Name: אינדוקציה תרופתי של עוריות מלנין והגנה מפני כוויות שמש בדגם מואנש מאוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: למד אינדוקציה תרופתית של מלנין בעור באמצעות פורסקולין במודל עכברים בעלי עור בהיר. שיטה זו מדגימה הגנה מפני קרינת UV ומסייעת בחקר מנגנוני פיגמנטציה וסיכון למלנומה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות מלינדה קל תנועה לקבלת סיוע טכני. אנחנו גם מכירים מקורות מימון העבר ובהווה: המכון הלאומי לסרטן (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), וונדי וויל מקרה הקרן לחקר הסרטן, מרקי קרן הסרטן, נס הרשת של הילדים וג&#39;ניפר ודיוויד דיקנס מלנומה קרן מחקר.

1. הכנת Forskolin למקומי מנהל מתמצית שורש גולמי של צמח Plectranthus barbatus (forskohlii Cohleus) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקולים לניסויים עכבריים בעקבות ההנחיות להתנהגות אתית בטיפול ושימוש בבעלי החיים ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קנטאקי (פרוטוקול # 00768M2004). תמצית השורש מורכבת ב40% במשקל / נפח בבסיס סטנדרטי דרמטולוגיים של 70% אתנול, 30% פרופילן גליקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 200 גרם של תמצית שורש forskolin הגולמי ולהעביר אותו לכוס. כדי להפוך 500 מיליליטר של 40% (w / v) פתרון, resuspend 200 גרם של תמצית שורש forskolin הגולמי על ידי הוספה ביותר, אבל לא כל הנפח של הרכב (70% אתנול, פרופילן גליקול 30%) ולהביא הפתרון ל בערך 450 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במשך שעה בטמפרטורת חדר. הפתרון יהיה צמיג במידה מסוימת והן עשוי לחייב תסיסה ידנית כדי &quot;להרים&quot; את התמצית לפתרון לפניבר והמערבב הוא מסוגל להשתלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , אחרי שעה של ערבוב יוצק את התערובת לתוך גליל סיים ולהביא את הנפח 500 מיליליטר שימוש ברכב שבו נעשה שימוש כדי &quot;לשטוף את&quot; הכוס ששימשה לעורר את התרחיף (על מנת למקסם את ההתאוששות של forskolin מהכוס) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התרחיף ל50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר פוליפרופילן. צנטריפוגה (1,500 XG, טמפרטורת חדר, 15 דקות) באמצעות צנטריפוגות בטבלה עליונה. בשלב זה, את החומר מסיס יהיה די דחוס, המאפשר את supernatant למזוג לכוס בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון דרך קרום אצטט תאית 0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל חומר מסיס שיורי מהתמצית. אנו משתמשים במערכת בקבוק העליונה המיועדת לתרבית תאים, יחד עם השימוש בטרום מסננים שמגיעים עם היחידה למניעת סתימה מוקדמת של הקרום ממרכיבים מסיסים של תמצית השורש. בעת ביצוע כמויות גדולות של התמצית, לסנן בערך 100 מיליליטר בכל פעם, שינוי ההימור לסנן מראשWeen כל כרך הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הם מאוחסנים בטמפרטורת חדר, התמצית שומרת את פעילות ביולוגית לעד שנה. </li></ol> 2. הכנת C57Bl / 6 העכברים K14-SCF לטיפולים מקומיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת פרווה גב מבעלי החיים על ידי גז חשמלי. בקצרה להרדים את החיות עם isoflurane שהאיפה להקל על מריחה של פרווה הגבי עם מזמרה חשמלית לבוש עם ראש 0.25 מ&quot;מ כירורגית הכנה (פישר סיינטיפיק). רצוי להשתמש רק בסוג אחד של הרדמה (למשל קטמין / xylazine) כדי למזער את הסיכון של מנת יתר של חומר הרדמה. קאמרי משאיפת רוויה נושא בעיסוק סיכון בעת ​​שימוש מחוץ למכסה המנוע קטר ומספק כמויות לא ידועות של חומר הרדמה לבעלי חיים. באופן אידיאלי יש להשתמש במכשיר אדי דיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר שיער זיפי שייר, טיפול בבעלי החיים עם מקריח כימי. לנהל הרדמה לבעלי החיים עם הזרקת ה-IP של קטמין 40 מ&quot;ג / קילוגרם ו xylazine 4 מ&quot;ג / קילוגרם </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שחיות מורדמים כראוי (כפי שנשפט על ידי קמצוץ הבוהן), להחיל כמות אצבע בגודל של קרם מקריח לעור גב טעון באמצעות אצבע עטויה בכפפה. למרוח את הקרם לתוך העור ל30-60 שניות או עד שניתן לראות בבירור שערות בקרם בזמן שהוא עבר בסביבה. השאר את הקרם על רק לכמות המינימלית של זמן הדרוש להסרת שיער כמו חשיפה ממושכת גורמת לצריבה כימית של העור, התמוטטות אפידרמיס ומוות מאובדן השלמות באפידרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את עור הגב עם פדה גזה ספוגה במים שוב ושוב עד שכל השמנת הוסרה. חיות יבשים באמצעות מגבות נייר רכות, ולאפשר להם להתאושש במיקום מבודד חם (למשל כלובים נקיים הונחו על כרית חימום). להשיר שער חיות אחד על אחד ולעקוב מקרוב לאורך כל ההליך. </li></ol> 3. מנהל אקטואלי של Forskolin או רכב בקרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להתייחס לבעלי חיים אחד בכל פעם. בקצרה להרדים עם שאיפהisoflurane ד על ידי הצבת העכבר על החלק העליון של מסנן אוויר חדיר ניילון מצויד טופס לפיו הושם מגבת נייר רווי isoflurane בצנצנת רווי isoflurane עפעפיים ברורה זכוכית במנדף. לחשוף את העכבר כדי isoflurane למספיק זמן כדי לדכא את תנועות שרירים מרצון, אבל כדי לשמור על נשימה ספונטנית (בדרך כלל 10-20 שניות). השארת בעלי החיים בisoflurane ארוכה מדי תגרום לדיכוי ומוות בדרכי הנשימה. עדיף לטעות בצד של &quot;הולך אור&quot; ויש להם מחדש לחשוף את העכבר לזמן קצר ליותר isoflurane ולא אל מעל לחשוף את בעלי החיים למוות הסמים וסיכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מבית הבליעה isoflurane ומניח על משטח ספסל סופג נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות