Name: בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: למדו לבודד תאים חיסוניים מרקמת שומן באמצעות עיכול קולגנאז וצנטריפוגה דיפרנציאלית. שיטה זו מאפשרת אפיון מקרופאגים ותאי T באמצעות ציטומטריית זרימה לחקר מחלות אימונומטבוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

התזמורת סימפונית נתמכת על ידי NIH רות ל &#39;Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK נתמך על ידי מלגת דוקטורים מהאגודה האמריקנית לסוכרת (7-10-MI-05), והוא נתמך על ידי אהה פרס איגוד לב אמריקאי הוקם חוקר (12EIA8270000). ניסויי cytometry זרימה בוצעו במשאבים משותפים Cytometry זרימת VMC. משאבי cytometry זרימת VMC משותפים נתמך על ידי המרכז לחקר מחלות העיכול ונדרבילט (DK058404).

1. חומרים כימיים ומתכלה לפני שתתחיל בפרוטוקול הניסוי הזה, להכין את ריאגנטים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X DPBS (ללא Ca וMg) בתוספת 0.5% BSA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS חיץ: 1X DPBS (ללא Ca ומ&quot;ג), 2 mM EDTA, ו -1% FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ ACK: Cl 150 מ&quot;מ NH 4, 10 מ&quot;מ 3 KHCO, ומ&quot;מ Na 2 EDTA 0.1 במים </li></ol> 2. קצירת והכנה של רקמת שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על פי נהלים שאושרו IACUC ספציפיים לכל מוסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יסודיות להרטיב את הפרווה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך ברמה של תהליך xiphoid (חלק תחתון של עצם החזה) ולפתוח את חלל בית החזה כדי לחשוף את הלב, נזהר שלא לנתק את כל כלי דם גדולים. </li></ol> הערה: בשלב זה, היא גם מועילה להשאיר את הדיאפרגמה שלמה ככל<html> אפשר ולחתוך חריץ מהצד של כלוב הצלעות הימני כדי לאפשר לדם לזרום וperfusate מתוך חלל בית החזה. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ העלייה הימנית כדי לאפשר לדם וperfusate להימלט מערכת הדם. </li></ol> שים לב: כאשר מתמודדים עם עכברים שמנים, קרום לב עודף בייתכן שיהיה הצורך להסיר על מנת לאפשר גישה אל הלב. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את הלב עם מלקחיים ובעדינות להכניס מחט לתוך החדר השמאלי דרך הקודקוד. לאט perfuse העכבר עם 15 מ&quot;ל סטרילי PBS. </li></ol> שימו לב: להפחית את שיעור זלוף אם הריאות מתחילות למלא ולהרחיב. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הצפק ולהסיר את רפידות שומן perigonadal באמצעות טיפול, כדי למנוע כל רקמות האשכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כריות שומן במשקל סירה על קרח המכיל 2 DPBS מ&quot;ל 1X (ללא מ&quot;ג או Ca) בתוספת 0.5% BSA, ובשר טחון AT לחתיכות דקות. </li></ol>התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; הערה: הגבל את כמות AT לשוקלת סירה עד 1.2 גרם. אם הכמות של AT עולה על 1.2 גרם, לחלק אותו שווה בשווה בין שתי סירות שוקלות. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על דגימות על קרח ולהכין לעכל פתרון מיליליטר collagenase 3 לכל מדגם AT בהיקף של 1X DPBS בתוספת 0.5% BSA, 10 מ&quot;מ CaCl 2, ו -4 מ&quot;ג / מיליליטר collagenase, מהסוג II. </li></ol> 3. עיכול collagenase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לצינורות חרוטי 50 מ&quot;ל על ידי שפיכת homogenate ושטיפת סירה לשקול עם 1 DPBS מ&quot;ל (0.5% BSA) ופתרון לעכל מיליליטר collagenase השני 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על homogenate בייקר סיבובי (200 סל&quot;ד) על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל DPBS (0.5% BSA) לצינורות החרוטים ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate homogenate פעמים רבות באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מ&quot;ל, ולהעביר השעיות תא דרך 100 מיקרומטר במסנן לצינור חדש 50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעיה תא בXG 500 עבור 10 דקות ב 4 &amp; Dלמשל, ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה SVF במאגר ACK 3 מ&quot;ל לlyse מזהמים אריתרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ FACS מ&quot;ל 12 והשעית תא צנטריפוגות ב XG 500 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה ב SVF חיץ FACS. </li></ol> הערה: השתמש בגודל של התא גלולה כמדריך לכמה חיץ FACS לresuspend פנימה אם התא גלולה מכסה את החלק התחתון של צינור חרוטי 50 מ&quot;ל, השתמש 0.5-1 חיץ FACS מ&quot;ל, אחרת resuspend ב0.25-0.5 מ&quot;ל. