Name: כמותי במבחנה Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: למדו שיטת מבחנה כמותית למדידת הידבקות נויטרופילים לתאי אנדותל מופעלים בתנאים סטטיים. השיטה משתמשת בסימון פלואורסצנטי ומסייעת בחקר תהליכי דלקת ומחלות אנדותליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי משרד קליפורניה בסן פרנסיסקו של טיפוח הרדמה וPerioperative.

1. ציפוי ותחזוקה של תאי אנדותל כלי הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי ולגדל תאי אנדותל כלי הדם שלך בהתאם להוראות היצרנים סיפקה. בפרוטוקול זה, תאים גדלו בתקשורת MV EGM-2 (Lonza), ומומלץ כי כל הניסויים מבוצעים תוך שבועיים מהפשרה כדי למזער את כל וריאציה בשל מספר מעבר. הניסויים שלנו עם HMVEC-ריאה מבוצעים בין קטעים 4 עד 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: כאשר תאים מגיעים 80-90% confluency, trypsinize וresuspend ב120,000 תאים למ&quot;ל. צלחת 36,000 תאים (0.3 מ&quot;ל) לכל טוב ל48 היטב, צלחת קלקר תרבית רקמה (ים). כולל בארות של HMVEC שלא יהיה מודגרות עם נויטרופילים על מנת לקבל קריאת הקרינה רקע. אלא אם כן משתמש בצלחות של 48 מתוכננות היטב במיוחד עבור מבחני הקרינה, שורות לסירוגין או עמודות תהיה למזער את זיהום אור מבארות שכנות. הערה: ולס יכול להיות מצופה מראש עם פולי-lysiנה, קולגן או פיברונקטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: הוסף מדיה טריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3: על ידי מיקרוסקופ לעומת השלב, לאשר את התאים בריאים (כלומר הופעה &quot;מרוצפת&quot; ופסולת תא קטנה), והם מחוברות 100% (איור 1). אם התאים אינם 100% ומחוברות, לשנות את התקשורת בכל יום עד שהם מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שmonolayers HMVEC מוכנה לטיפול, לשטוף את תאי פעם עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ולהוסיף 0.3 מ&quot;ל של תקשורת טרי EGM-2 MV או מדיה המכיל אגוניסט הדלקתי לבארות המתאימות. בפרוטוקול זה טופלו HMVEC-הריאות עם TNFα [100 ng / ml] (PeproTech, ניו ג&#39;רזי) עבור 3 שעות שכן מדובר במפעיל תאר היטב של ECs 21. הערה: מומלץ שזמן הניסוי שלך, כך שהתאים שלך הופעל HMVEC (שלב 4.1) וCalcein AM נויטרופילים שכותרתו (שלב 3.5) יהיו מוכנים להשתמש בו בזמן. לוקח לנו כ 2.5 שעות לבודד ולתייג neutrophש&quot;ח. </li></ol> 2. בידוד נויטרופילים באמצעות Polymorphprep <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד נויטרופילים כפי שתואר קודם לכן 22, או עם פתרון צפיפות שיפוע מוכן לבודד גרנולוציטים polymorphonuclear מכל דם. העסקת Polymorphprep בעקבות הפרוטוקול על ידי Nuzzi, et al. 2007 תוצאות בתשואות של כ 2-3 x 10 6 נויטרופילים לכל מ&quot;ל של דם מלא 23. הערה: כדי למנוע תמוגה הכדורית האדומה מוגזמת, שקיעת dextran להסיר תאי דם אדומים עשויה להתבצע לפני צנטריפוגה שיפוע צפיפות 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את פתרון שיפוע צפיפות Polymorphprep RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 30 מ&quot;ל של דם מלא מהתנדבות של אדם בריא בנוכחות נוגדת קרישה כגון הפרין, ציטרט או EDTA. הדם יש להשתמש תוך שעה 2, והמשיך בין 18-22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה 5 מ&quot;ל של דם מלא מעל 5 מ&quot;ל של פתרון שיפוע הצפיפות בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל ( <strong&gt; איור 2 א). הימנע משינוי כרכים של דם ופתרון שיפוע הצפיפות כמו זו עלולה לשנות את תנאי צנטריפוגה שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 450 עבור 30 דקות ב 18-22 ° C. ודא כדי להאיץ לאט למעלה ולמטה צנטריפוגות (כלומר לכבות את בלם צנטריפוגה), ולאזן את הצינורות היטב כדי למנוע תנודות כדי לעזור להפחית את ההפעלה של נויטרופילים ולמנוע הערבוב של שכבות. פעמים צנטריפוגה ארוכות יותר או כוח הצנטריפוגלי גבוה יותר יגרמו לשכבת יקוציט התחתונה, המכילה נויטרופילים, כדי להעביר עוד יותר מטה לכיוון לתאי הדם האדום pelleted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפלזמה ולהקת יקוציט עליונה המכילה PBMCs כדי למנוע הזיהום של השכבה המכילה נויטרופילים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet סרולוגיות מיליליטר 1-2 כדי להסיר את השכבה התחתונה המכילה יקוציט נויטרופילים. לשלב את שכבות נויטרופילים לתוך 30 מ&quot;ל של PBS (ללא Ca 2 + ו 2 + Mg) ב50 מ&quot;לצינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הנפח של עד 50 מ&quot;ל עם PBS (ללא Ca 2 + ו 2 + Mg) ו צנטריפוגות ב XG 450 עבור 10 דקות ב 18-22 ° C. </li></ol> הערה: צעדים 2.9 ו 2.10 הם אופציונלי, אך מומלץ ביותר. