Name: Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: למדו שיטה לכימות נדידת תאי עצב מעיים בעוברי עכברים באמצעות מיקרוטום רוטט ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. השיטה מאפשרת לחקור את השפעת גורמי גדילה על התפתחות מערכת העצבים ההיקפית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים דניס Flipo עצה עיבוד תמונה וניתוח, ודוד וו Silversides במעבדה שלו היה נוצר קו עכבר Gata4p [5KB]-GFP. מחקר במעבדה פילון ממומן על ידי CIHR, NSERC, FRQS וFRQNT.

שמירה על האתיקה ניסויים מעורבים עכברים בוצעו בעקבות המועצה קנדית להנחיות טיפול בבעלי חיים לטיפול ולמניפולציה של בעלי חיים המשמשים במחקר רפואי. פרוטוקולים הנוגעים למניפולציה של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המוסד הרפואי מאוניברסיטת קוויבק במונטריאול (Comité Institutionnel דה ההגנה des ANIMAUX; מספר התייחסות 0512-R3-650-0513). 1. הכנת ג&#39;לי קולגן לעבוד בצורה סטרילית, מתחת למכסת מנוע בתרבית רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מלא 5x DMEM (המדיום החיוני שונה של הנשר) כולל אנטיביוטיקה סטנדרטית. ממיסים 3.37 גרם של אבקת DMEM ו0.925 גרם של NaHCO 3 ב20 מיליליטר מים. לעקר על ידי עובר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסף 2.5 מיליליטר של פניצילין 100x / סטרפטומיצין סטרילי ו25 מיליליטר של סרום שור עוברי חום מומת סטרילי. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על קרח, לערבב 800 μlשל קולגן פתרון (3.77 מ&quot;ג / מיליליטר ב0.02 N חומצה אצטית, פילטר מעוקר), 600 μl של 5x DMEM המלא ו17 μl של 1 N NaOH. לדלל עם מים סטריליים כדי נפח סופי של 3 מיליליטר. כוללים גורמי גדילה רלוונטיים בתמהיל. אנו משתמשים בדרך כלל בGDNF 10 מיליליטר / ng כדי לעורר הגירת NCC enteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדה על 480 μl בכל טוב של שורה אחת בצלחת 24 גם. למנוע בועות. השורות שנותרו ניתן להשתמש כדי לבחון את השפעתם של גורמי גדילה אחרים על נדידת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו קולגן פלמר שעה לפחות 1 בחממה סטרילית ב 37 ° C. </li></ol> 2. דיסקציה של בעלי חיים 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הזדווגויות ולבדוק תקעי נרתיק למחרת בבוקר. E0.5 היום להיות בצהריים ביום תוסף הנרתיק נמצא, לבודד את הנקבה ולחכות 12 ימים עד E12.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים בהריון עם isoflurane ולהרדים על ידי CO 2 שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הרם את של הבטןקרובי משפחה ולפתוח את חלל הבטן עם מספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרחם לתוך צלחת פטרי זכוכית מלאה קר כקרח PBS (פוספט שנאגרו מלוח). חותכים את הרחם באופן רוחבי בין נפיחויות deciduum פרט לבודד כל אתר השרשת עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה על כל אתר השתלה בנפרד בצלחת פטרי עוד כוס מלאה PBS קר כקרח. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחי קנס כדי להסיר את שכבת השריר של הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שק החלמון הקרביים וamnion כדי לחשוף את העובר. היזהר בעת ניתוק כלי הדם שהצטרף לעובר שק חלמון השליה / קרביים, כפי שהם שזורים במעיים מתפתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את ראשו של העובר בצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מלקחיים סגורים בחלל הבטן של עובר, בדיוק מעל הכבד בצבע אדום הכהה ולתת את המלקחיים פתוחים של עצמו (להפסיק הפעלת לחץ) כדי להפוך את הפתיחה רוחבית בחלל הבטן. משוך כלפי מטה את המלקחיים נפתחו לעברהקצה האחורי של העובר כדי לפתוח את הבטן לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את רקמת חיבור מאחורי הכבד ולמשוך את האומץ לצאת מהבטן, נזהר שלא לשבור את המעיים (המעי הגס מחובר אל פי הטבעת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי הגס כדי לשחרר את האומץ משאר העובר. החתך יכול להיעשות בכל מקום לאורך המעי הגס. שומר לעצמנו את חלק הזנב למועד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקניט את רקמת החיבור של cecum, ולאחר מכן את שאר קרבים. היזהר שלא לפצוע את המעיים תוך כדי כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הכבד וקיבה (בסוף מקורי של המעי הדק), כמו גם את הכליה בינים ורכסים באיברי המין, אם חלקם בהווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את המעי הדק. שוב, להיזהר שלא לקטוע את המעי. מעתה והלאה, את כיוון rosrrocaudal של רקמת המעי ניתן לעקוב באמצעות העקמומיות החדה ההווה בסוף מקורי. השאר את המעי הדק בPBS בטמפרטורת חדר למשך זמן קצר ביותר ככל האפשר לפניהםמצעים (ראה שלב 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, רשום את המספר של somites זנב לכל עובר כדי לקבוע את השלב של