנציה. הגדירו תוכנית המפרטת את אורכי הגל של העירור והפליטה, את רגישות מיקום האופטיקה, ושלבו גם שלב ניעור של חמש שניות.

לפני תחילת הניסוי, הכינו את הציוד הניסויי: צלחות עם עוברים מצופים, מיקרופלטה שחורה בעלת 96 בארות, פ pipette P 200 עם טיפים, ודלי קרח עם הריאגנטים המכילים פלואורסצאין. הכינו בנוסף pipette P 200 רב-ערוצית, שני מאגרי נוזלים סטריליים, נייר אלומיניום ומספריים.

כעת גזרו קצה של טיפ פטה כך שהעוברים או הכליות יוכלו לעבור דרך הפתח. כוון פטט P 200 ל-100 µL והעבירו עובר אחד יחד עם מי ביצים למספר המבארות הרצוי במיקרופלט שחור בעל 96 מבארות. כעת שפכו את תמיסת המינון למאגר סטרילי של 25 mL באמצעות פטט P 200 רב-ערוצי.

הוסיפו 100 µL של תמיסת מינון H 2D CFDA לעמודה אחת של מיקרופלטה בעלת 96 בארות; חזרו על הפעולה עבור מחצית מדגימות העובריים של קבוצת הביקורת ומחצית מדגימות העובריים שעברו מניפולציה ניסיונית. שפכו את תמיסת המינון המכילה PMA למכל סטרילי חדש בנפח 25 mL.

לאחר מכן, חלק את תמיסת המינון למנות (aliquots) בשאר הבארות של מיקרופלייטה בעלת 96 בארות. כסה את המיקרופלייטה בנייר אלומיניום והנח אותה על שייקר למשך כ-20 שניות. כאשר המיקרופלייטה אינה נסרטת, הדגר אותה בטמפרטורה של 28 °C במהירות של 150 RPM.

קראו את המיקרופלטה לאחר הוספת PMA. המשיכו לבצע מדידות מדי מספר דקות למשך פרק הזמן הרצוי, או דגרו את המיקרופלטה העטופה ברדיד אלומיניום בטמפרטורה של 28 °C עד לנקודת זמן קבועה. לאחר מכן, הוציאו את העוברים מהבארים והמיתו אותם בהומניוטיקה בהתאם לפרוטוקול המוסדי לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

בנוסף, השליכו את המיקרו-פלטה וחומרים חד-פעמיים אחרים לסרט פסולת ביולוגית מסוכנת. קבעו את נקודת הזמן שבה תרצו להשוות את הפלואורסצנציה. הפחיתו את ערך הפלואורסצנציה הממוצע של קבוצת הביקורת ללא השראה מערכי הפלואורסצנציה האינדיבידואליים של קבוצת הביקורת שהושראה על ידי PMA.

חזור על פעולה זו עבור הקבוצה הניסויית עם ובלי PMA. לאחר מכן, שמור את ערכי הפלואורסצנציה המנורמלים בעמודות: קבוצת הביקורת בתוספת PMA וקבוצת הניסוי בתוספת PMA. בשלב הבא, חשב את הממוצעים ואת הסטיות התקניות עבור ערכי הפלואורסצנציה המנורמלים של קבוצת הביקורת בתוספת PMA ושל קבוצת הניסוי בתוספת PMA.

השוו את ערכי הפלואורסצנציה הנורמליים באמצעות מבחן T למדגמים בלתי מזווגים (unpaired T-test) כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית. כעת, הציגו בגרף את הממוצעים של קבוצת הביקורת בתוספת PMA ושל הקבוצה הניסויית בתוספת PMA, עם פסי שגיאה המשקפים את סטיות התקן המתאימות; רשמו את רמת המובהקות על הגרף ובלגנדת האיור. ניסוי זה משווה את תגובת הפרץ הנשימתי (respiratory burst) בעוברים של דגי zebrafish מסוג wild type מרקע AB, ב-48 שעות וב-72 שעות לאחר ההפריה.

הפלואורסצנציה הגולמית נמדדה ארבע שעות לאחר הוספת PMA בקבוצות שעברו השראה על ידי PMA. ערכי הפלואורסצנציה הגולמית היו גבוהים יותר באוכלוסיית ה-72 HPF. כפי שמעידים ערכי הממוצעים המחושבים, ערכי הפלואורסצנציה נורמלו כדי להתחשב בשונות ברמות הרקע של הפלואורסצנציה.

תוצאות בדיקת פרץ הנשימה (respiratory burst assay) זו העלה כי עוברי דג זברפיים בגיל 72 HPF מסוגלים לייצר כמות גדולה משמעותית יותר של רדיקלי חמצן, ולפיכך להוביל לתגובת פרץ נשימה חזקה יותר מאשר עוברי 48 HPF לאחר השראה באמצעות PMA. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בפלואורסצנציה לכימות פוטנציאל פרץ הנשימה של עוברי דג זברפיים. זכרו כי עבודה עם אבקת PMA עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון חבישת מסכה בעת שקילת אבקת ה-PMA.