Name: נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: למדו שיטה מדויקת לנתיחה והרכבה לרוחב של עוברי Danio rerio לצורך ויזואליזציה מיקרוסקופית של התפתחות חוט השדרה. השיטה מאפשרת חקר תהליכי נוירוביולוגיה כמו הדרכת אקסונים והבדלה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

סקידמור הפקולטה הפיתוח גרנט מימן את ההכנה ופרסום של כתב היד הזה.

1. הרכבה עוברים (עם השלמת הטכניקה ויזואליזציה נבחרת, כגון Immunocytochemistry, הכלאה באתר, וכו &#39;) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עוברים בצלחת פטרי מלא 35 מ&quot;מ עם חיץ של בחירה (איור 1 א). הבחירה של חיץ מבוסס על הליך התיוג. בדרך כלל מאגרים מבוססי PBS מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, ובאמצעות מלקחיים, לאבטח את הראש עם זוג מלקחיים אחד תוך משיכת החלמון משם עם הזוג האחר (איור 1). לחלופין, השתמש בסיכת חרקים בבעל סיכת חרקים למשוך בעדינות את החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפוקר העובר (חוט דיג (0.41 מ&quot;מ קוטר) דבוק לאו צינור נימים או פיפטה פסטר) להעביר את העוברים לחלק מצלחת פטרי שאין לו הרבה פסולת חלמון (איורים 1C-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, לשאוב את העוברים בנוזל קטן ככל האפשר, וגרמתיently פיפטה אותם על גבי שקופית (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פתיל משם נוזל עודף באמצעות מעבדה לנגב. יש להימנע ממגע עם עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של הרכבה בינונית לעוברים. לתוויות ניאון, השתמש מגיב antifade של בחירה. עבור אותות colorimetric, גליצרול 70% עשוי לשמש כמדיום גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפוקר העובר, לכוון את העוברים על צדם בשורות (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אחד &quot;טיפה&quot; של וזלין או גריז ואקום גבוה לכל פינה של coverslip (איור 1G). זה מונע נזק של עובר מדחיסה מוגזמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip (צד וזלין למטה) על גבי עוברים (איור 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את coverslip בכל פינה עד שתקשורת ההרכבה (גליצרול 70% או מגיב הרכבה אנטי לדעוך) נוגע coverslip (איור 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, להוסיף עוד מדיה הרכבה על ידי pipetting ממש ליד coverslip, באמצעות pipettor בטווח של 20-200 מיליליטר. זה יהיה פתיל תחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מעבדה לנגב, נקי לחלוטין סביב coverslip. להיות בטוח שלא תפעילו לחץ על coverslip, כפי שהדבר יפגע בעוברים. אזור זה חייב להיות יבש ואין לי וזלין או תקשורת גוברת עליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח לק על ציפורניים כדי לאטום מסביב לקצה של coverslip (איור 1I). </li></ol>

<ol><li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li>
<li>Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoss%2C+ABJ+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , In Press. (2012).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li>
<li>Gribble, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li>
<li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li>
<li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+roundabout+orthologs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish.</a> Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).</li>
<li>Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+three+zebrafish+roundabout+homologs+suggest+roles+in+axon+guidance+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell.</a> 221 (2), 216-230 (2001).</li>
<li>Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li>
<li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li>
<li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras%3A+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li>
</ol>

אין אינטרסים כלכליים מתחרים קיימים גם עבור מחבר.