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מניחים על קרח ולהכין aliquots דילול 1:10 של כל דגימה לספירת תאים על ידי ערבוב 40 μl חיץ FACS, פתרון כחול 50 μl trypan (0.2%), ו10 השעיה תא μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי קיימא המבוסס על הרחקת trypan הכחולה ולדלל השעיות תא לריכוז סופי של x 05-10 אוקטובר 6 תאים / מ&quot;ל. </li></ol> 4. צביעה של אנטיגנים תא שטח <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף אנטי עכבר CD16/CD32 נוגדן (FC בלוק) לריכוז סופי של 0.5-1 μg/10 6 תאים, ולדגור על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות העברה (≥ 10 6 תאים) עד 12 x 75 צינורות תחתית עגולות קלקר מ&quot;מ. הכן צינורות נפרדים אם ניתוח כספומטים ותאי T, ולשלב את תאים נוספים כדי להכין מספר מספיק של צינורות כדי להתאים את הפיצוי הנדרש וקרינה שונה מינוס אחד (FMO) פקדים. </li></ol> הערה: כדוגמה, כאשר כימות שיעור הכספומטים המבוסס על פקדי FMO F4/80 וCD11b, הפיצוי הבא ויצטרך להיות מוכנים: - מחולל (תאים) - DAPI או יודיד propidium (PI) כתם בודד (תאים, לא להוסיף צבע כדאיות עד שלב 5.1) - F4/80 APC (תאים או חרוזים פיצויים) כתם בודדים - CD11b FITC תאים בודדים או כתם (חרוזים פיצויים) - FMO 1 (תאים): + + CD11b FITC צבע כדאיות עכברוש IgG2a κ אלוטיפ השליטה APC (הוסיף בשלב 5.1) - FMO 2 (תאים): F4/80 APC + עכברוש IgG2b κ אלוטיפ השליטה FITC + צבע כדאיות (הוסיף בשלב 5.1) <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדנים fluorophore-מצומדות עיקריים ו / או פקדי אלוטיפ בריכוז המתאים (ראה טבלה של חומרים כימיים וחומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגן על דגימות מאור ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ FACS מ&quot;ל 2 והשעית תא צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה ב SVF 2 חיץ FACS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG תא ההשעיה 500 דקות 5 ב 4 ° C, ו resuspend תא גלולה ב SVF ≥ 400 חיץ FACS μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הדגימות ל12 x 75 צינורות תחתית עגולות קלקר מ&quot;מ מאובזר עם 35 סטרפלס מסננת תא מיקרומטר.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגן מפני אור, ודגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח FACS. </li></ol> הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות יש לנתח תאי immeadiately, עם זאת, ניתוח FACS עם פרוטוקול זה נערך בהצלחה על תאים שכותרתו מאוחסנים במאגר FACS ל1-2 שעות ב 4 ° C. אם תאים צריכים להיות קבועים כדי להגדיל את זמן אחסון, ניתן לתקן תאים שכותרתו עם paraformaldehyde 2% על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני ניתוח FACS. חברות נוגדנים מצביעות על כך שניתן לאחסן את תאי שכותרתו לתקופה של עד שבוע אחד, עם זאת, זה לא נבדק במסגרת הליך זה. 5. ניתוח FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח FACS, להוסיף צבע כדאיות לדגימות ובקרות מתאימות כדי לאפשר לאפליה תא חי / מת. </li></ol> הערה: צבעי כדאיות רבים זמינים באופן מסחרי, אבל DAPI וPI מומלצים בהתאם לפרופ &#39;עירור / פליטהIles של נוגדני fluorophore-מצומדות בשימוש. DAPI ויודיד Propidium מתווספים לכל דגימה בריכוז סופי של 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדגם בלא כתם שלילי שליטה, רצוי תאים מבודדים מאותה הרקמה כמו דגימות ניסוי, כדי להתאים את פיזור צד (SSC) ופיזור קדימה (FSC), כך שאוכלוסיית התא (ים) של עניין הן בקנה מידה. </li></ol> הערה: לניתוח של AT תאי SVF, מומלץ שSSC יוצג בקנה מידה לעומת יומן FSC בקנה מידה ליניארי. השימוש בקנה מידת יומן לSSC חשוב במיוחד בעת ניתוח כספומטים, שהן לעתים קרובות גדולות מאוד ופרטניות. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר שער פיזור אור ראשוני המבוסס על הסוג של התא (ים) להיות מנותחים, ולהתאים את הצינור המכפיל (PMT), כך שעלייה בתאים בלא הכתם הם בקצה שמאלי של ההיסטוגרמה פרמטר יחיד (מרוכז כ ב -10 ב2) עבור הערוצים המתאימים. &lt;/ P&gt; </ol> הערה: מומלץ שלימפוציטים ומקרופגים (או תאי מיאלואידית אחרים) להיות מנותחים בנפרד בשל הבדלים בautofluorescence. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפקדים מוכתמים בודדים או חרוזים פיצויים ללכוד נוגדנים לבצע פיצוי צבע רב. </li></ol> הערה: השימוש בחרוזי פיצויים מומלץ, עם זאת, התאימות של כל נוגדן חייבת להיות מובטחת. לדוגמה, חרוזים פיצוי עשויים שלא לחצות-מגיבים עם נוגדני ארנבות, במקרה שבו תאים מבודדים נדרשים להשיג שליטת כתם יחידה מתאימה. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע שערים ניסיוניים המבוססים על פקדי FMO שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את cytometer הזרימה לאסוף את המספר המתאים של אירועים המבוססים על השכיחות של האוכלוסייה של עניין ולהקליט את נתוני ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבצי נתונים FCS יצוא לניתוח מצב לא מקוון. ישנם מספר רב של תוכניות זמינות לcytometr הזרימהניתוח נתונים y. אנו ממליצים Cytobank, פלטפורמה מבוססת אינטרנט המאפשרת investigatores לאחסן ולנתח נתונים וליצור דמויות מכל מחשב עם גישה לאינטרנט 18. בנוסף, Cytobank מציע את היכולת לבצע ציבור נתונים נגיש או להגביל את הגישה למשתפי פעולה. </li></ol>

