Biopolymers מבוסס חומצת Polymalic ננו עבור מיקוד של גידול סמנים מרובים: הזדמנות לרפואה מותאמת אישית?
13 ביוני 2014
דוגמא של תרופה הננו על בסיס חומצת polymalic מוצגת לקראת תכנון רציונלים של רפואה אישית כי הוא ישים לסרטן. הוא מתאר את הסינתזה של תרופת ננו לטיפול בסרטן השד אנושי מסוג HER2 חיובי בעכבר בעירום.
המטרה הכוללת היא לבסס פלטפורמה בקנה מידה ננומטרי הפתוחה לפרוטוקול אוניברסלי לסנתזה של רפואה מותאמת אישית על בסיס המטען הגנטי של מחלתו של אדם, ובמיוחד עבור סרטן. ראשית, ייצרו וטהרו poly malic acid מהמיקרואורגניזם frum polycephalum; הפעילו כימית את ה-PMLA המטוהר בקבוצות הקרבוקסיל התלויות שלו. הצמידו קבוצות פונקציונליות קטנות ואת המקשר MEA על ידי החלפה של הקבוצות המופעלות, והחזירו את הקבוצות המופעלות שלא נעשה בהן שימוש לקבוצות קרבוקסיל באמצעות הידרוליזה.
בשלב הבא, הוסיפו את הנוגדנים ואת המולקולות האנטי-סנס (antisense) באמצעות קבוצות הסולפ-הידרו של הספייסר (spacer), MEA והכיסוי (cap). לאחר השלמת התגובה עם PDP, בדקו את הרכב התמיסה ואת התפקוד של הליגהנד (lead). תוצאות התרופה הננו-מטרית התקבלו ממודל של בעלי חיים, כגון עכברים הנושאים גידול אנושי אגרסיבי.
בדיקה חיובית ל-HER2 בסרטן השד יכולה לקבוע את יעילות הטיפול וכן האם הטיפול הוא ללא תופעות לוואי בלתי רצויות. היתרון המרכזי של ייצור ביולוגי על פני שיטות סינתטיות קיימות, כגון פולימריזציה פותחת, הוא שהביו-פולימר שומר על טוהר אופטי מלא ואינו מזוהם בתוצרי לוואי. משפחה זו של ננו-תרופות PolyPhen יכולה להתמקד בכל סוג תא על בסיס מיקוד ספציפי ולהסדיר ביטוי של חלבונים.
באופן כללי, טיפול בסרטן באמצעות תרופות ננויות מסוג PHE יעיל מאוד במספר מודלים של בעלי חיים, ובמיוחד בסרטני מוח ושדיים ראשוניים. ראשית עלה בדעתנו להשתמש בשיטה זו כדי לחסום את הסינתזה של למינקים ספציפיים לגליובלסטומה בצורות איזוֹ, ומאוחר יותר הוכחנו את התמיקה והעיכוב של חלבוני HER2 וסרטן השדיים השלישי-שלילי כדי למנוע את צמיחת הגידול. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות עד לאבחון סרטן באמצעות דימיון אופטי ותהודה מגנטית.
תרופות פולי-ננו (Poly nano drugs) יכולות לספק תובנות לגבי הולכת תרופות לטיפול בסרטן. ניתן ליישמן גם במצבים פתולוגיים אחרים, כגון מחלות זיהומיות, שיכוך כאבים והפרעות נוירולוגיות. לאחר גידול של תרבית זרע פלסמודיום (plasmodium) מספירל על בורג, יש להחדיר אותה ל-100 milliliters של מצע גידול בסיסי ולגדל את התרבית בטמפרטורה של 25 degrees Celsius.
אינקובטור בעל טמפרטורה קבועה מייצר כמות של מצע מיקרופלזמה דחוס בכבידה תוך מניעת חשיפה לאור. כדי למנוע ספורולציה בכלי ביו-ריאקטור בנפח 10 ליטר, המיסו 80 גרם של calcium carbonate בשמונה ליטרים של מצע בסיסי, לאחר מכן העבירו את מצע המיקרופלזמה הדחוס אל כלי התגובה המותקן והגדירו את הביו-תהליך ל-75 שעות. בטמפרטורה של 25 °C בזרימה של 10 ליטר לדקה של אוויר מסונן ובערבול של 150 RPM באמצעות בוחן מקטעי.