הרכבה לרוחב של הדמיה עזרי עוברי דג הזברה קבועה של התפתחות חוט השדרה. באמצעות הסרת חלמון הכדור, מרחק העבודה דרוש להדמיה מיקרוסקופית חריגה מצטמצם. תוצאות הנציג שלנו היו מוגבלות לבמה 24 hpf, לעומת זאת, טכניקה זו יכולה לשמש כתחילה כ18 hpf, אם כי העוברים קודם לכן קשים יותר לנתח בשל גודלו של העובר ואת השבריריות של הרקמה. טכניקה זו היא גם החלים על עוברים מבוגרים מ24 hpf. בעזרת הבהירות האופטית של דג הזברה העוברית, היכולת לבצע מסכי גנטיים קדימה, אחורה גנטיקה, וגישות מהונדסים, כמה תהליכים התפתחותיים עשויים להיחקר. זה כולל מדדי mitotic של אבות עצביים עם סמנים כמו BrdU ואנטי phospho-היסטון 4-6 מרס ודפוסים דרך ביטוי של סמני אב עצביים וגליה בפאקס, nkx, dbx, וFamilie olig1,4-6 ים. ריאגנטים שידווחו נחישות גליה ועצבית (כגון חלבון גליה חומצת fibrillary (GFAP) וHUC / D) 1,4,5,10 ניתן להשתמש. בידול תת עצבי ניתן לנתח דרך ביטוי של איון, VSX, engrailed, וגני gata 1,4-6. ולבסוף, ניתוח של האקסון הדרכה אפשרי באמצעות נוגדנים כגון אנטי טובולין acetylated, 3A10, וZnP-1 2,11,12. למרות שמערכות מודל חוליות אחרות (עכבר וחומוס) משמשים ללמוד פיתוח חוט השדרה, הצפייה בו זמנית היתרי דג הזברה היחידה של כל הצירים התפתחותיים בעובר ללא פגע. המגבלה הברורה לגישה זו היא כי העוברים קבועים, המונעת הדמיה לחיות. למעשה, הסרת (או לניזק) תוצאות החלמון במוות עוברי מהיר, ולכן זה לא ניתן להקטין את מרחק העבודה בעוברים חיים באמצעות טכניקה זו. עם זאת, שיתוף השדרה ההגדלה גבוההההדמיה rd בעוברי חיה אפשרית. על מנת לשמר את החלמון במהלך הדמיה חיות, ניתן להציב עוברים בשקופיות דיכאון, המספקים מרחב גדול יותר בין הדגימה וcoverslip. לחלופין, יכול להיות דבוק כמה coverslips x 22 מ&quot;מ 22 מ&quot;מ משני השקופיות של 3 x 1 בשקופיות מיקרוסקופיות. Coverslips לשמש &quot;גשר&quot; לcoverslip שמעליה. אם עוברים הם בנים יותר מ 18 hpf, tricaine משמשת כדי להרדים עוברים כדי למנוע תנועה. אמנם מרחק עבודה של 0.288 מ&quot;מ נדרש לעוברי deyolked ב24 hpf, כאשר עובדים עם עוברים חיים המשובצים בagarose, עם חלמונים שלמים, עדשה מיקרוסקופית עם מרחק עבודה של 3.3 מ&quot;מ מספיקה. לחלופין, תרבויות explant מקורם בעוברי deyolked ניתן דמיינו באמצעות טכניקת קיבוע קריש פלזמה 13. ניתן לצפות אוכלוסיות שונות של תאים באמצעות חלבוני ניאון מקודדים גנטי כגון GFP, mCherry, או photoconצבע vertible קאאד (עד כמה שם). יתר על כן, תאים שכותרתו fluorescently בתוך עובר chimeric ניתן לראות גם בגישה זו 14. טכניקת הרכבה עולה בקנה אחד שהיא יציב במשך חודשים היא כלי חיוני עבור ביולוגים התפתחותיים ותא. טכניקה פשוטה זו היא לשחזור, ומאפשרת השוואה קלה בין ניסויים ניסויים שונים. יתר על כן, את היישור של עוברים בשורות בקלות מאפשר זיהוי של עוברים ספציפיים לניתוח מאוחר יותר.