<ol><li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+Isolated+Fat+Cells.+I.+Effects+of+Hormones+on+Glucose+Metabolism+and+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).</li>
<li>Danse, L. H., Verschuren, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+oil-induced+yellow+fat+disease+in+rats.+III.+Lipolysis+in+affected+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue.</a> Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).</li>
<li>Weisberg, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+is+associated+with+macrophage+accumulation+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+in+fat+plays+a+crucial+role+in+the+development+of+obesity-related+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).</li>
<li>Mathis, D., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism%3A+an+emerging+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism: an emerging frontier.</a> Nature Reviews. Immunology. 11, 81(2011).</li>
<li>Stefanovic-Racic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+promote+macrophage+infiltration+and+comprise+a+substantial+proportion+of+obesity-associated+increases+in+CD11c%2B+cells+in+adipose+tissue+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver.</a> Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).</li>
<li>Feuerer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lean%2C+but+not+obese%2C+fat+is+enriched+for+a+unique+population+of+regulatory+T+cells+that+affect+metabolic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters.</a> Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).</li>
<li>Winer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+obesity-associated+insulin+resistance+through+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy.</a> Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).</li>
<li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+invariant+natural+killer+T+cells+by+lipid+excess+promotes+tissue+inflammation%2C+insulin+resistance%2C+and+hepatic+steatosis+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America.+109%22%5BJournal%5D)">Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophils+sustain+adipose+alternatively+activated+macrophages+associated+with+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis.</a> Science. 332, 243-247 (2011).</li>
<li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).</li>
<li>Talukdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+insulin+resistance+in+mice+fed+a+high-fat+diet+through+secreted+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase.</a> Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).</li>
<li>Hagman, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+quantifying+leukocyte+populations+in+human+adipose+tissue%3A+impact+of+enzymatic+tissue+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing.</a> Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10(2010).</li>
<li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45, 194-205 (2001).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