כאשר ציר התרבית מגיע ל-pH של 4.8, יש להפסיק את גידול התרבית כדי למדוד את ייצור ה-poly maleic acid. כעת קהרו את ציר התרבית ל-17 °C, אפשרו לתאים לשקוע בכוח הכבידה והסירו את הנוזל העליון (supernatant) מהריאקטור. כוונו את ה-pH ל-7.5.
כעת הזרים את העליליות מהתחתית דרך עמודת DEAE cellulose בנפח 1.5 ליטר, שהושרה עם 20 millimolar tris hydrochloride pH 7.5 בטמפרטורה של חמישה מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבר שלושה נפחים של באפר שטיפה המכיל 0.3 molar sodium chloride מהתחתית לראש העמודה, ואלואה את ה-PMLA בנוכחות 0.7 molar sodium chloride. התאם את פראקציית ה-PMLA שאלואתה לריכוז של 0.1 molar calcium chloride והוסף 80% ethanol קר במיוחד כדי להשקיע את ה-PMLA calcium. לאחר מכן, בצע הפרדה של ה-PMLA calcium באמצעות cidex G 25 ומים.
לבסוף, העבירו כל פראקציה דרך עמודת אור ענברי והקפיאו מיד את הזרימה דרך חומצה פולי-מלית בחנקן נוזלי, ובצעו ליופיליזציה לפני האחסון בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. כדי להפעיל את קבוצות הקרבוקסיל של PMLA, ערבבו 1 mmol של יחידות מלאון של PMLA ב-1 ml של אצטון ללא מים ו-1 mmol מכל אחד של hydroxy CIN aide ו-cylo heyl carbo ide ב-2 ml של dimethylformamide; לאחר ערבוב בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות, הוסיפו 0.05 mmol של methyl Pega mean ב-1 ml של DMF, ולאחריהם 0.05 mmol של triethylamine.
לאחר מכן, הוסיפו בטיפות 0.4 millimoles של leucine ethyl ester, ולאחר שעה בדקו את השלמת התגובה באמצעות תגובה שלילית של hyn בכירומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC). באופן דומה, הוסיפו 0.1 millimoles של two me capto, one ethylamine ו-0.5 millimoles של TEA. הסירו את שאריות ה-NHS ester באמצעות הידרוליזה ספונטנית עם phosphate buffered saline.
בצעו הסמכה בעזרת עמודת PD 10 וליופיליזציה כדי לקבל אבקה לבנה; אחסנו קונג'וגט מקדים זה במצב יבש בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו 30 milligrams של נוגדן ב-4.5 milliliters של 150 millimolar sodium chloride ב-100 millimolar sodium phosphate ב-pH 5.5. הפחיתו את קשרי הדיסולפיד באמצעות 5 millimolar tris, two carboxy ethyl phosphine hydrochloride, וטהרו בעזרת עמודת PD 10.
כעת המיסו את ה-IDE PEG IDE בשני מיליליטר של הבאפר שלמעלה, ב-pH 6.3. הוסיפו את הנוגדן המרוחב וערבבו בטמפרטורה של 20 degrees Celsius למשך שעה אחת. רכזו ל-2.5 milliliters באמצעות AVEVA spin 20 עם סף הפרדה של 30 kilodalton ולאחר מכן טהרו באמצעות cidex G 75.
כעת יש לאמת את המוצר באמצעות SEC HPLC. מדדו את הכמות ב-280 ננומטר ואששו גם את היעדרם של זיהומים באורכי גל אחרים. לאחר מכן, ערבבו 50 מיליגרם של ה-pre conjugate עם 200 MLEs של ה-antibody conjugated PEG IDE בחמישה מיליליטר של באפר pH 6.3.