התפתחות עוברית באופן מדויק. </li></ol> 3. חתך של מעיים עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שאמשיך עם ניתוחי עובר, להמס 1.5 agarose גרם ב100 מיליליטר PBS (פוספט שנאגרו מלוח) ולשמור ב50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים נמס agarose לתוך עובש הטבעה (למשל סגר 2 צינור microcentrifuge מיליליטר שנחתך לאורכו לבלו על 1/4 מהצינור בקיר). בואו agarose להתקרר כ 42-45 מעלות צלזיוס, זה צריך להיות חם מעט רק למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את המעי העוברי ממש לפני agarose מתמצק (זה יכול להיות מוערך עם טיפים מלקחיים ויתרחש סביב 36-38 מעלות צלזיוס). מחזיק את המעי עם מלקחיים עד הסוף מקורי המקופל, למשוך אותו באיטיות רבה דרך agarose לאורכו של העובש. זה עוזר לשמור על הבטן ישר ואילו ערכות agarose. שחרר את tלהנפיק ברגע שהיא מתחילה להתנגד מועברת. עקוב אחר הנטייה מקורי, הזנב של המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את התבנית במקרר 2-3 דקות, כדי להבטיח את agarose יש להגדיר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את agarose מהתבנית (על ידי הזזה מצינור Eppendorf פתח אותו). עם להב, להוציא את agarose העודף בשני הקצוות, ביצוע חתכים בניצב למעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביקים את הסוף מקורי של המעי / agarose לחסום למטה על הבמה המתכת של microtome עם להב רוטט. חתוך את agarose העודף על הצדדים של בלוק המעי / agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עולה לבמת המתכת על חדר microtome הרוטט. במידת צורך, להתאים את הזווית של השלב כל כך המעי הוא אנכי ככל האפשר (ומכאן בניצב ללהב). כסה את הדגימה עם PBS קר כקרח. להביא את להב microtome עד כמה מילימטרים מתחת לפני שטח החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 200 מיקרומטר vibratome רוחבי קיצוצים של מעי הזנב הכי קטן, על מנת להבטיח שדוארפרוסת agarose ach מכילה סעיף מעיים מלא. </li></ol> 4. תרבות של המעיים Explants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפקיד את פרוסות מעי / agarose טרי חתוך שטוחות על גבי ג&#39;ל קולגן עם מלקחיים, מניח פרוסה אחת לקראת אמצע היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס, ב5% CO 2 אווירה לחה, כדי לאפשר הגירה של NCC מתוך explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פרוסות המעי / agarose את ג&#39;ל קולגן מאוד בעדינות עם מלקחיים. יש להיזהר שלא לגרום נזק לג&#39;ל בהמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע מלגעת בג&#39;ל קולגן ישירות במהלך שלבי דגירה ולשטוף לאחר מכן על מנת להבטיח כי דפוס נדידת תאים אינו מופרע. לתקן עם 500 μl של PFA 4% (paraformaldehyde) (PBS) לכל שעה גם 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מקבע עם 500 μl של DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole) פתרון (5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS) לכל היטב דגירה 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל אחד 3xעם 500 μl של PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את תאי הניאון (ערוצי ה-GFP וDAPI) משובצים בג&#39;ל קולגן בתוך היטב כל אחד. </li></ol> 5. ניתוח תמונה אנחנו עשינו שימוש נרחב בImageJ 17 לעבד ולכמת את התמונות שנוצרו אחרי תרבות explant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ההדמיה שקופית מיקרומטר בהגדלה זהה כמו תמונות תא ניאון. מדוד את אורכו של מיקרון אחד בפיקסלים (באמצעות כלי קו ישר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה (ניתוח / סט קנה מידה; קלט מספר הפיקסלים / מיקרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תצלום הקרינה ה-GFP, לשנות את פורמט תמונה לגוונים אפור 8 סיביות (Image/Type/8-bit). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם עוצמת האות (תמונה / התאם / בהירות / ניגודיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את רעשי רקע במידת צורך (תהליך / חיסור רקע; להתאים את רדיוס הכדור המתגלגל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סף כדי להדגיש תאים וגושי תא (תמונה / התאם / סף),n להחיל קו פרשת מים לחלק את הגושים (תהליך / בינארי / פרשת מים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח חלקיקים כדי לציין אזורים של עניין (ROI) וליצור סטטיסטיקות מספר התא (ניתוח / ניתוח חלקיקים; מינימום גודל קבוצה שלא לכלול פיקסלים שנותרו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר אפשרויות מדידה לכלול בקוטר של Feret (ניתוח / מדידות סט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצת ROIs ולמדוד בכללותה כדי לקבוע בקוטר של Feret, אינדיקציה של תא התפשטות (ניתוח / כלים / מנהל ROI / מנהל ROI / למדוד יותר / או, אז מנהל ROI / הוסף ו). </li></ol>