ויזואליזציה של חוט השדרה בדג הזברה היא מעוכבת על ידי מספר הגורמים. בשל העובי של somites שמעליה והמיקום הפנימי של חוט השדרה, במרחק ניכר עבודה ארוכה נדרש לפתרון סלולארי גבוה. חלמון הכדור (שהוא עדיין נוכח במהלך הנוירוגנזה שלבים מוקדמים) מגדיל עוד יותר את מרחק העבודה הנדרש, והוא נפגע בקלות על ידי לחץ של coverslip. בנוסף, שאריות מחלמון פגום אוסרת להדמיה ברורה של רקמות. למרות חתכים בציר dorso-הגחון (DV) הם אפשריים, הם לא בקלות מתירים הדמיה סימולטני בציר קדמי, אחורי (AP) 1. כדי להתגבר על המכשולים הללו, עוברים הם גזורים ורכובים על שקופיות. הליך זה מספק מספר יתרונות. ראשית, עוברי דג הזברה בקלות לשכב עם הצד לרוחב כלפי מעלה, המאפשר הדמיה ציר סוכנות הידיעות AP. שנית, הסרת Bal החלמוןl מקטין את מרחק העבודה הנדרש, ומגביל את הפסולת. שלישית, הליך התקנה זו מאפשר לשני ניאון ומיקרוסקופיה brightfield. רביעית, עוברים רכובים יציבים במשך חודשים על 4 מעלות צלזיוס, המאפשרים ויזואליזציה דגימה ממושכת. לבסוף, התקדמות של פיתוח מתרחשת בכי חלקים קדמי הם בוגרים יותר ממגזרים האחוריים. על מנת להבטיח כי מבוים hemisegments השדרה מתאים הם בהשוואה בין עוברים, רקמת somite שמעל משמשת כמדריך. לדוגמא, somite האחורית ביותר העשירית overlies hemisegment השדרה עשירית, שהוא שווה ערך מבחינה התפתחותית בעוברי בהתאמה במה. הליך הרכבה זו של עוברים ללא פגע מאפשר זיהוי קל של somites. אנו משתמשים בגנטיקה ובטכנולוגיות לדפוק למטה גנטיות כדי ללמוד את המכניזם של הדרכה האקסון בחוט השדרה המתפתח. בפרט, אנו קובעים כי robo2, robo3, וDCC נדרשים לCommissural הראשי ASCEnding (COPA) pathfinding האקסון. באמצעות הליך ההרכבה המתואר כאן, היינו יכול לבחון את צמיחת הגחון, מעבר קו האמצע, רוחב השליך, גב ו2,3 צמיחה הקדמי. הליך הרכבה זה גם יכול להיות מיושם על DV או דפוסים AP של חוט השדרה. יש לנו להשתמש בהליך זה כדי לקבוע תפקידים שונים של effectors Wnt במורד הזרם בדפוסי DV של חוט השדרה. באמצעות הרכבה זו, היינו יכול להשיג ברזולוציה של סמני DV ברמת התא הבודד, ולקבוע משמרות דפוסים דקה כתוצאה של קבלת אות Wnt שינתה 4,5. הליך הרכבה זו מאפשר גם לחישוב מדד mitotic באמצעות אנטי phosphohistone 3 או תיוג BrdU (ריבוי אב) בידול 5.

<table><tbody><tr><td> צלחות פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ</td><td>VWR</td><<td>p>25373-041</td><td></td></tr><tr><td> Dumont מלקחיים #3 </td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9839169</td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית </td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-541-B22X22-1.5</td><td></td></tr><tr><td> שקופיות </td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td> SlowFade Gold </td><td>Fisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold </td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td> Petroleum Jelly </td><td>כל חנות מכולת</td><td> </td><td></td></tr><tr><td> מחזיקי לולאה </td><td>VWR</td><td>80094-482</td><td></td></tr><tr><td> סיכות חרקים </td><td>כלי מדע עדין</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td> מחזיקי סיכות מצופים ניקל </td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12 </td><td></td></tr><tr><td>Olympus Stereomicroscope</td><td></td><td>OlympusSZ61</td><td></td></tr></tbody></table>