micropipette 1,000 μl לבוש עם טיפ פוליפרופילן חד פעמי, להכין 400 μl 40% תמצית forskolin הגולמי (בעלי חיים שליטה ברכב יקבלו 70% אתנול, 30% פרופילן גליקול לבד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התמצית עלאחורי של בעלי החיים על ידי מטפטף אותו על העור ולאחר מכן, תוך שימוש בצד של קצה פיפטה, מורח את התמצית על עור הגב עד שכל העור כבר מכוסה. אין צורך למחוק את העור לאחר יישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את העכבר לכלוב שלה, ולבחון בזהירות עד שהוא מתאושש מהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת שתופעות cAMP אינו פיגמנט לא צריכה לבלבל את ניסויי רגישות UV, להפסיק את כל הטיפולים אקטואליים 2 ימים לפני חשיפה לקרינת UV (אפקט הפיגמנט נמשך כמה ימים מעבר לטיפול מקומי שעבר). </li></ol> 4. צבע עור מדידה על ידי רפלקטיבית colorimetry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להרדים את העכבר עם isoflurane בשאיפה (ראה לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל קולורימטר Minolta ידי הנחת הראש הנייד על המשטח הלבן האחידים מסופק עם קולורימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ראש המדידה הנייד של סומק קולורימטר עם עור הגב של בעלי החיים על מנת להבטיח כי apertur העגול 1 סנטימטר 2דואר נלחץ לחלוטין על גבי העור. קח לפחות שלוש מדידות נפרדות באזורים שונים של עור גב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ציון * L ממוצע ± SD לכל בעלי חיים וכל קבוצת טיפול. colorimetry רפלקטיבית יכולה להיעשות בכל נקודה בניסוי. </li></ol> 5. קביעת UV הרגישות על ידי חישוב של &quot;מינימל erythematous המנה&quot; (MED) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בבעלי חיים, כי כבר מראש שטופלו גם עם רכב או forskolin כפי שתואר לעיל. הרדימי חיות עם זריקת intraperitoneal של תערובת סטנדרטית של קטמין ו xylazine (ראה לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את נייר דבק UV-אוטם לבדיקת MED. כדי ליצור חורים בקלטת, להשתמש בניקוב חורים כבד עם 1 סנטימטר 2 מעגלי מגזרת (2A דמויות ו-B). יש חורים בגודל מוגדר וסידור סימטרי בקלטת מאפשר זיהוי של שינויים בעור לאחר הקרנה. על כל חור בקלטת, להחיל חתיכה קטנה אבל בקלות להסרה<html> מקלטת שניתן להסיר בזמנים מוגדרים במהלך חשיפה לקרינת UV כדי לאפשר לממשל של מינוני UV שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שבעלי חיים הם מסוממים כראוי, הניחו את הקלטת על פני השטח הגבי. חומר הסיכה העין תמיד צריכה להיות מנוצל בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור UV המורכב משני Westinghouse F15T8UV-B מנורות עם תפוקת שיא של 313 ננומטר ומגוון של 280-370 ננומטר. לאפשר את המנורה לאזן לפלט UV קבוע כפי שהיא נמדדת על ידי פוטומטר UV עם חיישן UVB (בדרך כלל לוקח כמה דקות למנורות להתחמם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על קצב שידור UV כפי שהיא נמדדת על ידי פוטומטר UV, לחשב UV זמן חשיפה לכל מינון רצוי. לדוגמא, אמצעי פלט UVB של מנורתנו 2.4 mW / 2 סנטימטר. לכן, כדי לנהל 5 kJ / מ 2, העור היה צריך להיות חשוף ל208 שניות (שהוא 3 דקות ושניות 28) של קרינת UVB, כפי שמחושב שלהלן: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חיות המסוממות (כל אחד עם קלטת אוטמת במקום) הגחון פני השטח למטה כדי להבטיח חשיפה אפילו UV. כדי לנהל את המנות הנבחרות של קרינת UV, ברצף להסיר את הקלטות אוטמות קטנות המכסות את החורים לחשוף סנטימטר 1 2 אזורים של עור למינונים הנכונים של קרינה. לכן, שימוש בדוגמא לעיל, אם 40 kJ / m 2 הוא המנה הגדולה ביותר בניסוי, ולאחר מכן בעלי החיים יהיו תחת המנורה ל27 דקות ו47 כולל שניות והעור במצב 40 kJ / m 2 לא יהיו כל שמעליה קלטת כל הזמן. עם זאת, סרט שכיסה את מצב 5 kJ / m 2 יוסר כאשר יש 208 שניות שנותרו בחשיפה. תזמון של הסרת קלטת צריך להיעשות כך שכל מצב מסתיים בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חשיפה לקרינת UV, לקלף את הסרט מעור הגב בזהירות, נזהר שלא לקרוע את העור בתנועות פתאומיות או יתר על המידה, בכוח. הנח בעלי חיים במקום שקט חם כדי לאפשרהתאוששות מן ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על עכברים ל24-48 שעה לחפש אזורים דיסקרטיים של אריתמה (אדמומיות) או בצקת (נפיחות) מתאים לאתרים אנטומיים נחשפו למינון המסוים של קרינת UV. לתעד את ממצאי עור photographically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערך MED תואם את המינון המינימאלי של UV שגורם לדלקת כפי שהוגדר על ידי אודם ו / או בצקת של המעגל נחשף כולו של עור. שימו לב כי פיגמנטציה של העור יכולה לאתגר את הנחישות של MED, לעומת זאת, אודם ובצקת עדיין יכולים בדרך כלל להעריך במדויק, בין שאר הודות לצורה מוגדרת של הפתחים בקלטת במהלך חשיפה לקרינת UV. </li></ol> 6. ניתוח סטטיסטי לנתח נתונים בין קבוצות של עכברים בדרך ANOVA אחד עם מבחן Bonferroni הודעה (גרף Pad PRISM). ערכי p &lt;0.05 נחשבים משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שימוש במודל חיה של האדם בהיר עור, אנו מוצאים כי יישום מקומי של תמצית שורש הגולמי forskolin עשיר וחסונה מכהה את העור על ידי המרצת ייצור המלנין בעור. melanization עוריות תלוי בביטוי של גורם בתאי גזע בעור הבסיסי, כפי שקורה בעור אדם, אך לא בעור עכבר גנטי ללא שינוי. עור הגב של עכברים גנטיים ללא שינוי חסר בכמות מספקת של מלנוציטים interfollicular להקנות פיגמנט בעור. רק בהגדרה של ביטוי המכונן של גורם גדילת מלנוציט כגון גורם תאי גזע (יגנד ערכה) או גורם גדילת hepatocyte (HGF) יכול מלנוציטים...

