נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע דיסקציה והרכבה של עוברי דג זברה לצורך ויזואליזציה מיקרוסקופית אופטימלית של חוט השדרה. הדבר מושג תחילה על ידי מיקרו-דיסקציה והסרה של כדור ה-oak. השלב השני הוא הסרת שאריות ה-oak והעברת העוברים באמצעות פיפטה אל על גבי זכוכית.

שלישי, יש להסיר בזהירות את השאריות הנוזליות באמצעות נייר ניגוב מסוג Kim wipe, ולאחר מכן להוסיף מדיום קיבוע (mounting medium). השלב הסופי הוא יישור העוברים על השקופית בעזרת מוט יישור עוברים (embryo poker), ולאחר מכן הנחת זכוכית כיסוי. לבסוף, נעזרים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית או במיקרוסקופיה בשדה בהיר כדי להראות את התפלגות גופי התאים הפוסט-מיטוטיים ואת מסלולם של האקסונים המתפתחים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון מהם המנגנוים האחראים לתבניתיות, דיפרנציאציה והכוונה של אקסונים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי היבטים רבים של התפתחות מערכת העצבים, ניתן ליישמה גם על רקמות אחרות, כגון שריר בהתפתחות. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להתקשות, כיוון שהיא דורשת ביצוע דיסקציה תחת מיקרוסקופ לפני תחילת הניסוי.

הכינו מחט לדחיקת עוברים על ידי הדבקת קצה פיפטה למקלון פיפטה משומש, ולאחר מכן הדבקת חוט דיג לקצה הפיפטה. כדי להתחיל בדיסקציית העוברים, הניחו עד 30 עוברים של דג הזברה בגיל 24 שעות לאחר ההפריה בתוך צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר המלאה ב-PBS.

תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, אחזו בראשו של עובר בעזרת פינצטה תוך כדי דחיפת השקיות הרחוקה בעזרת סיכה לאנטומיה. לאחר מכן, השתמשו במקל דחיפה לעוברים כדי להעביר את העוברים לחלק בצלחת הפטרי שאין בו הרבה שאריות חלמון. לאחר מכן, שאבו את העוברים לתוך פיפטת פסטור מזכוכית תוך שאיבת כמות מינימלית של נוזל.

לאחר מכן, העבירו בעדינות באמצעות פיפט עד 21 עוברים לעל תבנית. ספגו בזהירות את הנוזל העודף באמצעות נייר ניגוב למעבדה תוך הימנעות ממגע עם העוברים, ולאחר מכן הוסיפו טיפה אחת של מדיום קיבוע (mounting medium) על העוברים. בשלב הבא, השתמשו במקל להזזת עוברים (embryo poker) כדי לסדר את העוברים על צדם בשתיים עד שלוש שורות.

כעת, הוסיפו מעט וזלין לכל אחת מפינות זכוכית כיסוי. הפכו את זכוכית הכיסוי כך שהצד עם הוזלין פונה כלפי מטה והניחו אותה מעל העוברים. הוזלין פועל למניעת נזק לעוברים כתוצאה מדחיסה מוגברת.

הקישו בעדינות על פינות זכוכית הכיסוי עד שנוזל הקיבוע יגע בזכוכית הכיסוי במידת הצורך, תוך שימוש בפיפט בטווח של 20 עד מאה µL. הוסיפו נוזל קיבוע נוסף לצד זכוכית הכיסוי והמתינו עד שהנוזל שהוסף יספג תחתיה. כעת, השתמשו בנייר ניגוב למעבדה כדי לנקות לחלוטין את האזור שסביב זכוכית הכיסוי.

אין להפעיל לחץ על זכוכית ה כיס, שכן הדבר עלול לפגוע בעוברים. כאשר האזור נקי כראוי, יבש ואינו מכיל וזלין או מדיום קיבוע, השלימו את התהליך על ידי שימוש בלק גוף לכיסוי דפנותיה של זכוכית הכיס. לאחר קיבוע עוברי הזברופי (zebrafish), נצפו מספר מקטעי HEMI מעל להארכה של שקיק האלון (oak sac).

איור זה מציג את הביטוי של NK X 6.1 בחלק הגבי של חוט השדרה בעובר דג הזברה. ה-mRNA של NK X 6.1 מפוזר בקירוב במחצית הוונטרלית (הבטנית) של חוט השדרה 24 שעות לאחר ההפריה. בתוך תחום התאים הקדמונים, ניתן להבחין בין תאים קדמונים לתאים פוסט-מיטוטיים הודות לנוכחות של לוח הרצפה (floor plate), הנמצא בחלק המדיאלי של חוט השדרה.

נצפה באמצעות אופטיקת DIC. ניתן להבחין בבירור בתאים בודדים, וניכר גבול מוגדר בין תאים המבטאים את הגן לתאים שאינם מבטאים אותו. היציאה של תאי הפרוגניטור מהמחזור התאי מלווה בשינויים בביטוי גנים.

תמונה זו מראה את הביטוי של robo three בנוירונים פוסט-מיטוטיים. רספטורי משפחת robo הם רספטורים להנחיית אקסונים, אשר ביטויים מאפשר ספירה מדויקת של נוירונים פוסט-מיטוטיים. שימו לב כי ה-floor plate ואזור הפרוגניטור אינם נראים במישור מוקדי זה, שהוא לטרלי יותר.

מיקרוסקופיית קונפוקלית שימשה להדמיית אימונופלורסצנציה של znp one, המסמנת אקסונים של נוירונים מוטוריים כפי שמוצג בעובר זה, המורכב באופן לטראלי. הנוירונים המוטוריים יוצאים מהחוט השדרני לכיוון הגבי (ventrally) 24 שעות לאחר ההפריה כדי לעצב את השרירים המתפתחים סביבם. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על שלמות הרקמות באמצעות מיקרו-דיסקציה (microdissection) זהירה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן השימוש בטכניקות מיקרו-דיסקציה להסרת החלמון מעוברים של דגי זברה (zebrafish) לצורך קיבוע וויזואליזציה מיקרוסקופית.