<ol><li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+neural+crest%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li>
<li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+developmental+disorders+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development and developmental disorders of the enteric nervous system.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).</li>
<li>Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).</li>
<li>Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li>
<li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li>
<li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li>
<li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li>
<li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li>
<li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li>
<li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li>
<li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li>
<li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease%2C+associated+syndromes+and+genetics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li>
<li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li>
<li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZD5438%2C+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1%2C+2%2C+and+9%2C+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אנו מראים כיצד vivo לשעבר טכניקת תרבות explant שלנו יכולה לשמש כדי לכמת באופן מדויק את פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות GDNF. כימות מדויק כזה הוא הקל מאוד על ידי שימוש 200 חלקי מעיים vibratome מיקרומטר עבים במקום חתיכות גדולות של גודל משוער, כפי שתואר 11,12,15 בעבר. ואכן, זה מאפשר לנו לעבוד עם מספר סביר של תאים בסביבה מאוד לשחזור. ראוי לציין, ההתפלגות אחידה של NCC enteric ניאון בתוך אזור הזנב-ביותר של המעי הדק שממנו פרוסות explant נחתכות גם מאפשרת ניתוח של מס...

תאי רכס עצביים (NCC) הם סוג תא חולף ייחודי לבעלי חוליות שמהווה נגזרים רבים במהלך ההתפתחות העובר. אוכלוסיית תא זו מתעוררת בגבול של הצלחת העצבית, סמוך להאאקטודרם אינו עצבי 1. במהלך neurulation, כיפוף של מקומות צלחת העצביים NCC לאורך קצה הגב של הצינור העצבי ויוצרים. NCC אז לעבור מעבר אפיתל-mesenchymal, הפרדה ונודדות הרחק בצינור העצבי. NCC ליישב מבנים עובריים שונים, כולל מערכת העיכול שבו הם יוצרים את כל מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מקושרת ביניהם של הגרעינים עצביים מוטבעת בדופן המעי. כפי שנסקר 2,3 לאחרונה, גנים רבים היו מעורבים בפיתוח של המבנה המורכב הזה. רוב ENS נגזר מברכה קטנה של מקור NCC מצינור מחנק העצבי (כלומר סביב הגבול למוח האחורי / חוט השדרה הפוטנציאלי) 4.אבות עצביים אלה מגיעים למעי הקדמי סביב היום העוברי (ה) 9.0 בעכברים ולאחר מכן להעביר caudally בתוך mesenchyme הבטן עד כ e15.0 ליישב את המעיים העובריים כולה. קבוצת משנה של קטין אבות עצביים במעי הגס הוא גם סיפקה ידי NCC עצם העצה, שיפלוש הבטן האחורית בכיוון ההפוך עד cecum 4. NCC שני מחנק ועצם העצה דורש מספר רב של הגירה, שגשוג, הישרדות ורמזי קידום בידול כדי להבטיח היווצרות של ENS מלא. בהקשר זה, מודלים של בעלי חיים - עכברים מהונדסים גנטי במיוחד - כבר סייעו בזיהוי של מספר ligands תאי החיוני: GDNF (גורם נוירוטרופי שמקורן בתאים גליה),,, (חלבוני morphogenic עצם) BMPs אנדותלין-3 neurotrophin-3, Netrin , כמו גם סוניק וההודי קיפוד (ששש וIHH) 5-10. מתוכם, GDNF איתות דרך RET טירוזין קינאז רצפטור הטרנסממברני (Rearranged במהלך transfection) מוכר כהדואר נתיב הקריטי ביותר לאטרקציה והדרכתו של NCC ולבתוך הבטן העוברית. GDNF מופרש על ידי mesenchyme המעיים ויוצר שיפוע rosrrocaudal spatiotemporally מבוקר שהוא ישירות chemoattractive לNCC enteric, המבטא RET 11,12. בין פונקציות אחרות, ENS מסדיר תנועה בתוך מערכת העיכול דרך האינטראקציה שלו עם שריר חלק שבדופן המעי. היעדרם של הגרעינים עצביים באזור הטרמינל של תוצאות המעי במחלת הירשפרונג: התכווצות טוניק של המגזר המושפע מוביל לחסימה, הצטברות במעלה הזרם של חומר מתעכל והתנפחות מסיבית של המעי והבטן. מחלת הירשפרונג מתרחשת כ אחד 5,000 לידה חי. דפוס הגירת rostro-הזנב של NCC enteric הוא האמין להיות הגורם העיקרי התורמים לאטיולוגיה של מחלת הירשפרונג. המעי הגס, הרחוק ביותר מהמקור הנודד NCC והחלק האחרון של bowel שאפשר לכבוש, הוא רגיש ביותר לפגמים בהיווצרות ENS. בהתאם לתפקיד המכריע שלה בהגירה NCC enteric, שיבוש איתות GDNF / RET הוא הגורם הגנטי הידוע העיקרי של מחלת הירשפרונג 13. כדי ללמוד טוב יותר NCC ופיתוח ENS, אנחנו שנוצרנו קו מהונדס עכבר - בשם Gata4p [5KB]-GFP 14 - בי NCC נדידה מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP). בשלב הבא אנו שיכללתי לשעבר assay vivo נדידת תאים, מותאם מעבודה שפורסמה על ידי קבוצות אחרות 11,12,15, שכעת מאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כגון GDNF.

<table><tbody><tr><td>אבקת DMEM</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td> מערכת סינון ואקום <td>Steriflip בדרגת ביוטכנולוגיה</td></tr><tr><td>(0.22 מיקרון)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td>קולגן</td></tr><tr><td>I</td><td>BD</td> באיכות גבוהה <td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>מדולל ממלאי 10 N ואז</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td> מסונן סטרילי <td>CLCYT305</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24-well Plate</td><td>BD biosciences</td><td>353047</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים לניתוח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>089515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת פטרי מזכוכית</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td> מיקרוסקופ מנתח <td>בדרגת תרבית תאים</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>M125</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>דומונט #5 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11251-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי</td> בדרגת ביוטכנולוגיה <td>נוצה</td><td>21</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>עט דבק מיידי לכל מטרה</td><td>Krazy Glue Krazy</td><td>KG824</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V להב רטט מיקרוטום</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>920110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9564</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">טבלה של ריאגנטים וציוד ספציפיים.</td></tr></tbody></table>

