מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית
31 ביולי 2013
במאמר זה אנו מציגים מייקר Iontophoresis המהיר של נוירוטרנסמיטורים כטכניקה לחקור אינטגרציה של אותות postsynaptic עם דיוק מרחב ובזמן.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להבין את האינטגרציה של קלטים לאורך המבנה המורכב מאוד של העץ הדנדריטי העצבי, מה שמוביל בסופו של דבר לפלט העצבי של פוטנציאל הפעולה באקסון. זה מושג על ידי משיכת הפיפטות האפורטיות המתאימות. השלב השני הוא לבדוק את הפיפטות האפורטיות של היונים ולפצות נכון את הקיבול שלהן.
לאחר מכן, קבע את כל תצורת התא. השלב האחרון הוא להתקרב לדנדריט ולעורר פוטנציאלים פוסט-סינפטיים בתא המוקלט. בסופו של דבר, מיקרו יונטופורזה מהירה מאפשרת לחקור את האינטגרציה של כניסות מרובות, שיכולות להשתייך גם למערכות נוירוטרנסמיטורים שונות.
שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כמו כיצד קלטים מעכבים ומעוררים משולבים, ובאילו תנאים. זה יכול להוביל לתפוקה עצבית. התחל הליך זה על ידי משיכת פיפטות עם טיפים קטנים מאוד ליונטופורזה מבוקרת של נוירוטרנסמיטרים.
בעזרת מושך פיפטה אופקי או אנכי, ניתן להשיג טיפים עדינים קטנים במספר שלבי משיכה. עם זאת, הקצה עדיין צריך להיות נוקשה מספיק כדי לחדור לרקמה. לאחר מכן, הגדר את מגבר היונים האפורטי כדי לבדוק את ביצועי הפיפטה בתא ללא רקמה.
מלאו את הפיפטה במוליך עצבי ובתמיסה המכילה צבע. לאחר מכן הנח אותו ב-A CSF. לאחר מכן מפצה את הקיבול באמצעות המגבר.
בדרך כלל פיפטות חדות מאוד יהיו בעלות קיבול גבוה יותר מהבוטות לאחר פיצוי נכון על הקיבול שלהן. בדוק את ההתנגדות של הפיפטה עם התכונה המובנית של מגבר המיקרו יונטופורזה. הפיפטה צריכה להיות בעלת התנגדות בין 25 ל -90 מגה אוהם.
לאחר מכן, התמקדו בקצה הפיפטה עם יעד טבילה במים של 60x או 40x. לאחר מכן עבור להדמיה פלואורסצנטית. אם פלואורסצנט D דולף מקצה הפיפטה, הפעל זרם שמירה חיובי קטן במקרה של גלוטמט או זרם שמירה שלילי במקרה של גאבה.
אם זה לא עוזר לבטל את הדליפה, החלף את הפיפטה. לאחר מכן, הפעל זרם צעד חזק על הפיפטה או השתמש בהדק הידני עקוב אחר התמונה הפלואורסצנטית של קצה הפיפטה כדי לראות אם ניתן להוציא את התמיסה. אם אין דליפה גלויה ופליטת הבדיקה הצליחה, בדוק את פיצוי הקיבול והתחל את הניסוי.
באופן כללי, ניתן לעורר אירועים אפורטיים של יונים במקומות מוגדרים בהתאם לניסוי הרצוי. לדוגמה, בדנדריט קוצני למיקרופורזיס גלוטמט, או בפיר הדנדריטי, סומה או מקטע ראשוני של אקסון עבור מיקרופורזיס GABA. לאחר קביעת תצורת התא כולה, הנח את קצה הפיפטה האפורטית של היונים למרחק של כמיקרומטר אחד מהדנדריט או תא עניין אחר.
ודא שאף נוירוטרנסמיטר לא דולף החוצה ושהפיפטה והקיבול מתוגמלים כהלכה. אם התקרבות לתא עם פיפטת יונים אפורטית מלאה בגלוטמט גורמת לדפולריזציה ניתנת לזיהוי של הממברנה, גלוטמט פוטנציאלי דולף החוצה מהפיפטה. נסה להתאים את זרם השמירה או לשנות את הפיפטה האפורטית של היונים.
לאחר מכן, החל פולסים שליליים קצרים על פיפטת היונים האפורטית לזרם גלוטמט החל מאפס והגדל את הזרם באופן שיטתי. זה עוזר לגלות את הטווח שבו הזרם האפורטי של היונים מעורר את התגובות הרצויות במערך הניסוי הספציפי. אם אין תגובה ניתנת לזיהוי, הרם את פיפטת היונים האפורטית כמה מאות מיקרומטרים, והפעל זרם חזק גדול מ-0.1 מיקרו-אמפר כדי לנקות את הקצה.
לאחר מכן התאם את פיצוי הקיבול. שוב, התקרב לתא ונסה שוב. אם עדיין אין תגובה, נסה להפחית את זרם השמירה.