עניין גובר בתפקידה של המערכת החיסונית בהשלכות מטבוליות של השמנה הוביל לשימוש הנרחב בזרימת cytometry לאפיין תאים חיסוניים של AT. אף על פי הפרוטוקול המדויק ישתנה בין מעבדות המבוססות על הניסיון שלהם וציוד זמין, כוללים את השלבים הקריטיים עיכול collagenase, צנטריפוגה ההפרש, וסימון אנטיגן פני תא. מטרתו של המאמר הנוכחי היא לספק לפרוטוקול מפורט ומדריך מעשי לבידודה של AT SVF לחוקרים בעלי ניסיון מוגבל בעבודה עם AT ו / או ביצוע cytometry זרימה. <p class="jove_content" style=";text-align:...

מבחינה היסטורית, רקמת השומן (AT) כבר נתפסה כאיבר אדיש של אחסון שומנים בדם, שמתרחב ומתכווץ בתגובה למאזן אנרגיה. כעת אנו מבינים כי AT מייצג איבר האנדוקרינית דינמי שמפריש באופן פעיל מספר ההורמונים, אשר משפיעים באופן ישיר התנהגות אכילה והומאוסטזיס הגלוקוז מערכתי. בנוסף, בעשור האחרון חלה עלייה הולכת וגובר לאוכלוסיות הרבות של תאים חיסוניים המתגוררות בכל חלק סטרומה וסקולרית (SVF), כמו גם את תרומתם ל-AT הומאוסטזיס. היכולת להפריד בין AT adipocyte וSVF באמצעות לעכל collagenase אחריו צנטריפוגה ההפרש תואר לראשונה בשנת 1964 על ידי Rodbell 1. Collagenase השני משמש לרוב להפרדת adipocyte וSVF בשל תחזוקה של הקולטנים לאינסולין adipocyte 1. חלוקה במוקדם, האנזימטית של AT הייתה בעיקר מועסק ללמוד adipocyte חילוף חומרים וכדי לבודד preadipocytes. לאחרונה, בטכניקה זו, בשילוב עם הזמינות הנרחבת של cytometers הזרימה ומספר הגדל וההולך של נוגדני fluorophore-מצומדות זמינים מסחרי, יש להקל אפיון של AT תאים חיסוניים. למרות נוכחותם של תאי מערכת חיסונית בדלקת שתוארה בעבר 2, את המסמכים על ידי הזרע וייסברג ואח&#39;. ושו et al. פורסם בשנת 2003 היו הראשון לתעד את ההצטברות של AT מקרופאגים (כספומטים) בהשמנה יתר, אשר מפרישה ציטוקינים דלקתיים ולתאם עם תנגודת לאינסולין AT ספציפית ומערכתית 3,4. תצפיות אלה שימש כבסיס לשדה חדש של חקירה לאחרונה שטבע, &quot;immunometabolism,&quot; 5 וכבר במעקב על ידי מחקרים לכך לאוכלוסיות תאי חיסון שונות, כוללים תאים דנדריטיים, תאי פיטום 6 7, 8 תאי T -10, 11, תאי B NKT תאים 12, 13, אאוזינופילים ונויטרופילים 14,15 בהתפתחות של תנגודת לאינסולין השמנת יתר קשור. מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הטכניקה לעכל collagenase משמשת לבודד תאים של AT SVF ולאפיין כספומטים ו-AT תאי T באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה כבר מותאם לעכבר ב, עם זאת, צופים יכולים ליהנות מקריאת מאמר מצוין המספק פירוט נרחב על אופטימיזציה של טכניקה זו לאדם בגיל 16. קהל היעד של מאמר זה כולל חוקרים בעלי ניסיון מוגבל בעבודה עם עכבר ובביצוע cytometry זרימה. כמה שיקולים מעשיים לאיזון תשואה סלולרית וכדאיות עם זמן ומשאבים מוצגים כמו גם בקרות cytometry זרימה אופטימליות לאפיון AT אוכלוסיות תאים חיסוניים. בנוסף לפרוטוקול שלנו, קוראים referrאד למאמר יופיטר לאחרונה על ידי Basu et al. לדיון מצוין של חלק מההיבטים הטכניים של cytometry זרימה לכוללים בקרות ופיצויים נאותות 17.

