Microfabrication של דפוסי זהב Nanoporous לסלולרי מהותי מחקרי אינטראקציה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר דפוסי מיקרו זהב נקבוביים ננו ולהדגים את תאימותם לתרבית תאים. זה מושג על ידי יצירת מסכות סטנסיל או ליטוגרפיה לצילום. השלב השני הוא לפזר זהב וכסף דרך המסכות כדי לעצב את סגסוגת המבשר לזהב נקבובי ננו.

לאחר מכן, דפוסי סגסוגת הכסף הזהב עוברים סגסוגת בחומצה חנקתית כדי לייצר ציפויי זהב נקבוביים ננו. השלב האחרון הוא תרבית תאים מעל דפוסי המיקרו של זהב ננו נקבובי וצביעת חיסון בסופו של דבר מיקרוסקופ אלקטרונים סורק יחד עם ניתוח תמונה משמשים לכימות אינטראקציות של חומרי התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות ליצירת ציפויים ננו-מובנים, כגון צינורות ננו פחמן, הוא שזהב נקבובי ננו נהנה מתאימות מיקרו-ייצור, שטח פנים יעיל גבוה, קלות פונקציונליזציה עם כימיה מבוססת אריחים, מוליכות חשמלית ותאימות ביולוגית.

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחומי מדעי החומרים והביו-הנדסה, כגון השפעת ננו-מבנה החומר על תכונות חשמליות, מכניות, ביולוגיות וכימיות. אם כי שיטה זו מספקת תובנה לגבי השפעת מבנה הננו על מורפולוגיה של התא. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון פיתוח מערכות אספקת תרופות ביו-חיישנים ופלטפורמות אחסון אנרגיה.

התחל הליך זה על ידי ניקוי שקופיות מיקרוסקופ בגודל 1 אינץ' על 3 אינץ' והחלקות כיסוי קטנות עם תמיסת פיראנה טען את הכיסוי הקטן מחליק לתוך סירת צביעה חיסונית מחרסינה וטבול את הסירה ואת שקופית המיקרוסקופ בתמיסת פיראנה. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים על הליך הניקוי. לאחר הניקוי, העבירו את הדגימות לכלי התגבשות ושטפו אותן במים למשך שלוש דקות.

הניחו את הדגימות על מגבות נטולות מוך וייבשו אותן בעזרת אקדח חנקן ליצירת דפוסים בקנה מידה מילימטר. אגרוף יריעות אלסטומר סיליקון בעובי 250 מיקרון בעזרת אגרוף ביופסיה. נקו את יריעות האלסטומר המעובדות על ידי טבילתן באיזופרופנול של 70% ולאחר מכן יבשו אותן בעזרת אקדח חנקן.

לאחר מכן הניחו את דף האגרוף על מגבת נטולת מוך ויישרו את החלקות הכיסוי הנקיות מעל השבלונה כשמשטח המדגם פונה לשבלונה. העבירו את השבלונה עם החלקות הכיסוי על פרוסת מנשא ליצירת דפוסים בקנה מידה תת-מילימטרי. הניחו מיקרוסקופ נקי, החליקו על צ'אק מסתובב ופוצצו את כל החלקיקים בעזרת אקדח חנקן.

הוצא 1.5 מיליליטר של הקס מתיל דילאן על מגלשת הזכוכית. בעזרת פיפטה מפלסטיק, מורחים את הקסקס מתיל דילאן על ידי סיבוב המגלשה ברצף ב-500 סל"ד למשך חמש שניות ו-1500 סל"ד למשך 30 שניות. בסיום, אופים את השקופית על צלחת חמה בחום של 115 מעלות צלזיוס במשך שבע דקות, ואז נותנים לה להתקרר במשך חמש דקות.

לאחר מכן, חלקו ארבעה מיליליטר של תמונה חיובית. התנגד על מגלשת הזכוכית. הפזר את ההתנגדות לתמונה על ידי סיבוב השקופית תוך שימוש בתנאים שתוארו קודם לכן.

