כמותי במבחנה Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

דבקות נויטרופילים לאנדותל מופעל באתרים של זיהום היא מרכיב בלתי נפרד של התגובה הדלקתית של המארח. שתואר בדוח זה הוא assay מחייב נויטרופילים המאפשרים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את מידת ההפעלה הדלקתית של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים על ידי כימות המספר היחסי של נויטרופילים הנצמדים לתאי האנדותל במבחנה בתנאים סטטיים. זה מושג על ידי טיפול ראשון בשכבות חד-שכבתיות בריאות של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עם הגירוי הניסיוני הרצוי בשלב השני. נויטרופילים ממתנדבים אנושיים בריאים מבודדים ואז מסומנים בסידן בבוקר.

לאחר מכן, הנויטרופילים המסומנים מתווספים לתאי האנדותל ומניחים להם להיצמד למשך 20 דקות שבמהלכן מתקבלת מדידה לפני הכביסה על ידי גיאומטריית ספקטרו פלואורסצנטית. בשלב האחרון, הנויטרופילים שאינם דבקים נשטפים, ולאחר מכן מתקבלת מדידה לאחר הכביסה. בסופו של דבר, ניתן לקבוע את אחוז ההיצמדות וההיצמדות היחסית של הנויטרופילים המסומנים בסידן לחד-שכבות של תאי האנדותל בכל תנאי טיפול.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הדלקתית האנושית, מכיוון שהיא יכולה לקבוע את ההיקף היחסי של הפעלה דלקתית אנדותל מיקרו-וסקולרי בתנאים שונים. בנוסף, לבדיקה זו יש פוטנציאל לשמש ככלי לחקר תהליכי מחלה מבוססי אנדותל אנושיים הכוללים קשירת לויקוציטים לאנדותל המיקרו-וסקולרי ביום הבדיקה. השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לאשר שהתאים מציגים מראה מרוצף בריא עם מעט פסולת תאים ושהם מתכנסים ב-100%.

לאחר שהחד-שכבות HM VEC מוכנות לטיפול, שטפו את התאים פעם אחת עם HBSS ולאחר מכן הוסיפו 0.3 מיליליטר של מדיום גידול תאי אנדותל מיקרו-וסקולרי טריים עם או בלי אגוניסט דלקתי לבארות המתאימות. כאן ריאות HM VEC מטופלות ב-TNF אלפא למשך שלוש שעות כדי לבודד נויטרופילים באמצעות הכנת פולימורף תחילה, הביאו את תמיסת שיפוע הצפיפות לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לאחר איסוף 30 מיליליטר של דם מלא ממתנדב אנושי בריא בנוכחות שכבה נוגדת קרישה, חמישה מיליליטר של דם מעל חמישה מיליליטר של הפולימורף מכינים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

הפרד את כל הדם למשך 30 דקות ב-450 פעמים G ו-18 עד 22 מעלות צלזיוס עם הניתוק, וודא שהצינורות מאוזנים היטב. לאחר מכן שאפו את הפלזמה הצהובה ואת השכבות המכילות PBMC כדי למנוע זיהום של שכבת הנויטרופילים הוורודה האטומה. כדי להסיר את הנויטרופילים, שאפו את שכבת הנויטרופילים עם פיפטה סרולוגית של מיליליטר עד שניים, תוך סיבוב איטי של הפיפטה והצינור.

משוך את הנויטרופילים מצינורות מרובים לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר PBS ללא סידן ומגנזיום. העלו את הנפח ל-50 מיליליטר עם יותר PBS ללא סידן ומגנזיום. לאחר סיבוב התאים, שאפו את הסנאט ולאחר מכן החייאו.

השעו את הנויטרופילים בשמונה מיליליטר של מים סטריליים כדי לכינים כדוריות דם אדומות לאחר 30 שניות. הוסף במהירות את שמונה מיליליטר תרחיף התאים לשני מיליליטר של חמישה x PBS ללא סידן ומגנזיום ולאחר מכן ערבוב עדין. לאחר סיבוב התאים, שוב, שטפו את התאים פעם אחת ב-PBS נטול סידן ומגנזיום ואז השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של RPMI 1640 ללא פנול אדום וספרו את התאים החיים על ידי אי הכללה של טריאן כחול.

לאחר הספירה, העבירו את התאים המרחפים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ודללו את הנויטרופילים עם שניים עד 4 מיליון תאים למיליליטר עם RPMI 1640 ללא פנול אדום. לאחר מכן הוסף תמיסת סידן am טרייה שהוכנה לריכוז של שלושה מיקרומולרים לתאים. מערבבים את תרחיף התאים על ידי היפוך עדין של הצינור מספר פעמים ולאחר מכן דוגרים את הצינור המכוסה בנייר כסף בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 30 דקות יש לצנטריפוגה את הנויטרופילים המסומנים ואז לשטוף את הכדור פעמיים ב -10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס. RPMI 1640 ללא פנול אדום, מעביר את תרחיף התאים דרך מסנן סטרילי של 40 מיקרון כדי להסיר גושים לפני הצנטריפוגה השנייה. השעו מחדש את הנויטרופילים ב -10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס.

