לדמיין את ההשפעות של ניסיון מוקדם חיובי, מישוש גירוי, על דנדריטים מורפולוגיה וSynaptic קישוריות עם Golgi-קוקס מכתים
25 בספטמבר 2013
מאמר זה מתאר את הנהלים לגירוי חוש המישוש של גורי חולדה ומכתים Golgi-קוקס הבא של מורפולוגיה עצבית. גירוי חוש המישוש הוא חוויה חיובית כי הוא מנוהל בתקופה סביב הלידה על ידי מלטף את הגורים עם מטלית משק בית. מכתים Golgi-קוקס הוא הליך אמין המאפשר ההדמיה של כל הנוירונים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בטכניקות צביעת gold G Cox כדי להדמיאן את השינויים המורפולוגיים בנוירונים המתרחשים בעקבות גירוי מגע בשלבים מוקדמים של החיים. דבר זה מושג תחילה על ידי מתן גירוי מגע שלוש פעמים ביום, מהיום השלישי לאחר הלידה ועד היום ה-21 לאחר הלידה. השלב השני הוא ביצוע פרפוזיה לבעלי החיים ברגע שהם מגיעים לגיל הבדיקה ואחסון מוחותיהם בתמיסת Goldy cos.
בשלב הבא, המוחות נחתכים באמצעות Aome. השלב האחרון הוא סריקה של המוחות בטכניקת הצביעה המשותפת GOGI. בסופו של דבר, פרוצדורת GOGI משמשת להדמיה של נוירונים בודדים, דבר המאפשר ניתוח של שינויים מורפולוגיים.
היתרון של טכניקת Goy Cox הוא שהיא מאפשרת לנו לכמת את מבנה הנוירונים ולהקריב זאת עם תוצאות התנהגותיות. ההשלכות של טכניקה זו חולות גם על הפרעות התפתחותיות, שכן הוכח שגירוי מגע יעיל בהשגת התאוששות התנהגותית ואנטומית מהפרעות אלו. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הנוירו-אנטומיה של חולדות, ניתן ליישמה גם על אורגניזמי מודל אחרים ועל רקמות מוח אנושיות.
כדי לסייע לנו להעמיק את הבנתנו בנוגע לפלסטיות תלוית-ניסיון, בעלי החיים מוחזקים במחזור של 12 שעות אור וחושך עם גישה חופשית למזון ומים לאחר הלידה. כל חולדה נקבה שוכנת באופן פרטני עם צאצאיה. כדי למנוע סטרס נוסף הקשור לטיפול, הגורים מקבלים גירוי מגע החל מיום P3.
לאחר שקילול הגורים לפני סשן הגירוי המישואי של הבוקר, העבירו את הגורים בכלובי הבית שלהם לחדר בדיקה נפרד. הניחו את כלוב הבית על משטח חימום המכוון ל-24 °C. כאשר תהיו מוכנים לגירוי המישואי, הוציאו את האמהות מכלוב הבית שלהן והעבירו אותן לכלוב זמני עם מזון ומים.
השאירו את נקבת האם ואת הכלוב הזמני בחדר הגידול. לאחר מכן, השתמשו בלוח קשיח כדי לחלק את כלוב הבית לשני חצאים. לאחר מכן, חלקו באופן אקראי מחצית מהגורים מכל שגרה להליך של גרייה תחושתית, כאשר המחצית השנייה תשמש כקבוצת ביקורת.
סמנו את הרגליים האחוריות ואת הזנב של הגורים בעזרת טוש קבוע כדי להבדיל בין הקבוצות, והניחו את הגורים מקבוצת הגירוי המישוש בצד אחד של הכלוב ואת גורי הביקורת בצד השני. הגדירו טיימר ל-15 דקות והשתמשו במנקה אבק בעל נוצות רכות. הברישו את כל הגורים מקבוצת הגירוי המישוש בו-זמנית למשך 15 דקות רצופות.