השכיחות של מלנומה, הצורה הקטלנית ביותר של סרטן העור, גדלה באופן דרמטי בעשורים האחרונים בארצות הברית, במיוחד בקרב אנשים בהירי עור. ראיות מולקולריות ואפידמיולוגיים חזקות מפלילות קרינת UV כגורם סביבתי עיקרי סיבתי 2-5. חשיפת UV מוגברת בצורה של חשיפה לשמש ושימוש במיטת השיזוף עשויה להיות אחראי לחלק גדול מעלייה בשכיחות מלנומה 6-7. הסיכון למלנומה נראית קשור במיוחד עם כוויות שמש 8, במיוחד אלה בשלב מוקדם בחיי 9-10. סיכון לכוויות השמש קשורה לא רק למינון ועוצמה של חשיפה לקרינת UV, אלא גם על ידי גורמים תורשתיים המשפיעים על תגובה עורית לקרינת UV. פיגמנטציה של עור היא אחד הגורמים החשובים ביותר של רגישות UV, סיכון לכוויות שמש וסיכון לסרטן. מלנומה מתרחש בערך עשרים פעמים בתדירות גבוהה יותר באנשים בהירים עור בהשוואה לindividua כהה עורls 11-13. המלנין, הפיגמנט המיוצר על ידי מלנוציטים באפידרמיס, הוא הקובע העיקרי של גוון עור. המלנין מגיע בשני סוגים עיקריים: (1) אומלנין, פיגמנט חום / שחור כהה יעיל בספיגת האנרגיה של קרינת UV, ו (2) pheomelanin, אדמדם / פיגמנט בלונדינית פחות יעיל במניעת חדירה של פוטונים UV אל העור. צבע עור, רגישות UV והסיכון למלנומה נקבעים בעיקר על ידי תוכן אומלנין אפידרמיס 14-15. יותר אומלנין באפידרמיס, הפוטונים UV פחות יכול לחדור לתוך העור. בגלל הרמות נמוכות של אומלנין מולדים, אנשים בהירי עור הם הרבה יותר פגיע להשפעות אקוטיות וכרוניות של קרינת UV 16-18. פיגמנטציה של עור, סיכון למלנומה והיכולת &quot;שיזוף&quot; לאחר חשיפה לקרינת UV כל לתאם עם יכולת האיתות של הקולטן melanocortin 1 (MC1R), הטרנסממברני של מצמידים-S G שבעקולט urface על המלנוציטים 19-22. כאשר MC1R נקשר ליגנד מאותו המקור גבוהה זיקה, הורמון מגרה α-מלנוציט (α-MSH), יש הפעלה של cyclase adenylyl וייצור של cAMP השליח השני 23. התגובה הפיזיולוגית הנורמלית של העור לאחר חשיפה לקרינת UV כוללת ייצור אפידרמיס של α-MSH ידי קרטינוציטים 24-29. אנו ואחרים משערים כי מקורם בkeratinocyte α-MSH נקשר MC1R במלנוציטים באפידרמיס, ייזום ייצור במורד הזרם של השליח השני המחנה דרך הפעלה של cyclase adenylyl 30. רמות cAMP לשלוט בהיבטים רבים של בידול מלנוציט, כוללים מסלולי הישרדות, תיקון DNA וסינתזת הפיגמנט. איתות MC1R וcAMP בבירור לגרום לרמות אנזים פיגמנט וייצור אומלנין. כאשר איתות MC1R היא שלמה ורמות cAMP melanocytic הם חזקות, אומלנין מופק והעור מתכהה. עם זאת, אם איתות MC1R היא פגומה ורמות cAMP cytoplasmic יישארו נמוכות, pheomelanin מיוצר במקום 1. סינתזת eumelanin יכולה להיות מגורה פרמקולוגית על ידי סוכנים שמעלים את רמות cAMP 1,14,31-35. מאז חלבון MC1R הוא וסת עיקרי לסיכון למלנומה בבני אדם 36-46, אנו מעוניינים במנגנונים שבאמצעותם MC1R מגן מלנוציטים נגד היווצרות הסרטן ע&quot;י-UV. כבסיס למחקרים שלנו, אנחנו שנוצרנו מודל עכברי MC1R-גרסה מהונדס על רקע 1 טהור C57BL / 6 גנטי. במודל זה, נובע גורם תא (SCF) בא לידי ביטוי constitutively באפידרמיס הבסיסי