כוון את ריכוז ה-sulf hydro ל-2 mM והדגר ב-20 °C למשך שלוש שעות. כדי להשיג נבואת solubilize של 98%, הגב את ה-three prime amino antisense oligonucleotide עם נפח אחד של SPDP, טהר את ה-A-O-N-P-D-P באמצעות cidex LH 20 במתנול, לאחר מכן איד את המתנול, המס את המוצר במים ובצע ליופיליזציה. כעת הדגר 800 nM של ה-aos המופעלים יחד עם antibody PEG pre conjugate ל-MEA SH למשך הלילה. כאשר תגובת ה-diss sulfide exchange מסתיימת, שלב את ה-fluorescent dye block, חסום את ה-sulf hydros העודפים באמצעות PDP וטהר באמצעות cidex G 75.
יש לאחסן את התרופה הננומטרית הסופית המבוססת על poly malic acid בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. כדי להעריך את תכולת ה-poly maleic acid במהלך הייצור, פעל באופן הבא: ל-320 µL של דגימה הוסף 160 µL של hydroxyl ammonium chloride בריכוז 10% ו-160 µL של sodium hydroxide בריכוז 10%. לאחר 10 עד 15 דקות, ערבב עם 160 µL של תמיסת ferric chloride בריכוז 5% ובדוק את היווצרות צבע סגול כהה באורך גל של 540 nm. לאחר מכן, בצע הידרוליזה לתרופה הננומטרית למשך לילה ב-hydrochloric acid בריכוז 2 M בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס באמצעות אמפולה אטומה; נתר על maleic acid באמצעות reversed phased chromatography.
השתמשו בדגימות שהועשרו בתמיסות סטנדרט של חומצה מאליאית. כעת, בצעו פילוּג של הננו-תרופה באמצעות 100 millimolar dithiothreitol ומדדו את ה-morpholino antisense oligonucleotides באמצעות quantitative reversed phase HPLC אל מול תמיסות סטנדרט של morpholino ON. השתמשו בננו-תרופה המפולגת כדי למדוד את תכולת הנוגדנים באמצעות ערכה לבדיקת חלבונים לצורך כימות תכולת ה-Maleimide PEG.
ראשית, בצע תגובה עם ammonium OT thiocyanate, לאחר מכן בצע מיצוי באמצעות כלורופורם ומדוד את הבליעה באורך גל של 510 nanometers. בחן את פעילות הנוגדן ואת ה-co ligation באמצעות Eliza תוך שימוש ב-5 µL של nano drug לכל באר וב-0.5 µg לכל באר של her two כאנטיגן לציפוי הפלטה. לבסוף, חשב את האחוז שהושג עבור antisense oligonucleotide, EG ואנטיגודן ביחס לחומצה מאליאית.
השווה לאחוז המיועד על פי תכנון התרופה. גישה אסטרטגית זו, בעלת שני מצבים (bimodal), לתרופת הננו משתמשת ב-Herceptin כדי לעכב את נתיב האיתות של HER2 וב-a ON ספציפי ל-HER2 כדי לחסום את שעתוק הקולטנים של HER2; נוגדנים אלו מקלים על טרנסציטוזה באמצעות TFR אנדותליאלי של כלי הדם בגידול. פלטפורמת הננו-קונג'וגט poly maleic acid הופקה על ידי תרבית של micro plasmo וטיהרה; הפעלת קבוצות הקרבוקסיל של ה-PMLA הקלה על סינתזה של פיגום הקונג'וגט המוקדם.
ולסיום, התצמיד הננו-מוביל. בדיקות ELISA הדגימו שימור של נוגדנים מונוקלונליים פעילים לאורך סינתזת התרופה הננומטרית. כאשר שני הנוגדנים רכבו על אותה פלטפורמה פולימרית, מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית עקבה אחר הספיגה התאית של התרופה הננומטרית.