עם זאת, היזהר מאוד בהפחתת זרם השמירה מכיוון שהדבר עלול לגרום לשחרור נוירוטרנסמיטר בלתי מבוקר. לכן, עקוב כל הזמן אחר ההקלטה כדי לזהות שינויים בהתאמה בפוטנציאל הממברנה. אם גלוטמט דולף החוצה מהפיפטה, דחה את הפיפטה למיקרו יונטופורזה של גאבה.
מלאו פיפטה חדשה בתמיסת GABA. חשוב מאוד שתהיה קוטביות נכונה לזרם הפליטה בעת החלפת המשדר בפיפטה. עבור פליטת GABA, שנה את ההגדרות לנורמה וכתוצאה מכך זרם פליטה חיובי כדי לזהות את אירועי GABAergic ביתר קלות.
הזרקת שלבי זרם ארוכים וכתוצאה מכך שינויים בפוטנציאל הממברנה מסביבות 100 מילי-וולט שלילי ל-48 מילי-וולט שלילי. בעזרת פרוטוקול זה, ניתן להגדיל את הכוח המניע של יון הכלוריד, מה שהופך את האירועים לבולטים יותר, ושיווי המשקל של האירוע נחשף. שרטוט סכמטי זה מציג מיקרו יונטופורזה של גלוטמט יחיד.
ה-EPSP המוצג כאן מעורר בנוירון פירמידלי CA 1 עם יונטופורזיס גלוטמט, וספייק הסידן הדנדריטי של הנתרן המתואר כאן מעורר בדנדריט של נוירון פירמידלי CA one. העקבה התחתונה מציגה את שיפוע עקבות המתח, והשיא מציין את שיפוע השיא של הספייק הדנדריטי. בעת הגדלת הזרם המופעל על פיפטת היונופור, משרעת ה- EPSP גדלה עד שהיא חוצה את סף פוטנציאל הפעולה.
השרטוט הסכמטי כאן מראה מיקרו יונטופורזה כפולה של גלוטמט במקומות שונים על העץ הדנדריטי. EPSP רטי יונים זה מעורר בדנדרי פרוקסימלי של נוירון פירמידלי CA one, וזה מעורר בדייט דיסטלי. שרטוט סכמטי זה מציג את המיקרו פורזיס של GABA.
ה-IPSP הרטי המוצג כאן מעורר בדנדריט פרוקסימלי של נוירון פירמידלי CA אחד והזרקת זרם ארוך עם אמפליטודות שונות המופעלות על נוירון פירמידלי CA אחד באמצעות פיפטת התיקון עוזרת לקבוע את פוטנציאל ההיפוך של האירוע המעורר, האירוע המעורר מתהפך ב-70 מילי-וולט שליליים בקירוב. לבסוף, שרטוט סכמטי זה מציג את הגלוטמט והיונטופורזיס של GABA בו זמנית החוקר את האינטגרציה של עירור ועיכוב. הקוצים הדנדריטיים התעוררו על ידי יישום רשתי של גלוטמט בלבד.
בסריקות הבאות מוצגות כאן. הפסגות של העקבה התחתונה המציגות את שיפוע עקבות המתח מצביעות על התרחשות הקוצים הדנדריטיים, וכאן מעורר יונית GABAergic IPSP בלבד. לבסוף, מעוררים גם את האירועים הגלוטמטרגיים וגם את ה-GABAergic יחד, מה שמוביל לעיכוב של קוצים דנדריטיים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות קל מאוד ליצור מיקרו-רזיס מהיר במעבדה שלך ולקבל תובנה כיצד קלטים סינפטיים משולבים בתאי עצב.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מיקרו-יונטופורזה מהירה של מוליכים עצביים כטכניקה לחקר האינטגרציה של אותות פוסטסינפטיים. שיטה זו מאפשרת דיוק מרחבי וזמני גבוה בלימוד פעילות נוירונלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- סיגנל של מוליכים עצביים
רקע
- העץ הדנדריטי הנוירונלי משלב קלטים מרובים.
- הבנת אינטגרציה זו חיונית להבנת התוצר הנוירונלי.
- מיקרו-יונטופורזה מהירה מספקת שיטה לחקר תהליכים אלה.
- ניתן לחקור מערכות מוליכים עצביים שונות בו-זמנית.
מטרת המחקר
- להבין כיצד אותות פוסטסינפטיים עוברים אינטגרציה.
- לחקור את המבנה המורכב של דנדריטים עצביים.
- לעורר פוטנציאלים פוסט-סינפטיים בתאים שנרשמו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של פיפטות ion aporetic.
- בדיקה ופיצוי של קיבוליות הפיפטה.
- ביסוס קונפיגורציית תא שלם (whole cell).
- הקרבה לדנדריטים לעוררות פוטנציאלים.