ומלנוציטים interfollicular אפידרמיס נשמרים בעור לאורך כל חיים 47, בניגוד לעכברים שאינם מהונדסים שבו מלנוציטים בתרגום לדרמיס בזקיקי שיער. עם transgene K14-SCF משולב, האפידרמיס הופך פיגמנט עם מאפיין פיגמנטים המלנין המסוים של פיגמנטזן של בעלי החיים 1. עכברי K14-SCF על הרקע הגנטי C57BL / 6 עם איתות MC1R סוג בר שהעור שחור משחור מתאפיינים ברמות גבוהות מאוד של הפיגמנט אומלנין. באופן לא מפתיע, בעלי החיים אלה הם מאוד UV עמיד. לעומת זאת, יש לי C57BL / 6 בעלי החיים K14-SCF התאמה גנטית כי נמל MC1R פעיל מוטציה כמעט שלא אומלנין באפידרמיס. במקום זאת, יש בעלי החיים אלה &quot;הסיומת&quot; (ה MC1R / ה) גוון עור בהיר הנגרם על ידי בתצהיר של פיגמנט pheomelanin (איור 1 א) והם הרבה יותר רגיש לקרינה UV 48-49. תרכובות תרופתיות עם תכונות כימיות שמאפשרות חדירה לתוך העור הוכחו לגרום potently אומלנין בהארכה (ה MC1R / ה) מודל החיה K14-SCF ישירות על ידי המניפולציה רמות cAMP במלנוציטים באפידרמיס בעור. גברת ביטוי מלנין במודל זה כבר reported ידי הפעלת cyclase adenylyl 1, כמו גם phosphodiesterase 4 עיכוב 35. במאמר זה, אנחנו מדגימים את ההכנה והיישום מקומי של forskolin בהארכה (ה MC1R / ה) בעלי החיים K14-SCF איזה דגם האנושי UV רגיש בהירת עור. אנו מראים כי יישום פעמיים ביום של התרופה מקדם melanization המואץ, שמחשיך העור בשל תצהיר אפידרמיס של פיגמנט המלנין, וכי מלנין אפידרמיס המושרה מגן מפני כוויות שמש נגרם UV באמצעות מדידה של &quot;מינון המינימלי erythematous&quot; (MED) 48.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Coleus Forskoli extract 20%</td> <td>Buckton Scott USA Inc.</td><td>n/a</td><td>פרינסטון, ניו ג'רזי</td></tr><tr><td>איזותזיה, איזופלורן, USP</td><td>באטלר שיין</td><td>NCD 11695-6776-1</td><td>דבלין, אוהיו, ארה"ב</td></tr><tr><td>הזרקת קסילזין אנסד</td><td>LA04612</td><td>שננדואה, איווה, ארה"ב</td><td></td></tr><tr><td>קטמין HCl, USP</td><td>Putney</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>סנט ג'וזף, מיזורי, ארה"ב</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>דקון מעבדות.</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>פרופילן גליקול</td><td>אדסקו</td><td>05751L</td><td>סולון, אוהיו, ארה"ב</td></tr><tr><td>קרם אפילציה, כנסיית נאיר</td><td>דווייט</td><td>JF-11 4381322</td><td>פרייסטון, ניו ג'רזי</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>קוטל חיידקים מנורת כספית UV-B</td><td>ווסטינגהאוס</td><td>F15T8UV-B</td><td></td></tr><tr><td>רדיומטר פוטומטר</td><td>אור בינלאומי</td><td>1LT400A</td><td>פיבודי, MA, ארה"ב</td></tr><tr><td>Chromameter</td><td>Konica Minolta</td><td>CR-400</td><td>Ramsey, NJ, ארה"ב</td></tr><tr><td>מעבד נתונים עבור Chromameter CR-400</td><td>Konica Monilta</td><td>DR-400</td><td>Ramsey, NJ, ארה"ב</td></tr></tbody></table>