<table><tbody><tr><td>DPBS (ללא Ca או Mg) 10 x 500 מ"ל</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>Sigma</td><td>C6885-5G</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת יודיד פרופידיום</td><td>סיגמא</td><td>P4864-10 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>ערימה יציבה 20 מיקרוליטר</td><td>Rainin</td><td>SS-L10</td><td></td></tr><tr><td>20 מיקרוליטר טיפים מסנן</td><td>Rainin</td><td>SRL10F</td><td></td></tr><tr><td>מחסנית יציבה 250 מיקרוליטר טיפים</td><td>Rainin</td><td>SS-L250</td><td></td></tr><tr><td>1000 מיקרוליטר טיפים</td><td>Rainin</td><td>GPS-L1000</td><td></td></tr><tr><td>1000 מיקרוליטר טיפים מסנן</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>250 מיקרוליטר טיפים לסנן</td><td>Rainin</td><td>SR-L200F</td><td></td></tr><tr><td>FC בלוק</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>פישר 100 דקות מסננות</td><td>פישרברנד</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>צלחת במשקל בינוני</td><td>פישרברנד</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>פישרברנד</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>מספריים טחינה</td><td>פישרברנד</td><td>089531B</td><td></td></tr><tr><td>וורטקס</td><td>פישרברנד</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>BD Falcon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>צינורות FACS עליונים מסננים</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל נרתיק פיפטה 200</td><td>BD Falcon</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תחתונים עגולים</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק</td><td>BD Falcon</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>V צלחות תחתונות</td><td>Costar</td><td>07-200-107</td><td></td></tr><tr><td>העברת נורת פיפטה</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>שייקר</td><td>Thermo Scientific</td><td>11 676 071</td><td></td></tr><tr><td>מחצלת דבק</td><td>Thermo Scientific</td><td>1368750</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>תרבית תאים Sorvall</td><td>מתאמי 75253839</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall</td><td>75003723</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר CD16 / CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>ריכוז: 0.5 - 1 &mu; g/ 106 תאים</td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר F4/80</td><td>eBioscience</td><td>17-4801</td><td>מצומד פלואורופור: APC ריכוז: 0.2 &mu; g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: 17-4321</td></tr><tr><td>עכברוש נגד עכבר CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>מצומד פלואורופור: FITC ריכוז: 0.5 &mu; g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטייפ: 11/1/4031</td></tr><tr><td>אוגר ארמני נגד עכבר CD11c</td><td>eBioscience</td><td>12-0114</td><td>מצומד פלואורופור: PE ריכוז: 0.8 &mu; g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: Dec-88</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר MGL1/2</td><td>R& D Systems</td><td>FAB4297P</td><td>מצומד פלואורופור: PE ריכוז: 0.1 &mu; g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: IC108P</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר CD206</td><td>R& D Systems</td><td>FAB2535P</td><td>מצומד פלואורופור: PE ריכוז: 0.1 &mu; g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: IC108P</td></tr><tr><td>Rat נגד עכבר CCR2</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5538P</td><td>מצומד פלואורופור: PE ריכוז: 0.1 &mu; g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: IC013P</td></tr><tr><td>אוגר ארמני נגד עכבר TCR&#946;</td><td>BD Biosciences</td><td>553174</td><td>מצומד פלואורופור: APC ריכוז: 0.2 &mu; g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: 553956</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>552877</td><td>מצומד פלואורופור: PE-Cy7 ריכוז: 0.8 &mu; g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: 552784</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>557956</td><td>מצומד פלואורופור: Alexa Fluor 700 ריכוז: 0.2 &mu; g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: 557963</td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 1. רשימת חומרים וריאגנטים.</td></tr></tbody></table>

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

הגילוי של חדירת מקרופאג גדל ברקמת השומן (AT) של מכרסמים ובני אדם סובלים מהשמנת יתר הוביל להתגברות העניין בתרומה של תאים חיסונית לעמידות לאינסולין מקומית ומערכתית. בידוד וכימות של אוכלוסיות תאי חיסון שונות ברזה והשמנת יתר בחברה הוא טכניקה מנוצל בדרך כלל במעבדות immunometabolism; טיפול עדיין קיצוני יש לנקוט הן בבידוד בתא בכלי דם סטרומה וניתוח תזרים cytometry כך שהנתונים המתקבלים הוא אמין ולפרש . בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך בשר טחון, לעכל, ולבודד את החלק היחסי של כלי הדם המועשר בתאי סטרומה החיסונית. כתוצאה מכך, אנו מראים כיצד מקרופאגים נוגדני התווית ולימפוציטים מסוג T וכיצד כראוי שער עליהם בניסויי cytometry זרימה. חלקות זרימת cytometry נציג מעכברים שמנים שאוכלים שומן רזים וגבוהים בשומן האכילו נמוכים מסופקות. אלמנט קריטי של ניתוח זה הוא השימוש בנוגדנים שעושיםלא לזרוח בערוצים שבו במקרופאגים הם autofluorescent אופן טבעי, כמו גם שימוש בפקדי פיצוי הולם.