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. Resuspend את הנויטרופילים ב8 מ&quot;ל של מים סטריליים למשך 30 שניות לlyse תאי דם אדומים, מוסיף את ההשעיה התא באופן מיידי ל2 מ&quot;ל של PBS 5x (ללא Ca 2 + ו Mg 2 +) ולערבב בעדינות ביד. אל דגירה תאים ב מים למשך זמן ארוך יותר מ -30 שניות מאז מות נויטרופילים משמעותיים יכול להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 250 במשך 5 דקות ב18-22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי פעם אחת עם 10 מ&quot;ל של PBS (ללא Ca 2 + ו Mg 2 +) ו צנטריפוגות שוב ב 250 XG במשך 5 דקות ב18-22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הנויטרופילים ב 10 מ&quot;ל של RPMI-1640 (ללא פנול האדום) ולספור את תאי החיים באמצעות Blu trypanשיטת הדרה לצבוע דואר. הימנע מתקופות ממושכות של תאי צפיפות גדולה מ 5 x 10 6 למ&quot;ל שכן דבר עלול לגרום להפעלה של נויטרופילים. </li></ol> 3. נויטרופילים תיוג עם Calcein בוקר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 10 5 נויטרופילים x משמשים לכל גם צלחת 48 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הספירה, להעביר את תאי resuspended לצינור חרוטי 50 מ&quot;ל ולדלל את הנויטרופילים ל2-4 x 10 6 תאים לכל מ&quot;ל עם פנול RPMI-1640 ללא אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף calcein AM פתרון מניות עד 3 מיקרומטר (כלומר μl 2.98 בבוקר של calcein מניית (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לכל מ&quot;ל של תקשורת) ומערבבים היטב בעדינות על ידי מצליף את הצינורית. גדול מ 5 מיקרומטר AM calcein יגרום לדליפה מנויטרופילים. הערה: לא פלורסנט calcein בבוקר הוא ביקע בתוך התאים על ידי esterases אנדוגניים לייצר מולקולת calcein הניאון ביותר (תאים מתים כלומר לא לזרוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום ודגירת Fאו 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בהערה הכהה:. פעמים דגירה ארוכות יותר עלולות לגרום ליותר calcein להיות משוחרר מנויטרופילים במהלך assay ההידבקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 450 במשך 5 דקות ב18-22 מעלות צלזיוס, ולשטוף את הנויטרופילים 2x עם 10 מ&quot;ל של RPMI-1640 (ללא פנול אדום; מחוממת מראש ל -37 מעלות צלזיוס). לאחר resuspending התאים ללשטוף את השני, ראשון לעבור את הנויטרופילים למרות סינון סטרילי 40 מיקרומטר כדי להסיר גושים ולאחר מכן פעם נוספת בצנטריפוגות XG 450 במשך 5 דקות ב18-22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הנויטרופילים בRPMI 1640 (ללא פנול אדום; מראש חימם עד 37 מעלות צלזיוס) בשעה 2 x 10 6 נויטרופילים למ&quot;ל. </li></ol> 4. Assay מחייב נויטרופילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את monolayers HMVEC 3x עם 0.5 מ&quot;ל של המסנן מעוקר RPMI (0.22 מיקרומטר) 1640 (ללא פנול אדום) המכיל 3% BSA בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת ולהוסיף 6 x 10 5 נויטרופילים calcein שכותרתו (0.3 מ&quot;ל של התא suspension מ&quot;ל), או 0.3 של RPMI 1640 (ללא פנול האדום) ללא נויטרופילים, לבארות המתאימות צלחת הערה 48 היטב:. זו מקבילה של 8 10 5 נויטרופילים x לסנטימטר 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סה&quot;כ נויטרופילים הקרינה (PRE לשטוף): מדוד את עוצמת הקרינה של כל אחד גם עם גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 520 ננומטר (מערכת סינון והעמסת) בFLUOstar, או שווה ערך, ספקטרופוטומטר. לבצע שלב זה רק לקראת נקודת סיום הדגירה הערה: בפרוטוקול זה, עירור והגילוי של האור הנפלט calcein בוצעו מהחלק העליון של הבארות שנחשפו, עם זאת, הן יכולות גם להתבצע מהחלק התחתון של הבארות.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הבארות המכילות monolayers HMVEC ונויטרופילים 5x עם 0.5 מ&quot;ל לכל טוב של PBS (w / Ca 2 + ו Mg 2 +). הסר את המדיה ושטיפותעל ידי היפוך לצלחת, וטופח בעדינות על מגבות נייר כדי להסיר את הנוזל שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חזרה 0.3 מ&quot;ל של RPMI 1640 (ללא פנול אדום) בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסיד נויטרופילים הקרינה (POST לשטוף): מדוד את עוצמת הקרינה של כל אחד וגם בשלב 4.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הדבקות והעמידה אחוזים ביחס לכל גם: </li></ol> הערה: בשלב זה, ניתן לקבל תמונות של נויטרופילים calcein שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד ביכולת העמסת מסננים סטנדרטיים. את התמונות באיור 4 התקבלו במיקרוסקופ אולימפוס IX51 הפוך מצוידים Retiga 2000R מצלמה (ש הדמיה) באמצעות Q-Capture Pro7 תוכנה (Q הדמיה).