התמונות החופפות בנקודות הזמן של אפס ושלוש שעות נותחו יחד עם האנדוזומים המסומנים. מקדמי המתאם של פירסון (Pearson's correlation coefficients) עבור קולוקליזציה מעידים על שחרור הננו-תרופה מהאנדוזומים אל הציטופלזמה ועל התנתקות ה-ON מהננו-תרופה על ידי שבירה של קשרי דיסולפיד התלויה בגלוטתיון בציטופלזמה. In vitro, הננו-תרופה המובילה עיכבה את הצמיחה באופן משמעותי ובמיליות היעילות ביותר בקו התאים עם ביטוי יתר של HER2.
ניסויים in vivo בעכברים הנושאים גידולי BT 4 74, סרטן שד אנושי עם ביטוי יתר של HER2, הראו עיכוב גדילה של למעלה מ-95% על ידי תרופת הננו המובילה המכילה Herceptin. ובדיקת Western blotting ex vivo ספציפית ל-HER2 הצביעה על עיכוב הן של סינתזה של HER2 והן של פוספורילציה של AKT; שסוע של PARP סימן אפופטוזיס. נסיגת הגידול בתגובה לטיפול התרופתי הודגמה על ידי התכווצות הגידול ודילול תאי הגידול בבדיקה היסטולוגית.
כעת צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בפלטפורמה ננו-ביוקומפטבילית כדי להשיג טיפול מותאם אישית יעיל ללא תופעות לוואי, וליצור ננו-תרופה בעלת הרכב מבוקר ופעילות תפקודית מאומתת. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את החששנים הללו עם הדירות גבוהה לאחר פיתוחם. טכניקה זו, המשתמשת בפלטפורמת ננו של poly acid acid למסירה ממוקדת של antisense oligonucleotides, סוללת את הדרך לחוקרים בתחום רפואת הננו המותאמת אישית לבחון טיפול בגידולים המכוון למסמני גידול מולקולריים ספציפיים שזוהו באמצעות אנליזה גנטית מותאמת אישית. חומרים פעילים תרופתית ותאים עלולים להיות מסוכנים ביותר.
יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת מסכה וענידת כפפות, בעת ביצוע פרוצדורה זו.
סקירה כללית
מחקר זה מציג תרופה ננומטרית המבוססת על polymalic acid לטיפול מותאם אישית בסרטן, המכוון ספציפית לסרטן שדיים Her2-positive במודל של עכבר עירום (nude mouse). המחקר מפרט את הסינתזה ואת היישומים הפוטנציאליים של תרופה ננומטרית זו בטיפול בסרטן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ננו-רפואה
- טיפול בסרטן
- סינתזה של ביו-פולימרים
רקע
- הרפואה המותאמת אישית שואפת להתאים טיפולים על בסיס פרופילים גנטיים אינדיבידואליים.
- חומצה פולימלית (PMLA) היא ביופולימר בעל פוטנציאל למערכות להמסרת תרופות.
- טיפולים נוכחיים בסרטן חסרים לעיתים קרובות ספציפיות ועלולים להוביל לתופעות לוואי.
- תרופות ננומטריות יכולות לשפר את הדיוק ואת היעילות בטיפול בסרטן.
מטרת המחקר
- פיתוח פלטפורמה בננו-קנה מידה עבור סינתזה של טיפולים מותאמים אישית לסרטן.
- הערכת היעילות של תרופות ננו מבוססות PMLA בטיפול בסרטן השד Her2-חיובי.
- בחינת יישומים רחבים יותר של תרופות ננו במצבים פתולוגיים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ביו-פרודוקציה של PMLA מהמיקרואורגניזם Physarum polycephalum.
- הפעלה כימית של PMLA להצמדת קבוצות פונקציונליות.
- שילוב של נוגדנים ומולקולות antisense בתוך הננו-תרופה.
- בדיקת היעילות של הננו-תרופה במודלים של בעלי חיים.
תוצאות עיקריות
- התרופה הננומטרית המסונתזה הדגימה הובלה ממוקדת לתאי סרטן.
- מחקרי בעלי חיים הצביעו על יעילות משמעותית בהפחתת גדילת הגידול.
- שיטת הבי ייצור שימרה את הטוהר האופטי וצמצמה תוצרי לוואי.