עיכול collagenase של AT אחריו צנטריפוגה ההפרש שימש לבודד את SVF מרפידות שומן epididymal של עכברים ממין זכר C57BL/6J האכיל שומן נמוך (10% מקלוריות שומן) או שומן גבוה (60% קלוריות משומנים) דיאטה (LFD וHFD , בהתאמה) במשך 16 שבועות. תאים של SVF אז תויגו עם נוגדנים ראשוניים fluorophore-מצומדות לכמת את שיעור הכספומטים קיימא (איור 1) ובתאי T (איור 2) באמצעות ניתוח FACS. gating הראשוני, כולל פיזור אור, אפליה כפיל, ושערים כדאיות מתואר באיורים 1 א &...

רקמת שומן (AT) היא אתר של הפעלת תא חיסונית חזקה ואינטראקציה. כמעט בכל התאים של המערכת החיסונית נמצאים בAT ויחסים שלהם שונו על ידי השמנת יתר. בידוד נכון, כימות, ואפיון של אוכלוסיות בתא חיסון הם קריטיים להבנת תפקידם במחלה immunometabolic.

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי חיסון של רקמת שומן. זה מושג על ידי הסרת רפידות השומן האפידרמיס תחילה. בשלב השני, רקמת השומן מתעכלת בקולגנאז.לאחר מכן, מקטע כלי הדם של רקמת השומן מבודד באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. בשלב האחרון, תאי החיסון של רקמת השומן מסומנים בנוגדנים ראשוניים מצומדים פלואורו. בסופו של דבר, ניתן לכמת את שיעור המקרופאגים ותאי T ברי קיימא השוכנים ברקמת השומן על ידי ציטומטריית זרימה.היי, אני אליסה הסטי. היום נראה לכם כיצד לבודד ולכמת תאי חיסון מרקמת השומן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים החיסוני, כגון כיצד אוכלוסיות תאי החיסון ברקמת השומן משתנות בעקבות מניפולציה גנטית פרמקולוגית או תזונתית.מי שידגים את ההליך היום יהיו אריאן קנדי וג'ב, או עמיתי פוסט-דוקטורט במעבדה שלי. לאחר הרטבה יסודית של פרוות החיה המורדמת עם 70% אתנול, בצע חתך ברמת תהליך ה- xiphoid ופתח את חלל בית החזה כדי לחשוף את הלב תוך הקפדה לא לחתוך כלי דם גדולים. לאחר מכן, מהדקים את הפרוזדור הימני כדי לאפשר לדם ולפרפו שמונה לצאת ממערכת הדם.לאחר מכן השתמש בזוג מלקחיים כדי לתפוס את הלב ולהכניס בעדינות מחט דרך הקודקוד לחדר השמאלי. כעת חלחלו לאט לאט את העכבר עם 15 מיליליטר PBS סטרילי. לאחר מכן פתח את חלל הצפק והסר את רפידות השומן של גונדת הפרג בזהירות כדי למנוע רקמת בלוטת המין.הניחו את רפידות השומן בסירת מי גבינה על קרח המכילה שני מיליליטר מגנזיום ו-DPBS ללא סידן בתוספת 0.5% BSA, ולאחר מכן טחנו את רקמת השומן לחתיכות דקות. כך צריך להיראות השומן בסיום הטחינה. כעת שפכו את רקמת השומן הטחון הומוגנאט לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.שוטפים את ה- webo עם מיליליטר אחד של DPBS בתוספת BSA ושופכים את הכביסה לצינור החרוטי. לאחר מכן, שטפו את סירת ה-WHE בשלושה מיליליטר תמיסת קולגנאז ושפכו את הכביסה לתוך הצינור. דגרו את ההומוגני בשייקר סיבובי למשך 20 דקות ב-200 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר של DPBS בתוספת BSA להומוגנאט באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר. לאחר מכן, חזור על ההומוגנאט המעוכל מספר פעמים והניח את הצינור על קרח. העבירו את מתלה התא דרך פילטר של 100 מיקרומטר לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר.לאחר סיבוב התאים, יש לשפוך את החנוצה ולאחר מכן לזרוק את האריתרוציטים המזהמים בתוך כדור תאי כלי הדם הסטרומלי. עם שלושה מיליליטר של מאגר CK. הוסף במהירות מאגר פקס כדי לנטרל את מאגר ה-CK.לאחר שטיפה וחזרה על הכדורים, התאים משהים מחדש את הגלולה במאגר פקס. לאחר מכן ספרו את התאים הקיימים על ידי אי הכללה של טריאן כחול ודללו עוד יותר את תרחיף התאים לריכוז סופי של חמישה עד 10 כפול 10 לששת התאים למיליליטר. התחל את הצביעה על ידי דגירה של התאים עם נוגדן חוסם CD 16, CD 32 FC נגד US לריכוז סופי של 0.5 עד 1 מיקרוגרם לכל 10 לששת התאים למשך 10 דקות על קרח.