אופים את השקופית על צלחת חמה בחום של 115 מעלות צלזיוס למשך 1.5 דקות ומסירים אותה לאחר חשיפה ל-UV ואפייה. ממיסים את התמונה החשופה. התנגד על ידי הטבעת השקופית בתמונה חיובית.

התנגד למפתח למשך 3.5 דקות לפחות. בסיום, שטפו את השקופית היטב במי DI ובדקו את הדפוסים המפותחים תחת מיקרוסקופ אופטי. לאחר מכן, טען את הדגימות למכונת מקרטעת שיכולה להפקיד באופן עצמאי זהב, כסף וכרום.

נקה את הדגימות למשך 90 שניות ב-50 וואט באווירת עיבוד ארגון של 25 מיליטור, לפני תחילת שקיעת המתכת מתחת לכרום ארגון מקרטע של 10 מיליטור, למשך 10 דקות ב-300 וואט. לאחר מכן התזת זהב למשך 90 שניות ב-400 וואט, ולאחר מכן התזת זהב וכסף למשך 10 דקות עם כסף ב-200 וואט וזהב ב-100 וואט. כבה את מקור התזת הזהב כ-10 שניות לפני כיבוי מקור התזת הכסף.

הסר את הדגימות ממכונת המקרטעת לאחר הוצאת הדגימות ממכונת המקרטעת. סוניקציה אותם בכ -180 מיליליטר של תמונה חיובית. התנגד לחשפנית למשך 10 מחזורים של סוניקציה 22 עם הפסקות של שתי דקות בין המחזורים.

בסיום, שטפו את הדגימות במים ומייבשו אותן בעזרת אקדח חנקן. בדוק את דפוסי המתכת במיקרוסקופ. לאחר מכן מקלפים את שבלונה האלסטומר מהדגימות המצופות שאינן עמידות לצילום באמצעות שתי פינצטה כדי לחשוף את המתכת המופקדת.

טפל בהחלקות הכיסוי הקטנות עם פלזמת אוויר ב-10 וואט למשך 30 שניות לפני טבילתן בחומצה חנקתית. דה סגסוגת המיקרוסקופ מחליק על ידי טבילתם בכוס של 70% חומצה חנקתית ב-55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר השלמת הסגסוגת, שטפו את הדגימות על ידי טבילתן ברציפות בכוסות מים שלוש פעמים כל אחת.

הניחו את הדגימות על מגבות נטולות מוך וייבשו אותן בעזרת אקדח חנקן. התאם את הטמפרטורה של פלטה חמה בין 150 ל -300 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הורד את הדגימות לאט על המשטח החם כדי למזער את שינוי הטמפרטורה הפתאומי.

לאחר חמש דקות, הוציאו את הדגימות מהפלטה החמה לצינון. מניחים את דגימות הזהב הננו נקבוביות בכלי פוליסטירן ומטפלים בהן בפלזמת אוויר ב-10 וואט למשך 30 שניות. לאחר מכן העבירו את הדגימות ל-24 צלחות תרבית רקמות באר.

הוסף 500 מיקרוליטר של מדיית תרבית שלמה לכל אחד. ובכן אחסן את הצלחות בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו -5% CO2 עד לזריעת התאים. שמור על תאי אסטרוציטים של עכברים בצלוחיות T 75 עם מצע תרבית.

ברגע שהתאים מתכנסים ב-70%, העבירו אותם על ידי הסרת המדיה הישנה ושטיפת התאים עם PBS. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים על תנאי הנוסע. לאחר הוצאת צלחות התרבות מהחממה, שאפו את המדיה המושקעת מהבארות וזרעו את התאים על הזכוכית.

הכיסוי מחליק בצפיפות של 25,000 תאים לסנטימטר רבוע עם נפח סופי של מיליליטר אחד. נענע את צלחת התרבות כדי להבטיח ציפוי אחיד של תאים מעל הדגימות והנח את צלחת התרבות בחממה כאשר התאים מוכנים לניתוח. הסר את המדיה המושקעת מהבארות ושטוף אותם פעמיים עם PBS.

