לדמיין את ההשפעות של ניסיון מוקדם חיובי, מישוש גירוי, על דנדריטים מורפולוגיה וSynaptic קישוריות עם Golgi-קוקס מכתים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בטכניקות צביעת זהב G Cox כדי לדמיין את השינויים המורפולוגיים בתאי עצב העוקבים אחר גירוי מישוש בשלב מוקדם בחיים. זה מושג על ידי מתן גירוי המישוש שלוש פעמים ביום מהיום השלישי לאחר הלידה ועד היום ה-21 לאחר הלידה. הצעד השני הוא לחלחל את החיות ברגע שהן מגיעות לגיל החקירה ולאחסן את המוח שלהן בתמיסת גולדי.

לאחר מכן, המוחות נחתכים עם Aome. השלב האחרון הוא הספגת המוח בטכניקת הצביעה של GOGI co. בסופו של דבר, הליך ה- GOGI co משמש להדמיית נוירונים בודדים, המאפשר ניתוח של שינויים מורפולוגיים.

היופי בטכניקת גוי קוקס הוא שהיא מאפשרת לנו לכמת את מבנה הנוירונים ולתאם זאת עם תוצאות התנהגותיות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הפרעות התפתחותיות שכן גירוי מישוש הוכח כיעיל הן בהתאוששות התנהגותית והן בהתאוששות אנטומית מהפרעות אלו. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הנוירואנטומיה של חולדות, ניתן ליישם אותה גם על אורגניזמים מודלים אחרים ורקמת מוח אנושית.

כדי לעזור לנו לקדם את ההבנה שלנו לגבי גמישות תלותית, בעלי חיים נשמרים במחזור אור חושך של 12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים לאחר הלידה. כל נקבת חולדה שוכנת בנפרד עם צאצאיה. כדי למנוע לחץ נוסף הקשור לטיפול, הגורים מקבלים גירוי מישוש החל מ-P 3.

לאחר שקילת הגורים לפני מפגש גירוי המישוש בבוקר, העבירו את הגורים בכלובי הבית שלהם לחדר בדיקה נפרד. הניחו את כלוב הבית על כרית חימום המוגדרת ל-24 מעלות צלזיוס. כאשר הם מוכנים לגירוי מישוש, הסירו סכרים מהכלוב הביתי שלהם והניחו אותם בכלוב זמני עם מזון ומים.

שמור את הסכר והכלוב הזמני בחדר הרבייה. לאחר מכן, השתמש בלוח נוקשה כדי לחלק את כלוב הבית לשני חצאים. לאחר מכן הקצו באופן אקראי מחצית מהגורים מכל המלטה לעבור גירוי מישוש כאשר החצי השני משמש כביקורת.

סמנו את הרגליים האחוריות והזנב שלהם בטוש קבוע כדי להבדיל בין הקבוצות והניחו את הגורים בקבוצת גירוי המישוש בצד אחד של הכלוב ובקרו את הגורים בצד השני. הגדר טיימר ל -15 דקות באמצעות נוצה רכה כמו אבק. צחצחו את כל הגורים בקבוצת הגירוי המישוש בו-זמנית במשך 15 דקות רצופות.

גורי החולדות הצעירים בדרך כלל מצטופפים יחד ונראה שהם נכנסים למחזור שינה עמוק, מה שמקל מאוד על גירוי כל הגורים בבת אחת. ככל שהגורים מתבגרים, הם הופכים פעילים יותר כאשר חלק מהגורים הולכים וחוקרים. במהלך הפגישה, העבירו את כל הגורים הנודדים לקבוצה כדי להבטיח שכל גור יקבל גירוי שווה.

לאחר 15 דקות של גירוי מישוש, החזירו את האם לכלוב והעבירו את הכלוב בחזרה לחדר הרבייה. תהליך זה חוזר על עצמו שלוש פעמים ביום. במשך 19 יום לאחר מפגש הגירוי המישוש האחרון, גומלים את הגורים מאמותיהם גורים שוכנים בכלובים עם חמישה או שישה בעלי חיים נגמלים אחרים מאותו המין ומשאירים את החולדות ללא הפרעה בתנאי דיור סטנדרטיים עד שהם מגיעים לגיל החקירה.