לאחר מכן חלקו את התאים לגדולים או שווים ל-10 לשש האליקוטים והעבירו את האליקוטים לצינורות תחתונים עגולים מפוליסטירן בגודל 12 על 75 מילימטר. שלב את כל התאים הנוספים במספר מספיק של צינורות כדי להתאים לפיצוי הנדרש ולפלואורסצנטיות שהשתנתה מינוס אחד בקרות. לאחר מכן הוסף פלואורו ארבעה נוגדנים ראשוניים מצומדים ובקרות איזוטיפ לצינורות המתאימים בריכוזים המתאימים.לאחר דגירה של הדגימות בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, שטפו את הדגימות פעמיים בשני מיליליטר של מאגר פקס Resus תוך השעיית הכדורים בגדול או שווה ל-400 מיקרוליטר של מאגר פקס לאחר הכביסה השנייה, העבירו את הדגימות לצינורות תחתונים עגולים מפוליסטירן בגודל 12 על 75 מילימטר המצוידים בחלק העליון של צינורות מסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר. רגע לפני הניתוח, הוסף לדגימות המתאימות. לאחר מכן השתמש בבקרה שלילית לא מוכתמת כדי להתאים את פיזור הצד בסולם לוג ואת הפיזור קדימה בסולם ליניארי.לאחר מכן, צייר שער פיזור אור ראשוני על סמך סוג התא המנותח והתאם את רווח צינור מכפיל הפוטו כך שהתאים הלא מוכתמים יהיו בקצה השמאלי של היסטוגרמה של פרמטר בודד הממורכז בערך על הנטייה של שני הסימנים עבור הערוצים המתאימים. באמצעות חרוזי פיצוי לכידת נוגדנים, בצע את הפיצוי הרב-צבעוני ולאחר מכן הגדר את שערי הניסוי על סמך בקרות הקרינה השונה שהוכנה קודם לכן. לבסוף, אסוף את המספר המתאים של אירועים על סמך שכיחות האוכלוסייה המעניינת ורשום את נתוני הניסוי.בסדרה ראשונה זו של עלילות צפיפות, תאי שבר כלי דם סטרומלי שבודדו מרקמת השומן האפידרמיסית בשתן נצבעו עבור F 4 80 ו-CD 11 B לזיהוי מקרופאגים של רקמת השומן. שלושת הפאנלים הראשונים הללו מדגימים את אסטרטגיית השער הראשונית, כולל האפליה הכפולה של פיזור האור ושערי הכדאיות. בשני הפאנלים הבאים הללו, ניתן לראות פלואורסצנטיות שונה מייצגת מינוס פקדים אחד המשמשים לקביעת שערי הניסוי.בדוגמה זו, הנוגדנים F four 80 ו-CD 11 B הוחלפו בבקרות איזוטיפ מתאימות כדי לקחת בחשבון אוטופלואורסצנטיות וקשירה לא ספציפית. לאחר מכן שורטטו שערי הרביע כדי לזהות את המקרופאגים החיוביים של רקמת השומן F four 80 CD 11 B. לאחר מכן ניתן היה להשוות את השיעור של F ארבעה 80 חיוביים CD 11 B מקרופאגים של רקמת שומן חיובית שבודדו מעכברים דלי שומן ועתירי שומן כפי שמתואר בתרשים הצפיפות המייצגת הללו.בסדרת הפאנלים הבאה הזו, שער פיזור האור הראשוני הוגבל לאוכלוסיית הלימפוציטים על מנת להימנע מהכללת תאים מיאלואידים אוטו-פלואורסצנטיים. בשני זוגות הפאנלים האחרונים הללו, מוצג שער מייצג עבור CD ארבעה חיוביים ו-CD שמונה תאי T חיוביים ברקמת השומן. לימפוציטים ברי קיימא של רקמת שומן גודרו לראשונה עבור TCR R beta tcr.תאי T של רקמת שומן חיובית R בטא היו מגודרים לאחר מכן לביטוי CD ארבע ו-CD שמונה. לאחר מכן ניתן היה להשוות את שיעור תאי ה-T החיוביים לבטא TCR ושל תאי T חיוביים ל-CD שמונה שבודדו מרקמת השומן של עכברים שניזונו מהשומן ודל השומן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי חיסון של רקמת השומן.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) המסומנים באופן פלואורסצנטי מרקמת השומן של קשת פריאורטית. לאחר הבידוד, NCADSCs מזוהים, ממוינים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ולאחר מכן תרבית על צלחת, קידום התפשטות תאים.