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

חוט השדרה של דג הזברה הוא מודל חקירה יעיל למחקר מערכת עצבים מכמה סיבות. ראשית, יכולות להיות מנוצלים גנטי, מהונדס וגן גישות מציאה לבחון את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התפתחות מערכת עצבים. שנית, ציפורניים גדולות של עוברים מסונכרנים התפתחותית לספק גודל מדגם ניסוי גדול. שלישית, הבהירות האופטית של עובר דג הזברה מאפשרת לחוקרים לחזות אב, גליה, ואוכלוסיות נוירונים. למרות עוברי דג הזברה הם שקופים, עובי דגימה יכול לעכב להדמיה מיקרוסקופית יעילה. אחת סיבות לכך היא פיתוח טנדם של חוט השדרה ורקמות somite שמעליה. סיבה נוספת היא חלמון הכדור הגדול, שעדיין קיימות בתקופות של נוירוגנזה מוקדמת. במאמר זה, אנו מדגימים microdissection וההסרה של החלמון בעוברים קבועים, המאפשר להדמיה מיקרוסקופית, תוך שמירה על רקמות somite. אנו also להפגין הרכבת semipermanent של עוברי דג הזברה. זה מאפשר התבוננות בהתפתחות הנוירולוגית בצירי dorso-הגחון וקדמי, אחורי, כפי שהוא שומר על שלוש ממדי של הרקמה.