אינדוקציה תרופתי של עוריות מלנין והגנה מפני כוויות שמש בדגם מואנש מאוס

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

הגינות של עור, רגישות UV וסיכון לסרטן העור בכל לתאם עם הפונקציה הפיזיולוגית של הקולטן melanocortin 1, חלבון איתות יחד-S G נמצא על פני השטח של מלנוציטים. MC1R מגרה cyclase adenylyl וייצור cAMP אשר, בתורו, מעלה מווסת את ייצור melanocytic של מלנין בעור. על מנת ללמוד את המנגנונים שבאמצעותם איתות MC1R מגנה על העור מפני פגיעת UV, מחקר זה מסתמך על מודל של עכברים עם &quot;עור אנושי&quot;, המבוסס על ביטוי אפידרמיס של גורם בתאי גזע (SCF). עכברים הטרנסגניים K14-SCF לשמור מלנוציטים ב יש לי האפידרמיס ולכן היכולת להפקיד המלנין באפידרמיס. במודל חיה זו, תוצאות מצב MC1R סוג בר בתצהיר חזק של פיגמנט אומלנין השחור ופנוטיפ מוגן UV. לעומת זאת, בעלי החיים K14-SCF עם תערוכה פגומה MC1R איתות יכולת פיגמנטציה אדומה / בלונדינית, אומלנין מעט מאוד בעור ופנוטיפ UV-רגיש. הנמקה כי בתצהיר אומלנין עלול להיות מוגבר על ידי סוכנים מקומיים המחקים איתות MC1R, מצאנו כי יישום ישיר של תמצית forskolin לעור של עכברים בהירי עור MC1R פגומים גרם לאינדוקצית אומלנין החזקה והגנת UV 1. כאן אנו מתארים את השיטה להכנה ויישום תמצית שורש טבעית המכיל forskolin לעכברים בהירי עור K14-SCF ומדווח על שיטה למדידת רגישות UV על ידי קביעת מינון erythematous מינימאלי (MED). שימוש במודל זה חי, זה אפשרי ללמוד איך האינדוקציה cAMP אפידרמיס וmelanization של העור משפיעים על תגובות פיזיולוגיות לחשיפה לקרינת UV.

C57BL / 6 עכברים שנוצרו על רקע eumelanotic, pheomelanotic או amelanotic שילוב transgene K14-SCF כ( איור 1 א) תאר. קבוצות של הארכה בהירת עור (ה MC1R / e, + / + Tyr) טופלו עכברים למריחה עם מינונים של פעמיים ביום או ברכב (70% אתנול, 30% פרופילן גליקול) או 40% תמצית שורש forskohlii Coleus הגולמי (80 מיקרומטר לכל מינון) במשך 5 ימים (איור 2). השפעות של טיפולים אקטואליים בפיגמנטציה באפידרמיס נקבעו הן על ידי בדיקה ו...

המלנין עוריות הוא מושרה על ידי יישום מקומי של forskolin במודל עכברי של אדם UV רגיש בהיר עור. מניפולציה תרופתי של רמות cAMP בעור ואפידרמיס המחשיכים מאוד להגן מפני דלקות בתיווך UV (כוויות שמש), כפי שנמדד על ידי מינון erythematous מינימום assay (MED).