assay נדידת תאים כמותיות לmurine אבות עצביים enteric

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

תאי רכס עצביים (NCC) הם אוכלוסיית תאים חולפת וmultipotent שמקורו בצינור העצבי הגבי ונודדת בהרחבה לאורך כל עובר חוליות המתפתחת. בנוסף לאספקת גליה ותאי עצב היקפיים, NCC ליצור מלנוציטים כמו גם רוב שלד קרניו-פנים. הגירת NCC והבידול נשלט על ידי שילוב של מוצא הצירי שלהם יחד בצינור העצבי ואת החשיפה שלהם לאותות תאיים אזורי שונים. תרומה כזו של ligands תאי באה לידי ביטוי במיוחד בתקופת היווצרותה של מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מורכבת ביניהם של הגרעינים עצביים השולטת באופן מקומי (בין השאר) תנועת שרירים בטן ואת תנועתיות מעיים. רוב ENS נגזר מברכה ראשונית קטנה של NCC שמתחייב למסע ארוך על מנת ליישב - במקורי לאופנה הזנב - לכל אורכו של המעי הפוטנציאלי. בין כמה מסלולי איתות ידועיםלהשפיע קולוניזציה NCC enteric, GDNF / איתות RET מוכרת כחשוב ביותר. ואכן, הפרשת spatiotemporally המבוקר של ליגנד RET GDNF ידי mesenchyme הבטן היא בעיקר אחראית למשיכה והדרכתו של NCC enteric-להביע RET ולבתוך הבטן העוברית. כאן, אנו מתארים vivo לשעבר assay נדידת תאים, מה שהופך את שימוש בקו עכבר מהונדס בעלי NCC שכותרתו fluorescently, המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כולל GDNF.

התוצאות הבאות הן נציג של מה שניתן להשיג עם הטכניקה שתוארה כאן (איור 1). השימוש בגורמי גדילה (כלומר GDNF) מגרה הגירה של NCC enteric מתוך explant המעיים ולג&#39;ל קולגן-GFP-לבטא (איור 2). למרות שחלק מהתאים לצאת מexplant בהעדר גורמי גדילה, אלה הם בעיקר לא-GFP שכותרתו ויציינו את כניסתה הפסיבית. יש צורך להסיר את פרוסת המעיים מג&#39;ל קולגן על מנת לרשום את התוצאות, כפי שהרקמה זו עדיין מאוכלסת בצפיפות על ידי תאי ניאון ואחרת היה להסתיר את התאים ש...

אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת את פוטנציאל הנדידה של תאי פרוגניטורים עצביים של מערכת העיכול בנוכחות גורמי גדילה שונים. הדבר מתבצע תחילה על ידי דיסקציה של מעיים דקים עובריים של עכברים, המאוכלסים בתאי neuro crest פלואורסצנטיים. השלב השני הוא שימוש במיקרוטום רוטט ליצירת פרוסות מעיים בעובי 200 micron.בשלב הבא, פרוסות אלו מדגירות על גבי ג'ל קולגן המכיל גורמי גדילה. השלב הסופי הוא קילוף הפרוסות כדי לחשוף את התאים הנודדים שמתחתיהן. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להראות את דפוס התאים הנודדים בתוך ג'ל הקולגן.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלה מרכזית בביולוגיה של ההתפתחות, כגון אספקת הבנה טובה יותר של הגומלין בין מסלולי איתות שונים העומדים בבסיס היווצרותו של מערכת העצבים ההיקפית. 12 ימים לאחר מציאת פקיק נרתיקי, בצעו קריו-אופטניזציה של נקבת העכבר והוציאו את הרחם, והניחו אותו בתוך צלחת פטרי מזכוכית מלאה בקרח. באמצעות PBS קר, חתכו את הרחם לרוחב בין הנפיחויות של הרחם כדי לבודד כל אתר השתרשות של עובר תחת מיקרוסקופ דיססקציה, והשתמשו בפינצטה עדינה להסרת שכבת השריר של הרחם.פתחו את שקיק החלמון הוויסרלי ואת השליה כדי לחשוף את העובר. הפעילו זהירות בעת חיתוך כלי הדם המחברים את העובר לשקיק החלמון, שכן הם שזורים במעיים המתפתחות. לאחר מכן, הכניסו פינצטה סגורה לחלל הבטן, ממש מעל הכבד בעל הגוון האדום הכהה, ופתחו אותה.פעולה זו יוצרת פתח רוחבי בחלל הבטן. משכו את הפורספס הפתוח כלפי מטה לכיוון הקצה האחורי של העובר כדי לפתוח את הבטן לחלוטין. לאחר הפתיחה, תפסו את רקמת החיבור שמאחורי הכבד ושלפו את המעיים.יש להיזהר לא לפגוע במעיים. חתכו את המעי הגס (colon) בכל נקודה כדי לשחרר את מערכת העיכול משאר העוברי. שמרו את חלק הזנב לשלב מאוחר יותר.הפרידו בעדינות את רקמת החיבור מהמעי העיוור ולאחר מכן מהמעיים, תוך הקפדה שלא לפצוע אותם בקצה הרוסטרלי של המעי הדק. הסתירה את הכבד והקיבה, כמו גם את המזו, הנפרוס ואת רכבי האיברים המיניים אם הם נוכחים. לבסוף, בודדו את המעי הדק על ידי הסרת המעי העיוור והמעי הגס, וכן את שארית רקמת החיבור.כפי שנעשה קודם לכן, יש להקפיד שלא לפצוע את המעי. השארו את המעי הדק ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך זמן קצר ככל האפשר לפני הקיבוע. לאחר חיתוך העובר באזור הצוואר, רשמו את מספר הסומיטים בזנב כדי לקבוע במדויק את שלב ההתפתחות העוברית.לפני תחילת הדיסקציה של העוברים, המססו 1.5 גרם agros ב-100 מיליליטר של PBS ושמרו בטמפרטורה של 50 °C. הכינו את תבנית הטמיעה על ידי חיתוך של מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח של שני מיליליטר לאורכה, כדי להסיר כרבע מדופן המבחנה. שפכו את ה-agros המומס לתוך התבנית והמתינו שיתקרר עד שיהיה רק חמים קלות למגע.