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Collins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+endothelial+cell+adhesion+molecules%3A+NF-kappa+B+and+cytokine-inducible+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li>
<li>Middleton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+and+surface+presentation+of+IL-8+by+venular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells.</a> Cell. 91, 385-395 (1997).</li>
<li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+binding+of+NAP-1%2FIL-8%3A+role+in+neutrophil+emigration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration.</a> Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).</li>
<li>Detmers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-activating+protein+1%2Finterleukin+8+stimulates+the+binding+activity+of+the+leukocyte+adhesion+receptor+CD11b%2FCD18+on+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils.</a> J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).</li>
<li>Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+integrin+activation+by+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte integrin activation by chemokines.</a> Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).</li>
<li>Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+tethering+on+E-selectin+activates+beta+2+integrin+binding+to+ICAM-1+through+a+mitogen-activated+protein+kinase+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway.</a> J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+consequences+of+neutrophil+interaction+with+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).</li>
<li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of leukocyte transendothelial migration.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Cinderella+of+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330, 362-366 (2010).</li>
<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li>
<li>Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+neutrophil-mediated+monocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment.</a> Blood. 114, 4613-4623 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+endothelial+TLR2+by+bacterial+lipoprotein+upregulates+proteins+specific+for+the+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response.</a> Innate Immun. 18, 602-616 (2012).</li>
<li>Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22The+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labelling+Technologies%22">The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies</a>. , 10, (2005).</li>
<li>Shin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipoprotein+TLR2+agonists+broadly+modulate+endothelial+function+and+coagulation+pathways+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).</li>
<li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK5+protein+promotes%2C+whereas+MEK1+protein+differentially+regulates%2C+the+Toll-like+receptor+2+protein-dependent+activation+of+human+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes.</a> J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).</li>
<li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745(2008).</li>
<li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).</li>
<li>Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+to+detect+nuclear+factor+activation+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (74), e50410(2013).</li>
<li>Kuma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIRB796+inhibits+all+p38+MAPK+isoforms+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).</li>
<li>Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+production+and+E-selectin+expression+in+activated+endothelial+cells+are+inhibited+by+p38+MAPK+%28mitogen+activated+protein+kinase%29+inhibitor+RWJ+67657%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657.</a> International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).</li>
<li>Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+polymorphonuclear+cells+to+human+endothelial+cells.+Adhesion-molecule-dependent%2C+and+Fc+receptor-mediated+adhesion-molecule-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms.</a> Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).</li>
<li>Akeson, A. L., Woods, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorometric+assay+for+the+quantitation+of+cell+adherence+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells.</a> Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).</li>
<li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).</li>
<li>De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+dyes+in+the+determination+of+adherence+of+human+leucocytes+to+endothelial+cells+and+the+effect+of+fluorochromes+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function.</a> Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).</li>
<li>Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+acts+on+cultured+human+vascular+endothelium+to+increase+the+adhesion+of+polymorphonuclear+leukocytes%2C+monocytes%2C+and+related+leukocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines.</a> The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).</li>
<li>Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+vascular+endothelial+cells+acquire+adhesiveness+for+neutrophils+after+stimulation+with+interleukin+1%2C+endotoxin%2C+and+tumor-promoting+phorbol+diesters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters.</a> J. Immunol. 136, 649-654 (1986).</li>
<li>Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+adherence+of+neutrophils+to+umbilical+vein+endothelium+by+human+recombinant+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).</li>
<li>Braut-Boucher, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-isotopic%2C+highly+sensitive%2C+fluorimetric%2C+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).</li>
<li>Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelium%3A+physiological+functions+and+role+in+microcirculatory+failure+during+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).</li>
<li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+Toll-like+receptor-4+is+the+key+molecule+in+LPS-induced+neutrophil+sequestration+into+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+endothelial+cell+platelet-activating+factor+production+and+inflammatory+cell+adherence+are+increased+in+response+to+cigarette+smoke+component+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).</li>
<li>Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathogenic+roles+of+microvasculature+in+inflammatory+bowel+disease%3A+a+Jack+of+all+trades%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).</li>
<li>Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Wegener%26%2339%3Bs+granulomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+de+Medecine+Interne%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Wegener&#39;s granulomatosis.</a> Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+inflammatory+cell+involvement+in+brain+arteriovenous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations.</a> Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).</li>
<li>Martens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+which+bind+to+E-selectin+and+block+neutrophil+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion.</a> J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