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד רגישות ל-UV על ידי קביעת מינון האריתמה המינימלי בעכברים בעלי עור בהיר שקיבלו טיפול מקדים בארבעה סוגי עור. זאת מושגים תחילה על ידי הכנת העור הגבי של העכברים להקרנה באמצעות גילוח והסרת שיער. לאחר מכן, מיושמים טיפולים מקומיים של forskolin על העור הגבי.לאחר מכן, העכברים נחשפים למינונים שונים של קרינת UV כדי לקבוע את ההשפעות של four mediate melon על דלקת המושרה על ידי UV. התוצאות שהתקבלו מראות כי מריחה מקומית של forline מגבירה באופן משמעותי את פיגמנטציית העור, וכי בעלי me מוגבר באופן פרמקולוגי עמידים לקרינת UV כפי שנקבע על ידי MED. אלו הם מחקרי הוכחת היתכנות המראים כי ניתן להשרות שיזוף באופן פרמקולוגי בפרט שאינו מסוגל להשתזף בשל פגם בגן מלנוציטים חשוב מאוד הנקרא melanocortin one receptor או MC one R. באוכלוסיות אנושיות, אובדן תפקוד של mc one R נמצא במתאם עם רגישות ל-UV, נטייה לכוויות שמש, חוסר יכולת להשתזף, ומאוחר יותר בחיים, סיכון גבוה עד פי ארבעה למלנומה.בחרנו ב-scullin כבתרופה למחקרים אלה מכיוון שהוא מסוגל לעקוף מסלול איתות פגום של קולטן המלנוקורטין ולהטעות את המלנוציטים לחשוב שיש להם מסלול איתות mc1R תקין, ולכן הם מייצרים כמות גדולה של מלנין, השוקר בעור ומגן על בעלי החיים מפני קרינת UV. למרות שאנו יודעים ששיטה זו מספקת תובנות לגבי עור שעלול להפוך כהה יותר, ייתכן שהיא תהיה חשובה גם למניעת סרטן.מכיוון שידוע כי קרינת UV היא הגורם המסרטן העיקרי עבור הרוב המכריע של סוגי סרטן העור, ושיפור היישום של הגנה על העור מגן מפני פגיעות UV, בצעו זריקות תוך-פריטוניאליות (intraperitoneal). הקפידו לבצע שאיבה (aspirate) לאחר מיקום המחט ולפני הזרקת התוכן, כדי לוודא שהמחט לא חדרה לכלי דם, למעיים או לשלפוחית השתן. יש לבצע זריקות IP בצד ימין כדי להימנע מהטחול. לאחר הכנת תמצית ה-forline והרדמה קצרה של העכבר באמצעות isof fluorine.שאיפה, בהתאם לפרוטוקול הטקסט, ניתן הרדמה נוספת לבעל החיים באמצעות זריקה IP של ketamine ו-xylazine. בצע צביטה בבוהן כדי לוודא את רמת הסדציה. השתמש במספריים חשמליים המצוידים בראש הכנה כירורגי של 0.25 millimeter כדי לגזז את הפרווה הגבית.השתמשו בקרם להסרת שיער כדי להסיר את השערות הקצרות. לאחר מכן, כדי למנוע כוויות או נזקים אחרים לעור, השתמשו מיד בפדים של גזה ספוגה במים כדי לנגב בעדינות את העור הגבי (dorsal skin) עד להסרת כל שאריות הקרם. השתמשו בנייר סופג רך כדי לייבש את החיה לפני הנחתה בכלוב נקי על משטח חימום לצורך התאוששות.באופן כללי, יש להרדימ את העכברים לזמן קצר כדי להקל על מתן טופיקלי של forskolin או תמיסות ביקורת באמצעות שאיפת isof fluorine תחת מנדף. התחילו עם מגבת נייר רוויה ב-isof fluorine בתוך צנצנת זכוכית שקופה עם מכסה, שגם היא רוויה ב-isof fluorine. לאחר חיבור מסנן ניילון חדיר לאוויר המותאם לצורה, הרדימו את העכבר על ידי הנחתו מעל המסנן לזמן קצר בלבד, עד לדיכוי התנועות השריריות הרצוניות, והניחו את החיה המורדמת על פד ספיגה נקי על השולחן.לאחר ביצוע צביטה בבוהן, העברו 400 µL של תמצית forline גולמית לגב בעל החיים על ידי טפטוף על העור. לאחר מכן, השתמשו בצד הקצה כדי למרוח את התמצית על פני כל שטח העור הגבי החשוף. החזירו את העכבר לכלובו ועקבו אחריו בזהירות עד להתאוששות מההרדמה כדי למנוע פגימות פיגמנטציה.השפעות של Cyclic AMP על ניסויי רגישות ל-UV המעוררים בלבול. הפסק את כל הטיפולים הטופיקליים יומיים לפני החשיפה ל-UV כדי לבצע קולורימטריה רפלקטיבית. לאחר הרדמה קצרה של העכבר באמצעות שאיפת isof fluorine.יש לכיול את הקולורימטר על ידי הנחת הראש הנייד על המשטח הלבן הסטנדרטי המסופק עם המכשיר. הנח את ראש המדידה הנייד בצמידות לעור הגב של החיה, תוך וידוא שפתח העגול ששטחו סמ"ר אחד נלחץ לחלוטין אל העור. בצע לפחות שלוש מדידות נפרדות באזורים שונים של עור הגב.חשבו את ממוצע ציון ה-L, פלוס או מינוס סטיית תקן לכל חיה ולכל קבוצת טיפול. כדי לקבוע את המינון האריתמטטי המינימלי (minimal erythematous dose או MED), כל חיה תיחשף למגוון מינוני UV. התחילו בהכנת פיסת סרט חוסם UV באמצעות מחורר חורים כבד עם פתח עגול של סנטימטר רבוע אחד כדי לחורר חורים בסרט מעל כל נקודה.בסרט ההדבקה. הדביקו פיסה קטנה של סרט הדבקה שניתן להסירה בקלות. לחשיפה ל-UV, מקמו את הסרט על פני השטח הגביים של העכבר המורדם.אם עיני בעל החיים פתוחות, יש להחיל דמעות מלאכותיות כדי למנוע פגיעה כתוצאה מייבוש וחשיפה ל-UV. הדלק את מקור ה-UV המורכב משתי נורות UVB עם שיא פלט של 313 nanometers וטווח של 280 עד 370 nanometers. אפשר לטלה להגיע לשיווי משקל תחת פלט UV קבוע, ולפני כן השתמש בפוטומטר UV עם חיישן UVB כדי לאמת את הפלט; בהתבסס על קצב תמסורת ה-UV כפי שנמדד על ידי פוטומטר ה-UV, חשב את זמן החשיפה ל-UV עבור כל מינון רצוי.