גורי החולדה הצעירים בדרך כלל נצמדים זה לזה ונראים כנכנסים למחזור שינה עמוק, מה שהופך את גירויים של כל הגורים בבת אחת לקל מאוד. ככל שהגורים מתבגרים, הם הופכים לפעילים יותר, וחלק מהגורים מתחילים ללכת ולחקור. במהלך הסשן, העבירו כל גור שמסתובב חזרה אל הקבוצה כדי להבטיח שכל גור יקבל גירוי שווה.
לאחר 15 דקות של גרייה מגעית, החזירו את האם לכלוב והעבירו את הכלוב בחזרה לחדר הריבוי. תהליך זה חוזר על עצמו שלוש פעמים ביום. למשך 19 ימים לאחר מפגש הגרייה המגעית האחרון, גמלו את הגורים מאמהם. הגורים שוכנים בכלובים עם חמישה או שישה בעלי חיים גמולים אחרים מאותו מין. השאירו את החולדות ללא הפרעה בתנאי דיור סטנדרטיים עד שיגיעו לגיל הדרישה למחקר.
הדגימות נאספות כאשר בעלי החיים מגיעים לגיל 100 ימים. לאחר הפוטנזיה ופרפוזיה תוך-לבבית, המוח מופק, תוך הקפדה לשמור על הדורה (cerebellum) שלמה.
הניחו את המוחות בבקבוק Nalgene אטום למאור המלא ב-20 milliliters של תמיסת Goldy Cox, שם יישמרו למשך 14 ימים. לאחר 14 ימים, החליפו את התמיסה בתמיסת sucrose בריכוז 30%. השאירו את המוחות בתמיסת ה-sucrose למשך יומיים עד חמישה ימים לפני ביצוע החיתוכים.
ייבשו את המוח באמצעות נייר סופג לפני קיבועו לבמה לחיתוך באמצעות דבק אקרילי של Sano כדי למנוע קריעות או חיתוך לא אחיד; ודאו שכל המוח מקובע היטב לבמה. לאחר מכן, מלאו את מאגר ה-Vibram בתמיסת 6% sucrose עד שהיא מכסה את להב החיתוך. הגדירו את המהירות והאמפליטודה של ה-Vibram לערך חמש.
חתכו את המוח לפרוסות בעובי 200 micron והניחו את הפרוסות על שקופית מיקרוסקופ עם ג'לטין 2%. הקפידו להשאיר את הפרוסות רטובות במהלך החיתוך עד לאיסוף כל הפרוסות הרלוונטיות. הדביקו את הפרוסות לשקופיות על ידי הפעלת לחץ באמצעות נייר סופג לח.
הניחו את השקופיות במעמד לשקופיות ואחסנו אותן בתא לחות למשך 12 שעות לפחות, אך לא יותר מארבעה ימים. כדי להתחיל בתהליך הצביעה, סמנו והכינו 12 צלחות צביעה מזכוכית. ראשית, טבלו את השקופיות במים מזוקקים למשך דקה אחת.
בשלב הבא, הניחו את השקופיות באמוניום הידרוקסיד ושמרו אותן בחושך למשך 30 דקות. לאחר דקה נוספת במים מזוקקים, הניחו את השקופיות ב-Kodak Fix למשך 30 דקות תחת הגנה מאור. הניחו את השקופיות שוב במים מזוקקים לפני ביצוע דהידרטציה בסדרה של תמיסות אלכוהול בריכוזים מדורגים.
לאחר שטיפת האלכוהול האחרונה, השקיעו את השקופיות בתמיסה בערך של שליש למשך 15 דקות. לבסוף, השקיעו את השקופיות ב-hemo D למשך 15 דקות. כאשר השקופיות מוכנות, השתמשו ב-paramount להנחת זכוכיות כיסוי על השקופיות והמתינו להתייבשותן באוויר לפני בדיקתן באמצעות מיקרוסקופ.
להלן תצלום מייצג של נוירון פארא-מטלי בחולדה שקיבלה גירוי מגע במהלך ההתפתחות, שנצבע בשיטת Golgi Cox. תצלום מוגדל מראה קוצים דנדריטיים על הדנדריטים הטרמינליים. התמונה הבהירה יותר משמאל היא מחולדה מקבוצת הביקורת, והתמונה הכהה יותר היא מחולדה שקיבלה גירוי מגע.