כאשר הבהרת המנגנונים העומדים בבסיס אירועים התפתחותיים שונים כגון דפוסים סלולריים, בידול, והאקסון הדרכה, חשוב להיות מסוגל לדמיין תאים בהקשר של הרקמות שלהם. פגמים דפוסים dorsoventral נוכחים בדרך כלל כשינוי הגחון או הגבי בתחום הביטוי של גורמי שעתוק בפאקס, nkx, או משפחות dbx 4. לעתים, שינויים יכולים להיות עדינים, הכוללים רק כמה קטרי תא 4. ניתוח חתך רוחב מאפשר סוג זה של ניתוח. עם זאת, חומרים כימיים עם אותות חלשים יותר, או חתכים שאינם בניצב לציר AP יכולים להגביל את הפרשנות. יתר על כן, ניתוח חתך רוחב לא לוקח בקלות בחשבון אם שינויים להתמיד בציר AP, ומסתמך על הזמינות של cryostat. מגבלה זו לעקיפה על ידי השקפות רוחביות של חוט השדרה. כפי שניתן לראות באיור 2 ב, nkx6.1 mRNA הוא דistributed בערך מחצית הגחון של חוט השדרה ב24 שעות לאחר הפריה (hpf), בתוך תחום האב. ובתאים וניתן להבחין מתאי הפוסט mitotic בשל נוכחותם של צלחת הרצפה, הנמצאת בחלק המדיאלי של חוט השדרה. צפו עם אופטיקה DIC, תאים בודדים הם להבחין בבירור, וגבול מוגדר בין ההבעה וnonexpressing תאים הוא מאליו. יציאת מחזור תא אב מלווה בשינויים בביטוי גנים. לדוגמא, כל הנוירונים לאחר mitotic להביע HUC / D שניתן לזהות עם 1,5 immunocytochemistry. בדיקות ה-mRNA לאיון, gata, ומשפחות VSX לתייג תאי עצב לאחר mitotic הספציפי של עמדה עקבית ומספר בתוך כל hemisegment חוט השדרה 6. בנוסף, קולטני האקסון הדרכה כגון אלה במשפחה רובו באים לידי ביטוי באוכלוסיות מוגבלות של נוירונים postmitotic (איור 2 ג) <sup&gt; 2,7,8. הרכבה לרוחב של עוברים מאפשרת ספירה מדויקת של תאי עצב לאחר mitotic. בדומה לכך, אבות שממשיכים להתחלק ניתן לכמת עם אנטי phospho-היסטון 3 immunocytochemistry כמו גם תיוג BrdU. יתר על כן, מוות של תאים ניתן להעריך עם תיוג Tunel 4-6. ב24 hpf, האקסונים של הנוירונים postmitotic הבאים יכולים להיות דמיינו עם שיטות שונות, וניתן להבחין ברמת התא הבודד: הגבי לרוחב עולה (דולה), Commissural הראשוני עולה (COPA), Commissural המשני עולה (קוזה), הגחון אורכית יורד (ולד), קולמר-Agdur (KA), Commissural מתפצל / אורך (קלח / ל &#39;), עולה היקפי (ה-CIA), היקפי יורד (CID), וחד קוטבי Commissural יורד (UCoD), Rohon-בירד (RB), motoneurons ( ז) 9. אקסונים להאריך מהנוירונים האלה בגב, הגחון, קדמי ואחוריים כיוונים. הם סניף, לחצות את קו האמצע, וצאו משני הגביוחוט השדרה הגחון. כאשר מצמידים עם מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה, התנהגויות סלולריות מגוונות אלה אנחנו רואים בעוברים רכובים רוחבי, באמצעות immunocytochemistry וחלבונים ניאון מקודדים גנטי כגון GFP 2. באיור 2 ד, immunocytochemistry ZnP-1 שימש תווית motoneurons המתפתח. Motoneurons לצאת מחוט השדרה ventrally למעצבב את שרירי פיתוח שמסביב. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. נתיחה ולרוחב הר של עוברי דג הזברה. () לאחר העיבוד לimmunofluorescence, הכלאה באתר, וכו &#39;, עובר ממוקמים בצלחת פטרי מלאה 35 מ&quot;מ עם PBT (PBS עם 0.5% טריטון X-100) או PTW (PBS עם 20-Tween 0.1%). החלמוןהכדור (י.ב.) בא לידי ביטוי. (ב) החלמון הוסר על ידי הבטחת ראשו של העובר ואחרי נתיחה זהירה. (C) פוקר עובר (חוט דיג דבוק לפיפטה פסטר) משמש לעוברים נפרדים ופסולת חלמון (ד &#39;). עוברים ניקו הם pipetted לשקופית מיקרוסקופ (E) ומיושר (F). הריבה (G) נפט מוחלת על הפינות של coverslip. (H) coverslip ממוקם בעדינות על גבי העוברים בהרכבה בינונית. לק (אני) משמש כדי לאטום את הקצוות של coverslip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; איור 2. אנליזה של דפוסי ביטוי גנים והאקסון pathfinding ברוחבית רכוב עוברי דג הזברה. () ציור של עובר דג הזברה ב24 hpf. בBD, בערך ארבעה hemisegments מעל הרחבה שק החלמון הם דמיינו (אזור בארגזים). (ב) nkx6.1 מתבטא בחוט השדרה הגחון, כולל צלחת הרצפה (FP). robo3 (C) מתבטא בתאי עצב postmitotic (PMN). אזור צלחת הרצפה ואב הוא לא בא לידי ביטוי במישור מוקד לרוחב יותר זה. בB, C, בעמוד השדרה מתוחם על ידי סוגר בצד שמאל של התמונה. (ד) מיקרוסקופ Confocal שימש לimmunofluorescence תמונת ZnP-1, אשר תוויות אקסונים מנוע יציאה מחוט השדרה ventrally. בכל התמונות, קדמי הוא בצד השמאל ועל הגב הוא עד. מרחק עבודה ארוך 40X, עדשת טבילה במים (NA 0.8) שימשה (3.3 מ&quot;מ).