השלבים הקריטיים ביותר לנויטרופילים מוצלחים / assay הידבקות תא אנדותל כלי הדם הם: 1) שימוש במספר נמוך מעבר (&lt;9), תאי האנדותל בריאים: 2) שמירה על נויטרופילים הבודדים בצפיפות נמוכה (כלומר &lt;5 x 10 6 תאים כביסה ו3) השקדנית של נויטרופילים AM-שכותרתו Calcein ולהשתמש של נויטרופילים AM-שכותרתו Calcein מבעוד מועד כדי למזער את זיהום EC ואובדן calcein מנויטרופילים, בהתאמה; / מ&quot;ל) ולהשתמש בהם בתוך שעתיים של בידוד . <p class="jove_content" style=";text-align:r...

מאז האנדותל של כלי הדם הוא במגע ישיר עם הדם במחזור, הוא ממוקם באופן ייחודי כדי ליזום תגובה דלקתית מהירה במהלך זיהום או פציעה. תאי האנדותל (ECs) הקולטנים דפוס הכרה מפורש שמזהים מגוון רחב של רכיבים נשמרים חיידקים ומולקולות סכנה, וקולטנים למארחות מתווכים דלקתיים כגון TNFα. הפעלה של קולטנים אלה גורמת להפריש ציטוקינים ECs (למשל IL-6, IL-8, CXCL1 וCCL2), וכדי upregulate מולקולות דבק (למשל E / P-selectin, VCAM-1 וICAM-1) בתא השטח שלהם 1 , 2. מולקולות אלה כל להקל על הלוקליזציה של לויקוציטים לאתרים של זיהום ופגיעה במטרה לנקות את המארח של חומרים מזהמים וליזום תיקון רקמות 3,4. תגובת נויטרופילים לזיהום כרוכה ביחסי גומלין מתואם היטב בין האנדותל של כלי הדם ולהגיב נויטרופילים. עם הפעלת EC, IL-8 מופרש ויוצרים שיפוע intravascular על האנדותל המאפשר לבית נויטרופילים לאתר של זיהום או פגיעה 5,6. לכידת נויטרופילים E / P-selectins לתווך ומתגלגל באמצעות עמותות חלשות יחסית עם glycomolecules על פני תא נויטרופילים. אינטראקציות אלה, יחד עם IL-8 נקשרים לרצפטורים מאותו המקור שלו, להקל על התקשרות האיתנה, integrin בתיווך וסופו של דבר מעצרו של נויטרופילים על פני התא האנדותל 7-10. לאחר מעצרו, נויטרופילים יכולים לנדוד אל מחוץ לכלי דם לאתרים הספציפיים של זיהום לחסל פתוגנים ישירות, ליצור מלכודות תאי נויטרופילים כדי למנוע ההתפשטות של פתוגנים, לקדם ריפוי פצע ולשחרר גורמים נוספים שמגייסים לויקוציטים אחר כגון מונוציטים, מקרופאגים ודנדריטים תאי 11-17. שתוארה בדוח זה הוא שיטה במבחנה לכמת דבקות נויטרופילים לmicrovascular ECS לאחר הפעלה על ידי מארח המתווך הדלקתי TNFα. assay זה נועד להעריך את ההפעלה של ECS, ולא נויטרופילים. נויטרופילים אנושיים עיקריים הם ראשון מבודדים באמצעות הפרדת שיפוע צפיפות, ולאחר מכן, שכותרתו עם calcein acetoxymethyl (PM). Esterases בתוך התאים החי Hydrolyze calcein בבוקר ועד מולקולת calcein ניאון מאוד עם עירור של 492-495 ננומטר ופליטות של 513-516 ננומטר 18. את הנויטרופילים fluorescently שהכותרת מודגרת מכן עם monolayers EC, ונויטרופילים שאינם חסיד הם הוסרו לאחר מכן. הקרינה של נויטרופילים הנותרים, כבול לאחר מכן נמדד בעזרת ספקטרופוטומטר הקרינה, ומחושבת כאחוז מקלט הקרינה נויטרופילים המוחלט בכל טוב. לשיטה זו יתרון הנוסף שנויטרופילים הכפותים calcein שכותרתו משמשים בספקטרופוטומטריה ניתן ישירות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתת איכותי יותר לקרוא מתוך EC ACtivation. מאז assay זה מתבצע בתנאים סטטיים, רק את האירועים מאוד ראשוניים המתרחשים במפל הידבקות נויטרופילים ייבחנו. זה אושר בדוח זה באמצעות נוגדנים החוסמים דואר selectin להראות כי דבקות נויטרופילים לריאות אנושית TNFα שטופל כלי הדם EC (HMVEC-ריאות) monolayers מצטמצמת באופן דרסטי כשמופרת האינטראקציה עם E-selectin. בנוסף לTNFα, השתמשו בהצלחה assay זה כדי לקבוע את מידת הפעלת EC וריד טבור האנושית (HUVEC) על ידי הקולטן חיוג כמו אגוניסטים 1/2 ליפופרוטאין peptidoglycan קשורה (PAL), ליפופרוטאין murein (MLP) וPam3Cys ו הפעלת HMVEC-ריאות על ידי Pam3Cys 19,20. בנוסף, השתמשנו בהצלחה assay זה במעכבי קינאז, ולאחר מציאה RNAi בתיווך של פני השטח וחלבוני cytoplasmic בHMVEC-ריאות, מה שמרמז כי מתודולוגיה זו תואמת עם מגוון רחב של יוכימי וscreening מבחני 20. לסיכום, assay זה מספק דרך קלה לשימוש לשחזור, יותר פונקציונלית, כדי לגשת למידה של הפעלת EC ידי מתווכים דלקתיים במבחנה.