גרף זה מייצג את המורכבות הדנדריטית האפיקלית והבסאלרית הממוצעת של נוירונים באזור CG three בחולדות בוגרות שקיבלו גרייה תחושתית במהלך ההתפתחות או שלא קיבלו. על ידי ביצוע פרוצדורה זו, אנו נהנים מהיתרון שמאחר שצבענו את המוח כולו, נוכל לחזור ולהשתמש באותה רקמת מוח כדי להשיב על שאלות נוספות במידה ונרצה. באמצעות פיתוח טכניקות אלו, סללנו את הדרך עבור חוקרים לבחון את התועלת של גרייה תחושתית כטיפול בטראומה ראשית או בצורות אחרות של פגיעה נוירולוגית לאחר התפתחותן.
טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים במדעי המוח לבחון את הפוטנציאל שלה בשיקום טראומה מוחית והפרעות התפתחותיות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעניק לגורי חולדה את החוויה המעשירה של גרייה תחושתית, וכן לגבי האמצעים להדמיית נוירונים וסינפסות בודדים.
סקירה כללית
מחקר זה מפרט את ההליכים לעגישה תחושתית (tactile stimulation) של גורי חולדה ואת צביעת גולגי-קוקס (Golgi-Cox staining) העוקבת של המורפולוגיה הנוירונלית. העגישה התחושתית מבוצעת במהלך התקופה הפרינטלית, וצביעת גולגי-קוקס מאפשרת ויזואליזציה של נוירונים שלמים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- נוירו-אנטומיה
רקע
- גירוי מגע יכול להשפיע על התפתחות נוירונלית.
- צביעת Golgi-Cox היא שיטה להדמיה של מבנים נוירונליים.
- הבנת פלסטיות תלוית-ניסיון היא קריטית למדעי המוח ההתפתחותיים.
- ניתן להחיל טכניקה זו על אורגניזמי מודל שונים.
מטרת המחקר
- לבחון את ההשפעות של גירוי תחושתי (טקטילי) על מורפולוגיה נוירונלית.
- לכמת שינויים מבניים בנוירונים הקשורים לתוצאות התנהגותיות.
- לבחון השלכות על הפרעות התפתחותיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גירוי מגע שניתן שלוש פעמים ביום מהיום השלישי לאחר הלידה ועד היום ה-21.
- פרפוזיה ואחסון של מוחות בתמיסת Golgi-Cox.
- חיתוך של המוחות לחתכים בעובי 200 micron לצורך צביעה.
- נהלי צביעה להדמיית מורפולוגיה עצבית.
תוצאות עיקריות
- הדגמה ויזואלית של שינויים מורפולוגיים בנוירונים בעקבות גירוי תחושתי.
- הדגמה של הבדלים במורכבות הדנדריטית בין קבוצת הגירוי לקבוצת הביקורת.
- מתן תובנות לגבי הנוירו-אנאטומיה של חולדות ויישומים פוטנציאליים למינים אחרים.
מסקנות
- גירוי מגע משפיע לחיוב על ההתפתחות העצבית.
- צביעת Golgi-Cox יעילה לניתוח מורפולוגיה עצבית.
- הממצאים עשויים לספק מידע למחקרים על הפרעות התפתחותיות ופלסטיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנה של האופן שבו חוויות בשלבי חיים מוקדמים גורמות לשינויים עצביים יציבים היא קריטית להפחתת הסיכונים במטרות תרופתיות לנוירו-התפתחות. גרייה תחושתית (Tactile stimulation) כמשתנה סביבתי מבוקר מאפשרת בירור מכניסטי של פלסטיות תלוית-ניסיון, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בהפרעות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). צביעת גולג'י-קוקס (Golgi-Cox staining) מספקת מדדים מורפולוגיים כמותיים המתאימים שינויים מבניים לתוצאות תפקודיות, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר לבחון כיצד גירויים סביבתיים מושפעים מהמורפולוגיה הנוירונלית כדי להבהיר היפותזות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מספק שיטה הניתנת לשחזור להערכת מעורבות המטרה באמצעות מדדים של נוירופלסטיות מבנית.