- יישומים פוטנציאליים נשתרעים למחלות אחרות מעבר לסרטן.
מסקנות
- תרופות ננויות מבוססות PMLA מהוות גישה מבטיחה לטיפול מותאם אישית בסרטן.
- המחקר מדגיש את חשיבות הסינתזה של ביופולימרים בפיתוח תרופות.
- מחקרים עתידיים עשויים להרחיב את השימוש בתרופות ננויות בתחומי רפואה שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
ננו-ביופולימרים מבוססי חומצה פולימלית מאפשרים הובלה מדויקת של אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (antisense oligonucleotides) ונוגדנים לתאי גידול, ובכך תומכים בקידום טיפולים אונקולוגיים מותאמים אישית. פלטפורמה זו נותנת מענה להטרוגניות מולקולרית בגידולים על ידי מתן אפשרות למיקוד מודולרי של מספר סמני גידול, דבר המשפר את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובמחקר תרגומי. גישה זו מציעה תשתית ניתנת להרחבה (scalable), לא רעילה וניתנת לשחזור לפיתוח תרופות ביופולימריות מהדור הבא במגוון סדרות של תרופות אונקולוגיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מקל על בחינת מניעים גנטיים ספציפיים לגידול באמצעות השתקת גנים ממוקדת.
- מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות מועמדות באמצעות הובלה של אוליגוניוקלאוטידים אנטיסנסיים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אישור עיכוב של מסלולים במודלים הרלוונטיים למחלה.
- משפר את הביטחון החזוי להקדמת נכסים ממוקדי מולקולות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק פיגום ביו-פולימרי שעבר תיקוף לצורך הצמדה הדירה של רכיבי תיווך טיפוליים ומכוונים.
- מאפשר הערכה כמותית של טעינת נוגנים ואוליגו-נוקלאוטידים באמצעות HPLC ו-ELISA.
- תומך בסטנדרטיזציה של הרכב התרופה הננומטרית עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- מקל על הערכה מהימנה של ספיגת תרכובות ושחרור תוך-תאי in vitro.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים הרלוונטיים למחלה על ידי הדגמת יעילות בחיינוגרפטים של סרטן השד HER2-חיובי.
- מאפשר ניתוח של סמנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות עיכוב של סינתזה ואיתות של חלבוני המטרה.
- תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי אישור נסיגת גידול ואפופטוזיס in vivo.
- מספק רצף מפרופיל מולקולרי ועד לתיקוף פרה-קליני של טיפולים מותאמים אישית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פלטפורמה זו של ננו-ביו-פולימרים משלבת שלבים החל מגילוי ראשוני, דרך זיהוי מועמד תרופתי ועד לתיקוף פרה-קליני, ותומכת בהתאמה מודולרית לסממנים גשמיים שונים של גידולים ולפרופילים גנטיים מגוונים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי תפקוד גנים ותלות במסלולים באמצעות הובלה ממוקדת.
- סריקה: מבצעת סטנדרטיזציה של הרכב התרופה הננומטרית לצורך הערכה הדירה במערכות in vitro ו-in vivo.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות של טעינת תרופה, שחרור ועכבה של המטרה באמצעות HPLC, ELISA ודימוי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין פרופיל מולקולרי ליעילות תפקודית במודלים של בעלי חיים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה וביוקומפטבילית הניתנת להתאמה לסוגי גידולים ומטרות מולקולריות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, סקילביליים וניתנים לשחזור של סינתזת תרופות ננו.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בקווי פיתוח של תרופות לאונקולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים לטיפול מותאם אישית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיה של ביופולימרים, הנדסת נוגדנים וצימוד אוליגוניוקליאוטידים.
- דורש גישה לתשתיות אנליטיות עבור HPLC, ELISA ודימוי קונפוקאלי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הרכב תרופות ננויות ובדיקות תפקודיות.
- ניתן להתאמה לסממני גידול ופרופילים גנטיים שונים באמצעות אסטרטגיות צימוד מודולריות.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בבקרת איכות קפדנית ובשחזוריות בין סדרות ייצור.