במידה והדבר מוכן, החזיקו את המעי בעזרת פינצטה בקצה הרוסטרלי המקופל ומשכו אותו באיטיות רבה דרך האגרוס, לאורך התבנית. פעולה זו מסייעת בשמירת המעי ישר בזמן שהאגרוס מתקשה; שחררו את הרקמה ברגע שהיא מתחילה להתנגד לתנועה ושמרו על מעקב אחר האוריינטציה הרוסטרלית של המעי. לאחר מכן, הניחו את התבנית במקרר למשך שתי עד שלוש דקות כדי שתתקשה לחלוטין.לאחר ההתקשות, הוציאו את ה-agros מהתבנית וגזרו את שאריות ה-agros בשני הקצוות, באמצעות חיתוכים בניצב למעי. הדביקו את הקצה הרוסטרלי של בלוק ה-agros לבמה המתכתית של המיקרוטום וגזרו את שאריות ה-aros מכל הצדדים. לאחר מכן, התקינו את הבמה המתכתית בתא המיקרוטום הרוטט.במידת הצורך, התאימו את זווית הבמה כך שהמעי יהיה אנכי ככל האפשר. כסו את הדגימה ב-PBS קר מאוד לפני הורדת להב המיקרוטום למרחק של מספר מילימטרים מתחת לפני השטח של התמיסה. כאשר הדבר מוכן, בצעו חיתוכים רוחביים בעובי של 200 micron של המעי הדק של ה-coddle most.ודאו שכל פרוסת agro מכילה מקטע מעי מלא. הניחו בעדינות את הפרוסות שזה עתה נחתכו על ג'ל קולגן שהוכן מראש. הניחו פרוסה אחת לעבר מרכזו של כל באר כדי לאפשר את נדירת תאי הרב תאיים (neuro crest cells) אל מחוץ לפרוסות, והדגירו את הפרוסות למשך שלושה ימים.לאחר זמן זה, הסירו בעדינות את הפרוסות מג'ל הקולגן באמצעות פינצטה, תוך הקפדה לא לפגוע בג'ל שמתחתיהן. כדי להבטיח שדפוס נדידת התאים לא יופר, חשוב להימנע ממגע ישיר עם ג'ל הקולגן במהלך שלבי הדגירה והשטיפה הבאים. ראשית, קבעו את התאים עם 500 µL של 4% PFA לכל באר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, החליפו את המקבע ב-500 µL של תמיסת DPI לכל באר והדגירו למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, הסירו בזהירות את תמיסת ה-DPI ושטפו כל באר שלוש פעמים עם 500 µL של PBS למשך חמש דקות. לבסוף, צלמו את התאים הפלואורסצנטיים השקועים בג'ל הקולגן בכל באר.בדוגמה זו, נעשה שימוש בגורמי גדילה כדי לעורר נדידה של תאי עצב במערכת העיכול המבטאים GFP. הקו המקווקו מייצג את הגודל והמיקום המשוערים של הנתח (explan). לפני הסרתו מהג'ל, נמצא כי מספר התאים המבטאים GFP וההתפשטות שלהם בעת הנדידה אל מחוץ לנתח המעי היו גבוהים באופן משמעותי בתנאים מטופלים לעומת תנאים לא מטופלים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לקבוע את פוטנציאל הנדידה של תאי אב עצביים אנטריים (enteric neural progenitors), באמצעות הדגרה של פרוסות מעי מעל ג'ל קולגן המכיל גורמי גדילה.