לאחר שהתאים התקבעו ב-4%para formaldehyde ב-PBS ושטפו פעמיים, חללו אותם ב-500 מיקרוליטר של 0.1% Triton X 100 ב-PBS למשך חמש דקות. חזור על שטיפת ה- PBS פעמיים והעביר את התאים לבארות נקיות. כתם 80 מיקרוליטר מתמיסת הצביעה על הדגימות ואחסן אותן מכוסות בנייר אלומיניום למשך 20 דקות.

לאחר שטיפת PBS נוספת, צבעו את התאים בשלושה ננו-מולרים של DPI ב-PBS למשך חמש דקות. שטפו תאים עם PBS פעם נוספת וטבלו אותם ב- di ואז הרכיבו את התאים על זכוכית. כסו את השקופיות במדיית הרכבה ואטמו אותן בתמונת לק שקופה.

משטחי הזהב הננו נקבוביים עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם הגדלה של פי 50, 000 באנרגיית אלקטרונים של 10 קילו-וולט באמצעות גלאי אלקטרונים משני. לאחר מכן, צלם תמונות תאים מרוכבות בנקודות שונות בדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של פי 10 עם קוביות הסינון המתאימות. פתח את התמונות בתמונה J.פצל את התמונות לערוצים בודדים.

המירו אותם לשמונה הצעות. הפחיתו את הרקע והחליקו אותם על ידי סינון חציוני. לאחר מכן התאם את הסף באופן ידני כדי להדגיש את הנקבוביות, גופי התאים והגרעינים.

השתמשו בפקודה 'פרשת מים' להפרדת נקבוביות או תאים ממוזגים. הגדר פרמטרים לניתוח חלקיקים ובצע את הפקודה כדי לחלץ את מספר החלקיקים, השטח הממוצע ואחוז הכיסוי על ידי חלקיקים. לבסוף, שנה את קבצי המאקרו הכלולים כדי לבצע ניתוח אצווה של תמונות מרובות.

שינוי הצבע של דפוסי המתכת המופקדים לפני ואחרי סגסוגת d מוצג כאן. הגימור הכסוף נובע מתכולת הסגסוגת העשירה בכסף על הסגסוגת. הסרט מקבל גוון חום כתום בעליל.

מוצגים כאן התכונות העדינות יותר המיוצרות על ידי פוטו ליטוגרפי. דפוס המתכת. ניתן להשיג מורפולוגיות גרועות שונות על ידי טיפול תרמי בסרטי הזהב הננו-נקבוביים.

תמונת החתך מגלה אם הסרטים מסגסוגת באופן אחיד דרך עובי הסרט. ניתן לפלח את תמונות מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק לתמונות בינאריות לקביעת הגודל ואחוז הכיסוי על ידי חללים. ניתן להוריד את הקוד ליצירת פלט זה מדף האינטרנט של JoVE.

תמונה פלואורסצנטית מייצגת של תאי אסטרוציטים עכבריים דבקים שגודלו על משטח זהב ננו נקבובי מוצגת כאן. ניתן לפצל ולפלח את הערוצים הבודדים של התמונה כדי לייצר תמונות בינאריות לניתוח אינטראקציה של חומר תא. ניתן להשתמש בתמונות שלד תא מפולחות לכימות שטח התא וכיסוי פני השטח.

בעוד שתמונות הגרעין התא המפולח שימושיות לספירת תאים. ניתן להוריד את הקודים ליצירת פלטים אלה מדף האינטרנט של JoVE. מוצג כאן סיכום חזותי של כשלים בייצור מבני זהב נקבוביים ננו, כולל הידבקות סרט PO, היעדר נקבוביות וטיפול תרמי מוגזם.

בעקבות הליך זה, שיטות אחרות מציעות שניתן לבצע אפיון אלקטרוכימי במיקרוסקופ יער, ליזה של תאים ו-PCR כדי לענות עוד יותר על שאלות נוספות כגון השפעת הידבקות תאים ננו-מבנים וביטוי גנים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר דפוסי זהב של ננו-נקבוביות ולכמת את האינטראקציות שלהם עם תאים על ידי ניתוח תמונה דיגיטלית של מיקרוסקופיה. תוצאות. אל תשכח שעבודה עם חומצה חנקתית, חומצת גופרית ומי חמצן עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כולל גידול ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.