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>ניתן להחליף בכל ספק</td></tr><tr><td>48 בארות צלחות תרבית רקמות</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (ללא פנול אדום)</td> <td>מתקן תרבית תאים UCSF</td><td>CCFAL001</td><td>ניתן להחליף בכל ספק</td></tr><tr><td>D-PBS (ללא Ca2+ ו-Mg2+ ופנול אדום)</td><td></td><td>ניתן להחליף CCFAL003</td> <td>מתקן תרבית תאים UCSF</td> בכל ספק</tr><tr><td>RPMI-1640 (ללא פנול אדום)</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>סידן AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3099</td> <td>(0.995 מ"מ) מלאי soln</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; מסנני M</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>ניתנים להחלפה בכל ספק</td></tr><tr><td>FLUOstar OPTIMA ספקטרופוטומטר</td><td>BMG LABTECH-</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

האנדותל של כלי הדם ממלא חלק בלתי נפרד בתגובה הדלקתית. בשלב החריף של דלקת, תאי האנדותל (ECs) מופעלים על ידי מתווכים מארחים או ישירות על ידי רכיבים נשמרים חיידקים או מולקולות סכנת מארח הנגזרות. ציטוקינים הופעלו ECS Express, כמוקינים ומולקולות הדבקה שיתגייסו, להפעיל ולשמור על כדוריות דם לבנות באתר של זיהום או פציעה. הנויטרופילים הם לויקוציטים הראשון שהגיע, ולדבוק האנדותל באמצעות מגוון רחב של מולקולות הדבקה בהווה על פני השטח של שני התאים. תפקידיה העיקריים של נויטרופילים הם לחסל את החיידקים ישירות איומים, לקדם הגיוס של לויקוציטים אחר דרך שחרורו של גורמים נוספים, וליזום תיקון פצע. לכן, גיוסם וההתקשרות לאנדותל הוא שלב קריטי בייזום של התגובה הדלקתית. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים בassay הידבקות נויטרופילים מבחנה באמצעותcalcein AM-שכותרתו נויטרופילים אנושיים עיקריים לכמת את מידת הפעלת תא אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים. לשיטה זו יתרון הנוסף שאותם הדגימות נבדקות ועל ידי ספקטרופוטומטריה הקרינה יכולות גם להיות דמיינו ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי להערכה איכותית יותר של כריכת נויטרופילים.