- ערך ניבוי: תומך בהלימה של סממנים ביולוגיים על ידי קישור שינויים דנדריטיים המוּשְׁמָעים על ידי גירוי מגע להחלמה התנהגותית במודלים של הפרעות התפתחותיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: צביעת Golgi-Cox מייצרת נתונים מורפולוגיים כמותיים וסטנדרטיים המתאימים לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של תרכובות נוירו-אקטיביות.
- שחזוריות: הטכניקה מספקת ויזואליזציה עקבית של נוירונים בין שגרים שונים, מה שמאפשר תכנונים ניסויים חוצי-שגרים לעוצמה סטטיסטית חסונה.
- יכולת הרחבה (Scalability): סריקה של המוח כולו מאפשרת אחסון בארכיון וניתוח רטרוספקטיבי, ובכך תומכת בשימוש חוזר בבדיקה עבור מספר שאלות מחקר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: גירוי מגע מדמה התערבויות בשלבים מוקדמים של החיים הרלוונטיות להפרעות התפתחותיות-עצביות ולהפרעות הקשורות לטראומה.
- המשכיות תרגומית: מאפשר השוואה ישירה של מורפולוגיה נוירונלית בין קבוצות גירוי לקבוצות ביקורת כדי להעריך יעילות טיפולית.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר ויזואליזציה של שינויים בעמודי דנדריטים ובפיצול ענפים העומדים בבסיס הקישוריות הסינפטית, ובכך מפחית עמימות לגבי מנגנון הפעולה.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
תהליך עבודה זה תומך בשלבי הגילוי המוקדמים עד לאימות המטרה, כאשר גרייה תחושתית משמשת כמודולטור סביבתי וצביעת Golgi-Cox מספקת נקודות קצה מבניות לצורך פיתוח בדיקות ורשראות סריקה.
- ביולוגיה של גילוי: בודקת כיצד קלט חושי מעצב את הארכיטקטורה הנוירונלית כדי לתקף מטרות המעורבות בפלסטיות תלוית-ניסיון.
- סריקה: מפיקה מדדים כמותיים של מורכבות דנדריטית וצפיפות קוצים להשוואת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של פרמטרים מורפולוגיים בין תנאים ניסיוניים לקבוצות ביקורת.
- מחקר תרגומי: מקשר בין גירוי מגע פרינטלי לשינויים נוירונליים ארוכי טווח הרלוונטיים למודלים של הפרעות התפתחותיות.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן לנתח מחדש מוחות שצבעו בשיטת Golgi-Cox עבור מטרות נוספות, ובכך למקסם את יעילות המשאבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי ויזואליזציה ישירה של שינויים מבניים נוירונליים המושרים על ידי התנסות מוקדמת.
- ערך תפעולי: פרוטוקול סטנדרטי של צביעה וחיתוך מבטיח הדירות בין מעבדות ונקודות זמן שונות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת ראיות מבניות למודולציה של המטרה במודלים פרה-קליניים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על היכולת להציל או לחקות נוירופלסטיות תלוית-ניסיון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהיסטולוגיה של מדעי המוח ובטיפול בבעלי חיים בתקופה הפרינטלית.
- תלות בכימיקלים של Golgi-Cox, בציוד לחיתוך באמצעות ויברטום ובתיבאי סביבה מבוקרים.
- נדרשת רנדומיזציה בין שגרים ואנליזה עיוורת כדי למזער הטיות.
- התאמה לאורגניזמי מודל אחרים מחייבת תיקוף של יעילות הצביעה ותזמון התפתחותי.
- מגבלות מעשיות כוללות לוח זמנים ממושך לצביעה ורגישות טכנית להכנת התמיסות ולארטיפקטים של החיתוך.