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע דיסקציה והרכבה של עוברי דג זברה לצורך ויזואליזציה מיקרוסקופית אופטימלית של חוט השדרה. הדבר מושג תחילה על ידי מיקרו-דיסקציה והסרה של כדור ה-oak. השלב השני הוא הסרת שאריות ה-oak והעברת העוברים באמצעות פיפטה אל על גבי זכוכית.שלישי, יש להסיר בזהירות את השאריות הנוזליות באמצעות נייר ניגוב מסוג Kim wipe, ולאחר מכן להוסיף מדיום קיבוע (mounting medium). השלב הסופי הוא יישור העוברים על השקופית בעזרת מוט יישור עוברים (embryo poker), ולאחר מכן הנחת זכוכית כיסוי. לבסוף, נעזרים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית או במיקרוסקופיה בשדה בהיר כדי להראות את התפלגות גופי התאים הפוסט-מיטוטיים ואת מסלולם של האקסונים המתפתחים.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון מהם המנגנוים האחראים לתבניתיות, דיפרנציאציה והכוונה של אקסונים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי היבטים רבים של התפתחות מערכת העצבים, ניתן ליישמה גם על רקמות אחרות, כגון שריר בהתפתחות. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להתקשות, כיוון שהיא דורשת ביצוע דיסקציה תחת מיקרוסקופ לפני תחילת הניסוי.הכינו מחט לדחיקת עוברים על ידי הדבקת קצה פיפטה למקלון פיפטה משומש, ולאחר מכן הדבקת חוט דיג לקצה הפיפטה. כדי להתחיל בדיסקציית העוברים, הניחו עד 30 עוברים של דג הזברה בגיל 24 שעות לאחר ההפריה בתוך צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר המלאה ב-PBS.תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, אחזו בראשו של עובר בעזרת פינצטה תוך כדי דחיפת השקיות הרחוקה בעזרת סיכה לאנטומיה. לאחר מכן, השתמשו במקל דחיפה לעוברים כדי להעביר את העוברים לחלק בצלחת הפטרי שאין בו הרבה שאריות חלמון. לאחר מכן, שאבו את העוברים לתוך פיפטת פסטור מזכוכית תוך שאיבת כמות מינימלית של נוזל.לאחר מכן, העבירו בעדינות באמצעות פיפט עד 21 עוברים לעל תבנית. ספגו בזהירות את הנוזל העודף באמצעות נייר ניגוב למעבדה תוך הימנעות ממגע עם העוברים, ולאחר מכן הוסיפו טיפה אחת של מדיום קיבוע (mounting medium) על העוברים. בשלב הבא, השתמשו במקל להזזת עוברים (embryo poker) כדי לסדר את העוברים על צדם בשתיים עד שלוש שורות.כעת, הוסיפו מעט וזלין לכל אחת מפינות זכוכית כיסוי. הפכו את זכוכית הכיסוי כך שהצד עם הוזלין פונה כלפי מטה והניחו אותה מעל העוברים. הוזלין פועל למניעת נזק לעוברים כתוצאה מדחיסה מוגברת.הקישו בעדינות על פינות זכוכית הכיסוי עד שנוזל הקיבוע יגע בזכוכית הכיסוי במידת הצורך, תוך שימוש בפיפט בטווח של 20 עד מאה µL. הוסיפו נוזל קיבוע נוסף לצד זכוכית הכיסוי והמתינו עד שהנוזל שהוסף יספג תחתיה. כעת, השתמשו בנייר ניגוב למעבדה כדי לנקות לחלוטין את האזור שסביב זכוכית הכיסוי.אין להפעיל לחץ על זכוכית ה כיס, שכן הדבר עלול לפגוע בעוברים. כאשר האזור נקי כראוי, יבש ואינו מכיל וזלין או מדיום קיבוע, השלימו את התהליך על ידי שימוש בלק גוף לכיסוי דפנותיה של זכוכית הכיס. לאחר קיבוע עוברי הזברופי (zebrafish), נצפו מספר מקטעי HEMI מעל להארכה של שקיק האלון (oak sac).איור זה מציג את הביטוי של NK X 6.1 בחלק הגבי של חוט השדרה בעובר דג הזברה. ה-mRNA של NK X 6.1 מפוזר בקירוב במחצית הוונטרלית (הבטנית) של חוט השדרה 24 שעות לאחר ההפריה. בתוך תחום התאים הקדמונים, ניתן להבחין בין תאים קדמונים לתאים פוסט-מיטוטיים הודות לנוכחות של לוח הרצפה (floor plate), הנמצא בחלק המדיאלי של חוט השדרה.נצפה באמצעות אופטיקת DIC. ניתן להבחין בבירור בתאים בודדים, וניכר גבול מוגדר בין תאים המבטאים את הגן לתאים שאינם מבטאים אותו. היציאה של תאי הפרוגניטור מהמחזור התאי מלווה בשינויים בביטוי גנים.תמונה זו מראה את הביטוי של robo three בנוירונים פוסט-מיטוטיים. רספטורי משפחת robo הם רספטורים להנחיית אקסונים, אשר ביטויים מאפשר ספירה מדויקת של נוירונים פוסט-מיטוטיים. שימו לב כי ה-floor plate ואזור הפרוגניטור אינם נראים במישור מוקדי זה, שהוא לטרלי יותר.מיקרוסקופיית קונפוקלית שימשה להדמיית אימונופלורסצנציה של znp one, המסמנת אקסונים של נוירונים מוטוריים כפי שמוצג בעובר זה, המורכב באופן לטראלי. הנוירונים המוטוריים יוצאים מהחוט השדרני לכיוון הגבי (ventrally) 24 שעות לאחר ההפריה כדי לעצב את השרירים המתפתחים סביבם. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על שלמות הרקמות באמצעות מיקרו-דיסקציה (microdissection) זהירה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן השימוש בטכניקות מיקרו-דיסקציה להסרת החלמון מעוברים של דגי זברה (zebrafish) לצורך קיבוע וויזואליזציה מיקרוסקופית.