לדוגמה, פלט ה-UVB של המנורות שלכם נמדד כ-2.4 milliwatts לסמ"ק. לכן, כדי להעניק מינון של five kilojoules למ"ר, יש לחשוף את העור ל-208 שניות של קרינת UVB, כפי שחושב כאן. לאחר מכן, הניחו בעל חיים שעבר סדציה כאשר הצד הבטני פונה כלפי מטה כדי להבטיח חשיפה אחידה ל-UV ולהעניק את מינון הקרינה הנבחר באופן רצף.הסר את פיסות הסרט הקטנות המכסות את החורים במועד המתאים. לדוגמה, אם 40 kilojoules per square meter הוא המינון הגבוה ביותר, העכבר ייחשף למנורה למשך 27 דקות ו-47 שניות, והחור עבור מינון זה ייחשף כבר מההתחלה. עם זאת, עבור תנאי של five kilojoules per square meter, יש להסיר את הסרט כאשר נותרו 208 שניות של חשיפה.בסיום זמן החשיפה ל-UV, הסר את הסרט בזהירות והנח את בעלי החיים במקום חם ושקט להתאוששות מההרדמה לפני השבתם לכלובים. ערך המינון האריתמטטי המינימלי, או MED, תואם למינון ה-UV המינימלי הגורם לדלקת, כפי שמוגדר על ידי אריתמה ו/או בצקת של כל עיגול העור שנחשף. עקב אחר העכבר במשך 24 עד 48 שעות כדי לאתר אזורים מובחנים של אריתמה או בצקת באזורים שנחשפו ל-UV.לעיתים, שאריות של זיפים ראשוניים מקשות על פרשנות בדיקות ה-MED על ידי הסוואה של אריתמה או אדמה תת-עוריות; הרטבת העור ב-70% ethanol הופכת את מצב העור לניתן לפירוש הרבה יותר. תעדו כל ממצא עורי באופן פוטוגרפי ולאחר מכן החזירו את העכברים למתקן בעלי החיים. בניסויים אלו, עכברי C 56 black six הופקו על רקעים anodic anodic או anodic הכוללים את הטרנסגן K 14 stem cell factor, המאפשר לעכברים לשמר מלנוציטים באפידרמיס וכתוצאה מכך להפריש מלנין.באידרמיס המוצג כאן, קבוצות של עכברי fair skin extension טופלו במשך חמישה ימים באופן טופיקלי במינונים פעמיים ביום של vehicle או של 40%crude colus fors coly root extract. השפעות הטיפולים הטופיקליים על הפיגמנטציה האידרמלית נקבעו הן באמצעות בדיקה ויזואלית והן באמצעות Reflective color imagery. מריחה של תמצית השורש הייתה קשורה להכהיה אידרמלית משמעותית ברקע הגנטי של K 14 SCF transgenic, אך לא בבעלי חיים לא-טרנסגניים תואמים גנטית, מה שמרמז כי מלנוציטים אידרמליים בין-זקיקיים חייבים להיות נוכחים על מנת שמלנין המושרה באופן פרמקולוגי יטרשף.באידידרמיס, למרות שתמצית השורש היא בעלת צבע עז בשל נוכחותם של פיטוכימיקלים צמחיים מלבד ארבעה galin, התכהה העור לא יכולה לנבוע אך ורק מאפקט צביעה של התרופה. מכיוון שבעלי חיים שאינם טרנסגניים לא הראו התכהות של העור עם תמצית השורש, כפי שהודגם כאן בעת יישום טופיקלי פעמיים ביום, השפעות המלנין של forskolin נצפו כבר לאחר יומיים. למרות זאת, התכהות מקסימלית הייתה ניכרת לאחר מספר ימים נוספים, כפי שמוצג באיור זה באמצעות font mason וצביעת מלנין של חתכי עור גב.מידת המלניזציה תלויה במינון; בעלי חיים שטופלו ב-four skin פעם אחת ביום למשך 15 ימים או פעמיים ביום למשך חמישה ימים חוו רמות דומות של התכהות העור. בנוסף, לא נצפו השפעות רעילות ברורות מחשיפה ל-four skin באף אחת מקבוצות הטיפול. לפיכך, הגענו למסקנה כי הטיפול המואץ בן חמישה הימים קידם מלניזציה בטוחה של עור הגב ביעילות שקולה לטיפול הסטנדרטי של פעם אחת ביום.איור זה מדגים כי כפי שנמדד בבדיקת MED, השראת epidermal mein על ידי forline הביאה להגנה עמוקה מפני UV, בעוד שערך ה-MED הממוצע עבור עכברי K 14 SCF extension שטופלו פעמיים ביום במשך חמישה ימים ב-vehicle היה 5.0 plus or minus 0.0 kilojoules per meter square. ה-MED הממוצע עבור קבוצות שטופלו ב-four galin מקומי היה גבוה מ-30.0 plus or minus 0.0 kilojoules per meter square. למעשה, מינון של 30.0 kilojoules per meter square לא היה מספיק כדי לגרום לאריתמה. בניסוי זה, תוך שימוש במינון standard force Glen, ה-MED הממוצע עבור עכברי K 14 SCF extension מטופלים היה 50.0 plus or minus 7.1 kilojoules per square meter.חשוב לציין כי טיפול מקדים ב-forline לא השפיע על ה-MED של בעלי חיים שאינם מסוגלים להפיק מלנין, בין אם בשל היעדר מלנוציטים אפידרמליים המתווכים על ידי K 14 SCF, ובין אם בשל מחסור בטרוזינאז. מכיוון שהטיפולים ב-forline הופסקו יומיים לפני החשיפה ל-UV ולא חודשו לאחר החשיפה, אנו מסיקים כי השפעות cAMP שאינן קשורות לפיגמנטציה לא השפיעות על תוצאות ה-MED. במקום זאת, הנתונים מרמזים כי מלנין אפידרמלי היה המנגנון שדרכו גרם forline להגנה מפני UV במודל זה.ברגע שהטכניקה נלמדת, היא מאפשרת הערכה קלה וניתנת לשחזור של התגובה של פיגמנטציית העור ושל הרגישות לקרינת ultraviolet. ביישום במודל בעלי חיים, מריחת החומר אורכת דקות ספורות ביום, ומרבית הזמן הניסויי מוקדש למעשה לקרינת ה-UV ולבדיקת ה-MED. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי העור חוזר בהדרגה לגוון הבסיסי הבהיר שלו באופן פרמקולוגי.השראת מלנין דומה מאוד לתגובת שיזוף בכך שהעור יישאר כהה כל עוד הוא מגורה, אך לאחר מכן השיזוף ייעלם מהעור במהלך השבועות הבאים עם הסרת הגורם המגרה.