על מנת לקבל תוצאות אמינות, לשחזור באמצעות assay מחייב נויטרופילים, זה חיוני כי הבריאות וconfluency של תאי אנדותל כלי הדם הם אופטימלית ביום של assay, כפי שמודגם בHMVEC-ריאות באיור 1. בנוסף, זוהי חובתו של כלי הדם מספר המעבר הנמוך ECs משמש (כלומר פחות מ 9 קטעים), ובהתאם לכך, אנו ממליצים לבצע את כל הניסויים תוך שבועיים מההפשרה. בריאותם של הנויטרופילים גם היא בעל חשיבות עליונה, במיוחד מאז calcein בבוקר לא יהיה חילוף חומרים למולקולת calcein ניאון אם התאים מורכב...

דבקות נויטרופילים לאנדותל מופעל באתרים של זיהום היא מרכיב בלתי נפרד של התגובה הדלקתית של המארח. שתואר בדוח זה הוא assay מחייב נויטרופילים המאפשרים<em&gt; במבחנה</em&gt; Quantitation של נויטרופילים אנושיים ראשוניים מחייב לתאי האנדותל מופעלים על ידי מתווכים דלקתיים בתנאים סטטיים.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את מידת ההפעלה הדלקתית של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, על ידי כימות מספרן היחסי של נויטרופילים הנצמדים לתאי האנדותל in vitro בתנאים סטטיים. הדבר מושג תחילה על ידי טיפול בשכבות חד-שכבתיות (monolayers) תקינות וצפופות של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עם הגירוי הניסויי הרצוי במהלך השלב השני. נויטרופילים מבודלים ממתנדבים אנושיים בריאים ולאחר מכן מסומנים עם calcium am.בשלב הבא, מוסיפים את הנויטרופילים המסומנים לתאי האנדותל ומאפשרים להם להיצמד למשך 20 דקות, שבמהלכן נמדדת מדידת טרום-שטיפה באמצעות ספקטרו-גאומטריה של פלואורסצנציה. בשלב הסופי, שוטפים את הנויטרופילים שאינם צמודים, ולאחר מכן נערכת מדידת לאחר-שטיפה. לבסוף, ניתן לקבוע את אחוז ההיצמדות וההיצמדות היחסית של הנויטרופילים המסומנים בסידן לשכבות התאים האנדותליים תחת כל תנאי טיפול.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הדלקתית האנושית, שכן היא מאפשרת לקבוע את המידה היחסית של הפעלה דלקתית של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים בתנאים שונים. בנוסף, למבחן זה יש פוטנציאל לשמש ככלי למחקר תהליכי מחלה אנושיים המבוססים על האנדותל ומערבים קישור של לוקוציטים לאנדותל המיקרו-וסקולרי. ביום ביצוע המבחן, השתמש במיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (phase contrast) כדי לוודא שהתאים מראים מראה בריא של "cobblestone" עם מעט שיירי תאים ושהם נמצאים ב-100% confluent.ברגע ששכבות המונואלייר של HM VEC מוכנות לטיפול, שטפו את התאים פעם אחת עם HBSS ולאחר מכן הוסיפו 0.3 milliliters של מצע גידול רענן לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עם או ללא אגוניסט דלקתי לבארות המתאימות. במקרה זה, תאי HM VEC ריאה מטופלים ב-TNF alpha למשך שלוש שעות כדי לבודד נויטרופילים. ראשית, בעזרת Polymorph prep, הביאו את תמיסת מדרג הצפיפות לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לאחר איסוף של 30 milliliters של דם מלא ממתנדב אנושי בריא בנוכחות נוגד קרישה, שכבו 5 milliliters מהדם מעל 5 milliliters של Polymorph prep בתוך מבחנה קונית של 15 milliliters.הפרידו את הדם השלם למשך 30 דקות ב-450 ×g ובטמפרטורה של 18 עד 22 °C עם הפעלת הבלם (break), תוך וידוא כי המבחנות מאוזנות היטב. לאחר מכן, שאבו את הפלזמה הצהובה ואת השכבות המכילות PBMC כדי למנוע זיהום של שכבת הנויטרופילים הוורודה והעכורה. כדי להסיר את הנויטרופילים, שאבו את שכבת הנויטרופילים באמצעות פיפט סרולוגית של 1 עד 2 מיליליטר, תוך סיבוב איטי של הפיפט והמבחנה.העבירו את הנויטרופילים ממספר מבחנות למבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 30 מיליליטר של PBS נטול סידן ומגנזיום. השלימו את הנפח ל-50 מיליליטר באמצעות PBS נטול סידן ומגנזיום נוסף. לאחר סבוב של התאים בצנטריפוגה, שאבו את הנוזל העליון ולאחר מכן בצעו רסוזפנסיון.השעה את הנויטרופילים בשמונה מיליליטר של מים סטריליים כדי להסיר תאי דם אדומים לאחר 30 שניות. הוסף במהירות את שמונת המיליליטר של תרחיף התאים לשני מיליליטר של 5x PBS נטול סידן ומגנזיום, ולאחר מכן ערבב בעדינות. לאחר סבוב נוסף של התאים במcentroid, שטוף את התאיים פעם אחת ב-PBS נטול סידן ומגנזיום, ואז השעה מחדש את המשקע ב-10 מיליליטר של RPMI 1640 ללא phenol red וספור את התאים החיים בשיטת exclusion של trypan blue.