הדגימות נאספות כאשר החיות מגיעות לגיל 100 ימים. לאחר המתת חסד וזלוף תוך לבבי, המוח מופק ממנו. דואג לשמור על המוח הקטן שלם.

הניחו את המוחות בבקבוק Nalgene אטום מלא ב-20 מיליליטר של תמיסת גולדי קוקס שם הם נשמרים במשך 14 יום. לאחר 14 יום, החלף את התמיסה בתמיסת סוכרוז של 30%. שמור את המוח בתמיסת סוכרוז במשך יומיים עד חמישה ימים לפני החתך לחתך.

כתם את המוח יבש לפני קיבוע לשלב חתך עם דבק אקרילי סנו כדי למנוע קריעה או חתך לא אחיד, ודא שהמוח כולו מאובטח היטב לבמה. לאחר מכן, מלאו את מאגר ה-Vibram בתמיסת סוכרוז של 6% עד שהוא מכסה את להב החיתוך. הגדר את המהירות והמשרעת של הוויברם לחמש.

פורסים את המוח למקטעים של 200 מיקרון ומניחים את החלקים על שקופית מיקרוסקופ ג'לטין של 2%. הקפד לשמור על הקטעים רטובים במהלך החתך כאשר כל החלקים המעניינים נאספו. לחץ את החלקים על השקופיות על ידי הפעלת לחץ עם נייר לח.

הנח את השקופיות במתלה שקופיות ואחסן אותן בתא לחות למשך 12 שעות לפחות, אך לא יותר מארבעה ימים. כדי להתחיל בהליך הצביעה, יש לתייג ולהכין 12 כלי כתמים מזכוכית. ראשית, טבלו את המגלשות במים מזוקקים למשך דקה.

לאחר מכן, הניחו את השקופיות באמוניום הידרוקסיד ושמרו אותן בחושך למשך 30 דקות. לאחר דקה נוספת במים מזוקקים, הנח את המגלשות בקודאק פיקס למשך 30 דקות עם הגנה מפני אור. הניחו את המגלשות במים מזוקקים פעם נוספת לפני הייבוש בסדרה של תמיסות אלכוהול מדורגות.

לאחר שטיפת האלכוהול האחרונה, הניחו את השקופיות בתמיסה שלישית למשך 15 דקות. לבסוף, הניחו את השקופיות בהמו D למשך 15 דקות. כשהוא מוכן, השתמש ב-Paramount כדי להניח את החלקות הכיסוי על המגלשות ולאפשר לשקופיות להתייבש באוויר לפני בחינתן במיקרוסקופ נראה.

הנה תצלום מייצג של נוירון פרמטאלי מוכתם של גולגי קוקס בחולדה שקיבלה גירוי מישוש במהלך ההתפתחות. תצלום מוגדל מראה קוצים דנדריטיים על הדנדריטים הסופיים. התמונה הבהירה יותר משמאל היא של חולדה בקבוצת הביקורת, והתמונה הכהה יותר היא של חולדה שקיבלה גירוי מישוש.

גרף זה מייצג את המורכבות הדנדריטית האפיקלית והבסיסית הממוצעת עבור נוירונים באזור CG 3 מחולדות בוגרות שקיבלו גירוי מישוש במהלך ההתפתחות או לא. על ידי ביצוע הליך זה, יש לנו יתרון שאם אנו רוצים לשאול שאלות נוספות, הכתמנו את כל המוח ולכן אנו יכולים לחזור ולהשתמש באותה רקמת מוח כדי לענות על השאלות הללו. על ידי פיתוח טכניקות אלה, סללנו את הדרך לחוקרים לחקור את התועלת של גירוי מישוש כטיפול לטיפול בטראומה בראש או צורות אחרות של פגיעה נוירולוגית לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרי מדעי המוח לחקור את הפוטנציאל שלה בתיקון טראומה מוחית והפרעות התפתחותיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לספק לגורי עטיפה את החוויה המעשירה של גירוי מישוש כמו גם אמצעי שבאמצעותו ניתן לדמיין נוירונים וסינפסות בודדים.