בידוד תאי גזע שמקורם בשומן מרקמת שומן פריאורטית מורין

ב2001, חוקרים באוניברסיטת UCLA תאר את בידודה של אוכלוסייה של תאי גזע בוגרים, המכונה תאי גזע שמקורם בשומן או ASCs, מרקמת שומן. מאמר זה מתאר את הבידוד של ASCs מlipoaspirates באמצעות פרוטוקול עיכול ידני, האנזימטית באמצעות collagenase.

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

בשל קשר דרסטי והשלילי בין השמנת יתר ומחלות רקע אחרים, מחקר על תפקיד השומן משחק במחלה ועל בריאות כללית היא מוצדקת. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד והכריתה של מחסני שומן ומאפשרים לחקר השומן באמצעות באתר ובשיטות חוץ גופית.

לוקליזציה, זיהוי, וכריתה של בסיס מיון Murine שומן

אנו מציגים את הטכניקות הנדרשות לבידוד מקטע כלי הדם הסטרומלי (SVF) ממאגרי רקמות שומן מפשעתיים (תת עוריים) ופריגונדלים (קרביים) של עכברים כדי להעריך את ביטוי הגנים והפעילות הקולגנוליטית שלהם. שיטה זו כוללת העשרה של תאי גזעשמקורם בשומן גבוה Sca1 (ASCs) באמצעות הפרדת תאים אימונומגנטיים.

הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup&gt; גבוה</sup&gt; בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.

בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד

פרוטוקול זה מתאר את הגישה הטכנית לבידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני רקמת שומן לבן תוך בטני (WAT) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או הפרדת חרוזים אימונומגנטית.

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד תאי אב שומן קיימא מאוד מרפידות שומן אפידיליות עכבר באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

פרוטוקול זה מספק שיטת עיכול יעילה של collagenase לבידוד של אדיפוציטים בני קיימא ותאי SVF של מקטע כלי דם סטרומה משומן בטני אנושי בתהליך יחיד, כולל מתודולוגיה להשגת RNA באיכות גבוהה מאדיפוציטים ופנוטיפפיקציה של SVF-מקרופאגים באמצעות צביעה של סמנים מרובים הקשורים לממברנה לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

כאן אנו מציגים שיטה סטנדרטית לבידוד יעיל של תאי גזע ומגדלי שומן שמקורם בשומן, המאופיינת בהפחתה של &gt;90% בזמן העיבוד, חיוניות תאית גבוהה ותאימות רחבה.

בידוד יעיל של תאי גזע ושומנים שמקורם בשומן מרקמת שומן חזיר

למדו לבודד תאים חיסוניים מרקמת שומן באמצעות עיכול קולגנאז וצנטריפוגה דיפרנציאלית. שיטה זו מאפשרת אפיון מקרופאגים ותאי T באמצעות ציטומטריית זרימה לחקר מחלות אימונומטבוליות.

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

גלה סרטונים נוספים