לאחר הספירה, העבירו את התאים שהחזרו למצב של סספנזיה למבחנה קונית של 50 מיליליטר ודללו את הנויטרופילים לריכוז של 2 עד 4 מיליון תאים למילליליטר באמצעות RPMI 1640 ללא phenol red. לאחר מכן, הוסיפו לתאים תמיסת עבודה טרייה של סידסיום לריכוז של 3 מיקרומולר. ערבבו את סספנזיית התאים על ידי הפיכה עדינה של המבחנה מספר פעמים, ולאחר מכן הדגרימו את המבחנה, כשהיא מכוסה בנייר אלומיניום, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר 30 דקות, סבבו בצנטריפוגה את הנויטרופילים המסומנים ולאחר מכן שטפו את המשקע פעמיים ב-10 milliliters של RPMI 1640 ללא Phenol red בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, תוך העברת תרחיף התאים דרך מסנן סטרילי של 40 micron כדי להסיר גושים לפני הסבב השני בצנטריפוגה. השביו את הנויטרופילים ב-10 milliliters של 37 degrees Celsius.RPMI 1640 ללא פנול אדום. לאחר מכן, לאחר ספירה נוספת של התאים, דללו אותם ל-2 מיליון תאים למיליליטר. כעת שטפו את שכבות המבנה (monolayers) של תאי HM vec שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר של RPMI 1640 ללא פנול אדום, שעבר סינון של 0.22 מיקרון וסטריליזציה ומכיל 3% BSA לכל באער. לאחר השטיפה השלישית, שאבו את המדיום והוסיפו 600,000 נויטרופילים מסומני סידן ב-0.3 מיליליטר של תרחיף תאים, או 0.3 מיליליטר של RPMI 1640 ללא פנול אדום ללא נויטרופילים, לבאערים המתאימים בפלטת 48 הבאערים. לאחר מכן, דגרו את תרביות השיתוף (co-cultures) למשך 20 דקות ב-37 °C עם 5% carbon dioxide, ומיד לפני סיום תקופת הדגירה, מדדו את עוצמת הפלואורסצנציה של כל באער בספקטרופוטומטר באורך גל עירור של 485 ננומטר ובאורך גל פליטה של 520 ננומטר.לאחר מכן, הפוך את הפלטה כדי להסיר את המצע וטפח בעדינות על מגבונים נייר להסרת שאריות נוזל. שטוף חמש פעמים את הבארים המכילות את שכבות המונו-לייר של hm ve ונויטרופילים עם 0.5 milliliters לכל באר של PBS עם סידן ומגנזיום, תוך הסרת ה-PBS באותה הדרך בכל פעם.רעננו את הבארות עם 0.3 milliliters של RPMI 1640 נקי מפנול אדום לכל בארה, ולאחר מכן מדדו את עוצמת הפלואורסצנציה של כל בארה כפי שהודגם זה עתה. לבסוף, בעזרת נוסחאות אלו, קבעו את אחוז ההיצמדות וההיצמדות היחסית לכל בארה. כדי להשיג תוצאות מהימנות וניתנות לשחזור באמצעות בדיקת קישור נויטרופילים, חיוני שבריאותן ובצפיפותן (confluency) של תאי האנדותל המיקרו-וסקולריים תהיה אופטימלית ביום הבדיקה. שימו לב למראה ה"cobblestone" ולצפיפות הכוללת של השכבות החד-שכבתיות (monolayers) באמצעות ספקטרופוטומטר Fluor star Optima.לדוגמה, שימו לב כי ה-OD של הפלואורסצנציה ב-520 nanometers נמצא בתוך הטווח הליניארי כאשר מנתחים בין 10,000 למיליון נויטרופילים מסומנים. באופן מעניין, ככל שמוסיפים יותר נויטרופילים לשכבות מונו-שכבה של HM VEC lung שטופלו באגוניסט דלקתי, אחוז ההיצמדות עולה. הוכח בעבר כי P 38 map kinase נחוץ לביטוי של e selectin.בתאי אנדותל אנושיים שטופלו ב-TNF alpha, ועיכובו מפחית את מספר הנויטרופילים הנצמדים, כדי להדגים כי מספר הנויטרופילים שנוספו לבארות הוא שרירותי, כל עוד מספר התאים שנעשה בהם שימוש נמצא בטווח הליניארי של הספקטרופוטומטר. כאן מוצג מבחן היצמדות של נויטרופילים בתאי ריאה HM VEC שטופלו ב-TNF alpha, בהיעדרו או בנוכחותו של מעכב P38 map kinase מסוג BIRB 796. תוצאות אלו מראות כי הירידה היחסית בקישור הנויטרופילים לאחר עיכוב P38 mapk היא דומה.בשלב זה, ללא קשר למספר הנויטרופילים בכל באר, לקטין מבוטא על פני השטח של התאי האנדותלייאלים לאחר טיפול ב-TNF alpha ולוכד נויטרופילים ממערכת כלי הדם באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם מולקולות גליקו הנמצאות על פני השטח של הנויטרופיל. כפי שמוצג בגרף זה, דגירה מוקדמת של תאי אנדותל שהופעלו על ידי TNF alpha עם נוגדן נגד E selectin גורמת להפחתה של כ-75% ביכולתם לקשור נויטרופילים. כדי להדגים כי בדיקה זו מעריכה בעיקר את האירועים הראשוניים ביותר של קסקדת היצמדות הנויטרופילים, מוצגות בתמונות אלו נויטרופילים מסומני סידן הקשורים לשכבות מונו-לייר של HM VEC ריאה שלא טופלו או שטופלו ב-TNF alpha, אשר עברו דגירה מוקדמת עם IgG בקרה או עם E selectin.תמונות במיקרוסקופ אור שקוף של נוגדנים פוליקלונליים מוצגות בעמודה זו, בעוד שתמונות פלואורסצנציה של אותו שדה ייחוס באמצעות סט מסנני פלואורסצאין מוצגות בבארים אלו. תמונות מייצגות של פלואורסצנציית נויטרופילים כוללת לפני שטיפה ב-PBS, כפי שהודגם זה עתה, מוצגות בבארים אלו. מוצגות תמונות מייצגות של פלואורסצנציית נויטרופילים דבקים לאחר שטיפה ב-PBS, כפי שהודגם זה עתה.שימו לב כי העלייה בהיצמדות לאחר טיפול ב-TN FFA פוחתת בנוכחות נוגדן פוליקלונלי ל-s selectin. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש בתאי אנדותל בריאים עם מספר מעברים נמוך, ולהשתמש בדם מלא ובנויטרופילים מבודדים בתוך שעתיים מרגע האיסוף.