a-quantitative-cell-migration-assay-for-murine-enteric-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

פרוטוקול זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות הדמיה של הגירה neuroblast בזרם נודדות מקורי.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

סרטון זה מדגים את מבחן ההגירה של תאי נוירוספירה עצביים מקדימים – בדיקה במבחנה לחקר התגובה הנודדת של תאים מקדימים עצביים מהנוירוספרה – באמצעות אנליזה מיקרוסקופית.

NPC Neurosphere Assay: בדיקה חוץ גופית כדי להעריך את התגובה הנודדת של תאים מבשרי עצבים מן הנוירוספרה

כאן אנו מתארים תא שוואן (SC) assay הגירה שבSCS מסוגל לפתח לאורך האקסונים של הארכה.

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

הגירת neuroblast היא צעד חיוני בנוירוגנזה לאחר לידה. הפרוטוקול מתואר כאן ניתן להשתמש בם כדי לחקור את התפקיד של רגולטורים מועמד של הגירת neuroblast ידי העסקת nucleofection DNA / RNA סיכת הראש קטן (shRNA) וassay הגירת 3D עם neuroblasts מבודדת מהזרם הנודדות מקורי לאחר הלידה המכרסם.

Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast<em&gt; במבחנה</em

ההשתלה של תאי גזע עצביים / אב (NPCs) מחזיקה בהבטחות גדולות בתחום הנוירולוגיה רגנרטיבית. המשלוח המערכתי של NPCs הפך לפרוטוקול יעיל, נמוך פולשנית וטיפולית יעיל מאוד כדי לספק תאי גזע במוח ובחוט השדרה של מכרסמים וקופים לא אנושיים מושפעים מניזק דלקתי כרוני ניסיוני של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקה מערכתית של תאי גזע / אב עצביים בעכברים עם EAE כרוני

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

התפתחותיות תהליכים כגון התפשטות ההעברה, תוצר neurite לעיתים קרובות מוטרד מנוטלי מחלות. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקולים להעריך במהירות, reproducibly אלה בתהליכי התפתחותיות NPCs נגזר iPSC אנושי. פרוטוקולים אלה מאפשרות גם להערכת ההשפעות של גורמי גדילה הרלוונטיים הרפוי על פיתוח NPC.

זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)

אנו מציגים שלושה פשוטים מחוץ לגוף הרחב, שיטת ההגירה למרחקים ארוכים, שיטת ההגירה של תרבות השיתוף, והטיפול בטיפול בכימותרפיה-הערכת באופן קולקטיבי את התפקודים של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאים אנדותקיים וה אינטראקציה עם האינטרנוירונים הבינכולינרגיות.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

למדו שיטה לכימות נדידת תאי עצב מעיים בעוברי עכברים באמצעות מיקרוטום רוטט ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. השיטה מאפשרת לחקור את השפעת גורמי גדילה על התפתחות מערכת העצבים ההיקפית.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

גלה סרטונים נוספים