תוצאות עיקריות
- מיקרו-יונטופורזה מהירה מאפשרת חקירה מדויקת של אינטגרציה של מוליכים עצביים.
- ניתן לנתח מספר קלטים ביחס למערכות שונות של מוליכים עצביים.
- הטכניקה משפרת את ההבנה של מנגנוני הפלט הנוירונליים.
- הושגה עירור מוצלח של פוטנציאלים פוסט-סינפטיים.
מסקנות
- מיקרו-יונטופורזה מהירה היא כלי בעל ערך למחקר במדעי העצבים.
- היא מספקת תובנות לגבי האינטגרציה של אותות פוסט-סינפטיים.
- שיטה זו יכולה לקדם את הבנתנו בנוגע לתקשורת עצבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנה של האופן שבו קלטים מעוררים ומעכבים עוברים אינטגרציה לאורך עצי דנדריטים היא קריטית להפחתת סיכונים בתהליך התיקוף של מטרות (target validation) בתחום הגילוי של תרופות למדעי העצבים. מיקרו-יונטופורזה מהירה מאפשרת בקרה מרחבית וזמנית מדויקת של הזרקת גלוטמט ו-GABA, ובכך תומכת בחקירה מכניסטית של אינטגרציה סינפטית. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בבחינת היפותזות לגבי מטרות בשלבים מוקדמים, על ידי בידוד התגובות הפוסט-סינפטיות מהשונות הפרה-סינפטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות על ידי בידוד תגובות פוסט-סינפטיות למוליכים עצביים מעוררים ומעכבים.
- ערך תפעולי: מספק יישום הדיר וניתן לשחזור של מוליכים עצביים במיקום ספציפי, ללא משתנים מתערבים פרה-סינפטיים.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות על ידי הבהרה כיצד מודולציה של רספטורים ספציפיים משפיעה על הפלט העצבי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות מדידות של פוטנציאל פוסט-סינפטי להערכת השפעות של תרכובות על אינטגרציה סינפטית.
- ערך תפעולי: מאפשר יישום סימולטני של גלוטמט ו-GABA במיקומים דנדריטיים מרוחקים, ובכך מגדיל את קיבולת הריבוי (multiplexing) של הבדיקה.
- שחזור: מספק אותות מהימנים בעלי ספציפיות גבוהה למוליכים עצביים ולמיקום, כאשר השלמת הקיבוליות (capacitance compensation) ותקינות הפיפטה נשמרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תובנות מכניסטיות משלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני, על ידי הגדרת האופן שבו קלטים מעכבים מעצבים אינטגרציה מעוררת.
- מערכת רלוונטית למחלה: ישימה למודלים של פרוסות מוח המשמשים לתיקוף מטרות במחלות נוירולוגיות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה מצבי אינטגרציה ליניאריים ולא-ליניאריים, ובכך מספקת מידע לניבוי תגובה למינון ולטיפולים משולבים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהם הבנת האינטגרציה של הקלט מסייעת בקבלת החלטות בנוגע לבחירת מטרה ואופטימיזציה של תרכובות מובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת השערות על ידי עירור פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מוגדרים למיפוי מסלולי איתות מעוררים ומעכבים.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות אספקה סטנדרטית וניתנת להוצאה של מוליכים עצביים עם דליפה מינימלית ופיצוי קיבוליות יציב.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של פוטנציאל ממברנה וקריאות של תדירות פעימות (spike frequency) להשוואת מצבי אינטגרציה תחת תנאים משתנים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי ביסוס האופן שבו קלטים המופרדים מרחבית משפיעים על הפלט העצבי במעגלים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה רב-פעמית לבחינת אינטגרציה סינפטית על פני מספר מחלקות מטרה ותחומי מחלה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי פתרון מנגנונים פוסט-סינפטיים של עירור ועכבה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה באמצעות בדיקת התנגדות פיפט (25–90 MΩ), פיצוי קיבול וניטור דליפה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי הפחתת העמימות באופן שבו מטרות מווסתות אינטגרציה סינפטית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם-סיכון בהתבסס על השפעות על דיכוי ספייקים דנדריטיים ומוסתות אמפליטודת EPSP.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, מתיחת מיקרופיפטים ותפעול של מגבר יוניטופורטי.
- תלוי בתשתית של דימות פלואורסצנציה או דימות דו-פוטוני להדמיית מבני דנדריטים ללא נזק פוטו-כימי משמעותי.
- מחייב בקרת זרם שימור (retention current) קפדנית למניעת שחרור בלתי רצוני של מוליכים עצביים במהלך החלפת המוליך.
- חייב להתחשב בהפעלה פוסט-סינפטית בלבד, מה שמגביל את הרזולוציה של מנגנונים פרה-סינפטיים.
- יש לתקף את פיצוי ההתנגדות והקיבול של הפיפטה לפני כל ניסוי כדי להבטיח את אמינות האות.