quantitative-vitro-assay-to-measure-neutrophil-adhesion-to-activated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

בסרטון זה אנו מדגימים בדיקה המשתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות הידבקות של תאים סרטניים למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NET). בבארות הבדיקה ניכרת עלייה ניכרת במספר התאים הסרטניים המסומנים באופן פלואורסצנטי הנצמדים ל-NETs, בעוד שבבארות שטופלו ב-DNase נרשמה היצמדות מופחתת של תאים סרטניים ל-NETs.

בדיקת הידבקות חוץ גופית לאיתור היצמדות של תאים סרטניים למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים

נדידת חיידקים טרנס-אפיתל נויטרופילים בתגובה לזיהום חיידקי ריר תורמת לפגיעה באפיתל ומחלות קליניות. פותח מודל במבחנה המשלב פתוגן, נויטרופילים אנושיים ושכבות תא אפיתל אנושיות מקוטבות הגדלות על מסנני טרנסוול כדי להקל על חקירות לקראת פענוח המנגנונים המולקולריים המתזמרים תופעה זו.

במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל

שיטה של ​​quantitating הידבקות נויטרופילים היא מדווחת. שיטה זו יוצרת זרימת סביבה דינמית דומה לזו שנתקלה בה בכלי דם. זה מאפשר החקירה של הידבקות נויטרופילים לשתי מולקולות מטוהרים הידבקות (ליגנד) או מצע תא אנדותל (HUVEC) בהקשר דומה לסביבת in vivo עם לחץ העצום.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

אנו מדווחים על שיטה במבחנה המאפשרת לכמת את המספר האמיתי של תאי דבק בתוך חד-שכבת תא אנדותל.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

אנדותל כלי הדם שולט בחוזקה ליקוציט גיוס. ליקוציט לקוי extravasation תורם למחלות דלקתיות. לכן, בחיפוש אחר הרומן יסודות ההפעלה אנדותל תקינה יש צורך לעצב משופרת טיפולים עבור הפרעות דלקתיות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה לאפיון הרומן הרגולטורים אנדותל היכולות לשנות ליקוציט סחר בעת דלקת.

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

למדו שיטת מבחנה כמותית למדידת הידבקות נויטרופילים לתאי אנדותל מופעלים בתנאים סטטיים. השיטה משתמשת בסימון פלואורסצנטי ומסייעת בחקר תהליכי דלקת ומחלות אנדותליות.

כמותי

גלה סרטונים נוספים