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה, תאי מלנומה שמקורם בבני אדם מושתלים באופן תת-עורי באזור האגף של עכבר מדוכא חיסון. מודל PDX מאפשר חקירה פרה-קלינית של תאי מלנומה המשחזרים טוב יותר את ההטרוגניות של הגידול ואת אגרסיביות המלנומה שנצפתה בתנאי in vivo.

מידול Xenograft הנגזר מהמטופל: טכניקה ליצירת מודלים של עכברי מלנומה

סרטון זה מתאר את ההליך לגרימת סרטן עור דו-שלבי כדי לחקור את התחלת הגידול על ידי יישום מקומי של כימיקלים. בשלב הראשון, מוטגן, DMBA, מוחל על העור של מודל עכבר אשר יוזם היווצרות הגידול על ידי גרימת מוטציות בתאי הגזע, ואחריו יישום של ממריץ גדילה, TPA, אשר מאיץ היווצרות פפילומה העור.

מודל קרצינוגנזה דו-שלבית של העור המושרה על ידי כימיקלים: מודל ניסיוני של סרטן העור בעכבר Vivo

סרטון וידאו זה מתאר שיטה למדידת רגישות לקרינת UV במודל עכבר אנושי – מודל עכבר המחקה עור אנושי. אנו קובעים את המינון המינימלי של קרינת UV (MED) שעלולה לגרום לאריתמה או בצקת על העור. השיטה יכולה לעזור לגלות את היעילות של תרופות המשמשות להפחתת רגישות UV.

בדיקת מינון אריתמטי מינימלי: שיטה למדידת רגישות UV במודלים עכבריים

אנו מתארים שלוש שיטות להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים במבחנה: כימות של פעילות tyrosinase 1) סלולר ותוכן 2) מלנין, או 3) מידה של מלנין מאת צביעת תאי המלנין וניתוח התמונה.

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

הפרוצדורה הבאה מתארת שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית של ייזום גידול מלנוציטוטי בעור מוראני, באמצעות דגם עכבר מהונדס גנטית. פרוטוקול זה מתאר מאקרוסקופי כמו גם חניכה מיקרוסקופיים עורית מלנומה.

שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

שני השלבים העור קרצינונוספגנזה נגרמת על ידי שני כימיקלים למריחה על הגוף. מוטגן 7, 12-diמתילבנץ [א] פחם) גורם מוטציות בתאים עוריות ויישום מתמשך של מקשה צמיחה כללית 12-O-טטרדקליאיל פורובול-13-אצטט מאיץ הפפילומה העור היווצרות.

מודל מסרטן העור המושרה כימי באמצעות דימתילבנץ [a] פחם ו-12-O-טטרדאנואיל פורבול-13-אצטט (DMBA-הסברתי)

מטרת פרוטוקול זה היא לגרום לייצור חולף in vivo של רמות לא קטלניות של מיני חמצן תגובתי (ROS) בעור העכבר, ולקדם עוד יותר תגובות פיזיולוגיות ברקמה.

גירוי נישות תאי גזע והתחדשות רקמות בעור עכבר על ידי פוטוגנרציה תלוית פרוטופורפירין IX ניתנת להחלפה של מיני חמצן תגובתי באתרם

כאן, אנו מתארים מערכת תכנות מחדש ישירה ממוטבת עבור מלנוציטים ומערכת אריזה מרוכזת של וירוסים ביעילות גבוהה המבטיחה תכנות מחדש ישיר חלק.

תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים

הפרוטוקול מתאר מחקר של השפעות העור המערכתיות והמקומיות של חשיפה לאולטרה סגול B בעכברים.

חקר חשיפה כרונית של עכברים לקרינה אולטרה סגולה מסוג B 

המחקר מדגים את תפקידו של העור בוויסות התגובות החיסוניות בעכברים באמצעות חיסון אפיעורי (EC). חיסון EC עם אנטיגן חלבון יכול לדכא תגובות חיסוניות ברגישות יתר למגע או להפוך דיכוי המושרה על ידי העור בשילוב עם דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן. חיסון EC מראה הבטחה כגישה יעילה ונטולת מחטים לאימונותרפיה.

מודל עכברי של אימונומודולציה המושרה אפיעורית

פרוטוקול סטנדרטי להשראת הזדקנות מוקדמת ב-HNM באמצעות tBHP, פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח סמנים מרכזיים של הזדקנות, כולל עצירת גדילה, פעילות SA-β-גלקטוזידאז וגורמי SASP.

פרוטוקול סטנדרטי להשראת הזדקנות מוקדמת הנגרמת מלחץ במלנוציטים ראשוניים בבני אדם באמצעות טרט-בוטיל הידרופרוקסיד

למד אינדוקציה תרופתית של מלנין בעור באמצעות פורסקולין במודל עכברים בעלי עור בהיר. שיטה זו מדגימה הגנה מפני קרינת UV ומסייעת בחקר מנגנוני פיגמנטציה וסיכון למלנומה.

אינדוקציה תרופתי של עוריות מלנין והגנה מפני כוויות שמש בדגם מואנש מאוס

גלה סרטונים נוספים