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

לאחר חיתוך רוחב השדרה, יש דג הזברה מבוגר התאוששות תפקודית על ידי שישה שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את שקיפות זחל והתאוששות מהירה יותר, אנו מציגים שיטה לtransecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, אנו צופים התאוששות חושית מתחילים ב 2 ימים שלאחר פציעה, ותנועת C-עיקול על ידי 3 ימים לאחר פציעה.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה רב-תכליתית המאפשרת הדמיה ארוכת טווח של התפתחות הגוף האחורי של עוברי דג זברה חיים מבלי להפריע להתפתחות תקינה.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

כאן, אנו מתארים שיטה להפחתת הגודל של עוברי דגים מבלי להפריע תהליכים התפתחותיים נורמליים. טכניקה זו מאפשרת לימוד שינוי קנה מידה וחוסן התפתחותי נגד שינוי גודל.

הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

מאמר זה מתאר שיטה לטעינת עוברי שברירי הדגים עבור מיקרוסקופ הזמן המורחבת הקפיצה הדקה. שיטה בעלות נמוכה זו קלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופית תחתית רגילות של זכוכית להדמיה בכל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לתרבות רקמות תלת-ממדית של ציר הגוף האחורי של דג הזברה, המאפשר מחקר חי של פילוח בעלי חוליות. מודל הסבר זה מספק שליטה על התארכות הציר, שינוי מקורות מורפוגן והדמיה חיה ברמת הרקמה בתת-תאיות.

תרבות הסבר זנב תלת-ממדית לחקר פילוח בעלי חוליות בזברהפיש

כאן, אנו מציגים שיטה ליישור והקפאה של דגימות זחלי דג זברה מרובות (Danio rerio) ואיסוףן בשקופית אחת לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי.

סידור קומפקטי מרחבית של קטעי דג זברה זחלים לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי

למדו שיטה מדויקת לנתיחה והרכבה לרוחב של עוברי Danio rerio לצורך ויזואליזציה מיקרוסקופית של התפתחות חוט השדרה. השיטה מאפשרת חקר תהליכי נוירוביולוגיה כמו הדרכת אקסונים והבדלה תאית.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

גלה סרטונים נוספים