נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח ולהרכיב עוברי דג זברה להדמיה מיקרוסקופית אופטימלית של חוט השדרה. זה מושג על ידי ניתוח והסרה ראשונים של כדור האלון. השלב השני הוא הסרת פסולת האלון ופיפטה של העוברים על מגלשה.

לאחר מכן, הנוזלים העודפים מוסרים בזהירות בעזרת מגבון קים, ואחריו תוספת של מדיום הרכבה. השלב האחרון הוא לכוון את העוברים על המגלשה עם פוקר עוברים ואחריו מריחת פתק הכיסוי. בסופו של דבר, מיקרוסקופ פלואורסצנטי או שדה בהיר משמש להצגת התפלגות גופי תאים פוסט-מיטוטיים ואת מסלול האקסונים המתפתחים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון מהם המנגנונים האחראים על דפוס, התמיינות והנחיית אקסונים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי היבטים רבים של התפתחות מערכת העצבים, ניתן ליישם אותה גם על רקמות אחרות כגון התפתחות שרירים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרשת דיסקציה תחת מיקרוסקופ לפני תחילת הניסוי.

הכינו פוקר עוברי על ידי הדבקת קצה פיפטה לפיפטה קודמת ולאחר מכן הדבקת חוט דיג לקצה הפיפטה. כדי להתחיל בדיסקציה של העובר, הניחו עד 30 עוברי דג זברה. גיל 24 שעות לאחר ההפריה לצלחת פטרי 35 מילימטר מלאה ב-PBS.

תחת מיקרוסקופ מנתח, אבטח את ראשו של העובר עם זוג מלקחיים תוך כדי משיכת האלון בעזרת סיכת חרק. לאחר מכן השתמש בפוקר העוברים כדי להעביר את העוברים לחלק מצלחת הפטרי שאין בו הרבה פסולת חלמון. לאחר מכן, שאפו את העוברים לתוך פיפטת מרעה מזכוכית ששואבת כמה שפחות נוזלים.

לאחר מכן פיפטה בעדינות עד 21 עוברים על מגלשה. נדפו בזהירות עודפי נוזלים באמצעות מגבון מעבדה תוך הימנעות מנגיעה בעוברים, ולאחר מכן הוסיפו טיפה אחת של מדיום הרכבה לעוברים. לאחר מכן, השתמש בפוקר העוברים כדי לכוון את העוברים על צידיהם בשתיים עד שלוש שורות.

כעת, הוסף טיפה של ג'לי נפט לכל פינה של תלוש כיסוי. סובב את החלקת הכיסוי כך שהצד עם ג'לי הנפט פונה כלפי מטה והנח את החלקת הכיסוי על גבי העוברים. ג'לי הנפט פועל למניעת נזק לעוברים כתוצאה מדחיסת יתר.

הקש בעדינות על פתק הכיסוי בכל פינה עד שאמצעי ההרכבה נוגע בהחלקת הכיסוי במידת הצורך, באמצעות פיפטר בטווח של 20 עד מאה מיקרוליטר. הוסף מדיית הרכבה נוספת ליד פתק הכיסוי ואפשר למדיה הנוספת לנדף מתחת להחלקת הכיסוי. כעת, השתמש במגבון מעבדה כדי לנקות לחלוטין סביב החלקת הכיסוי.

אל תפעיל לחץ על החלקת הכיסוי מכיוון שהדבר עלול לפגוע בעוברים כאשר מנקים אותם כראוי, האזור יבש ואין עליו ג'לי נפט או אמצעי הרכבה. סיימו על ידי שימוש בלק כדי לאטום סביב קצוות החלקה של הכיסוי. לאחר הרכבת עוברי דג הזברה, הודגמו מספר מקטעי HEMI מעל הארכת שק האלון.

איור זה מראה ביטוי NK X 6.1 בחוט השדרה הגחוני של עובר דג הזברה. ה-NK X 6.1 mRNA מופץ בערך במחצית הגחון של חוט השדרה 24 שעות לאחר ההפריה. בתחום האב, ניתן להבחין בין תאי אב לתאים פוסט-מיטוטיים בשל נוכחותה של לוחית הרצפה, הנמצאת בחלק המדיאלי של חוט השדרה.

במבט עם אופטיקה של DIC. ניתן להבחין בבירור בין תאים בודדים וניכר גבול מוגדר בין תאים מבטאים ולא מבטאים . יציאת מחזור תאי האב מלווה בשינויים בביטוי הגנים.

תמונה זו מציגה ביטוי רובו שלוש בנוירונים פוסט-מיטוטיים. משפחת הקולטנים הרובו הם קולטני הנחיית אקסונים שביטוים מאפשר ספירה מדויקת של נוירונים פוסט-מיטוטיים. שימו לב שלוחית הרצפה ואזור האב אינם ניכרים במישור המוקד הרוחבי יותר.

מיקרוסקופיה קונפוקלית שימשה להדמיית znp אימונופלואורסצנציה אחת, המסמנת אקסונים מוטוריים כפי שמוצג בעובר המותקן לרוחב. הנוירונים המוטוריים יוצאים מחוט השדרה בגחון 24 שעות לאחר ההפריה כדי לעצב את השרירים המתפתחים שמסביב. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על שלמות הרקמות באמצעות מיקרו-דיסקציה זהירה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בטכניקות מיקרו-דיסקציה כדי להסיר את החלמון של עוברי דג הזברה לצורך הרכבה והדמיה מיקרוסקופית.