פנול אדום חופשי RP MI 1640. ואז לאחר ספירת התאים פעם נוספת, יש לדלל אותם ל -2 מיליון תאים למיליליטר. כעת שטפו את החד-שכבות HM vec שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר של מסנן 0.22 מיקרון, פנול מעוקר ללא אדום RPMI 1640 המכיל 3% BSA לבאר לאחר הכביסה השלישית, שאפו את המדיה והוסיפו 600,000 נויטרופילים מסומנים בסידן ב-0.3 מיליליטר של תרחיף תאים, או 0.3 מיליליטר של פנול אדום ללא RPMI 1640 ללא נויטרופילים לבארות המתאימות של צלחת 48 הבארות לאחר מכן דגרו על תרביות הקו למשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, ולאחר מכן רגע לפני תום תקופת הדגירה, מודדים את עוצמת הקרינה של כל באר בספקטרופוטומטר באורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 520 ננומטר.

לאחר מכן הפוך את הצלחת כדי להסיר את המדיה ומרופד בעדינות על מגבות נייר כדי להסיר את כל הנוזלים שנותרו. שטפו את הבארות המכילות את החד-שכבות והנויטרופילים חמש פעמים עם 0.5 מילימטר לבאר PBS עם סידן ומגנזיום. הסרת ה-PBS באותו אופן בכל פעם.

רענן את הבארות עם 0.3 מיליליטר RPMI 1640 ללא פנול אדום לבאר, ולאחר מכן מדוד את עוצמת הקרינה של כל באר כפי שהודגם זה עתה. לבסוף, שימוש בנוסחאות אלו קובע את אחוז ההיצמדות וההיצמדות היחסית לבאר על מנת להשיג תוצאות אמינות הניתנות לשחזור באמצעות בדיקת קשירת נויטרופילים, חיוני שהבריאות והשטף המשותף של תאי האנדותל המיקרו-וסקולריים יהיו אופטימליים ביום הבדיקה. שימו לב, המראה המרוצף והשטף הכולל של החד-שכבות בספקטרופוטומטר אופטימה של כוכב פלואור.

לדוגמה, שימו לב שהפלואורסצנטי OD 520 ננומטר נמצא בטווח הליניארי כאשר מנתחים 10,000 עד 1 מיליון נויטרופילים מסומנים. מעניין שככל שמתווספים יותר נויטרופילים לחד-שכבות הריאות HM VEC המטופלות באגוניסט דלקתי, אחוז ההיענות עולה. P 38 map kinase הוכח בעבר כהכרחי לביטוי e selectin.

בתאי אנדותל אנושיים שטופלו ב-TNF אלפא ועיכובו מפחית את מספר הנויטרופילים הדבקים כדי להוכיח שמספר הנויטרופילים שנוספו לבארות הוא שרירותי כל עוד מספר התאים המנוצלים נמצא בטווח הליניארי של הספקטרופוטומטר. כאן מוצגת בדיקת הידבקות נויטרופילים עם תאי ריאה HM VEC שטופלו ב-TN F אלפא בהיעדר או נוכחות של מעכב קינאז מפת P 38 B IRB 7 96. תוצאות אלה מראות כי הירידה היחסית בקשירת נויטרופילים לאחר עיכוב מאפ P 38 דומה.

ללא קשר למספר הנויטרופילים לבאר, לקטין מתבטא על פני תא האנדותל לאחר טיפול ב-TNF אלפא ולוכד נויטרופילים מכלי הדם באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם מולקולות גליקו הקיימות על פני הנויטרופיל. כפי שמוצג בגרף זה, דגירה מוקדמת של תאי אנדותל המופעלים על ידי TNF אלפא עם נוגדן כנגד E סלקטין מביאה להפחתה של כ-75% ביכולתם לקשור נויטרופילים. כדי להוכיח כי בדיקה זו מעריכה בעיקר את האירועים הראשוניים מאוד של מפל הידבקות הנויטרופילים בתמונות אלה, סידן מסומן נויטרופילים הקשורים לחד-שכבות ריאה HM VEC לא מטופלות ומטופלות ב-TN ffat שהודגרו מראש עם IgG או E סלקטין בקרה.

נוגדנים פוליקלונליים מוצגים: תמונות מיקרוסקופ אור שקוף מוצגות בטור זה, בעוד שתמונות פלואורסצנטיות של אותו שדה ייחוס באמצעות סט מסנני פלואורסצאין נמצאות כאן בבארות אלה. תמונות מייצגות של הקרינה הכוללת של נויטרופילים לפני שטיפה עם PBS כפי שהודגם זה עתה מוצגות בבארות אלה. מוצגות תמונות מייצגות של הקרינה הנויטרופילית הדביקה לאחר שטיפה עם PBS כפי שהודגם זה עתה.

שימו לב, העלייה בהיענות לאחר טיפול TN FFA מופחתת בנוכחות נוגדן רב-שבטי s סלקטין. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בתאי אנדותל בריאים עם מספר מעבר נמוך ולהשתמש בדם המלא ובנויטרופילים מבודדים תוך שעתיים מרגע האיסוף.