Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric
18 בספטמבר 2013
אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את פוטנציאל הנדידה של אבות נוירולוגיים מעיים בנוכחות גורמי גדילה שונים. זה מושג על ידי ניתוח ראשון של מעיים דקים עובריים של עכברים המאוכלסים בתאי קרום עצבי פלואורסצנטיים. השלב השני הוא להשתמש במיקרוטום רוטט כדי ליצור פרוסות מעיים בעובי 200 מיקרון.
לאחר מכן, פרוסות אלה מודגרות על גבי ג'ל קולגן המכיל גורמי גדילה. השלב האחרון הוא לקלף את הפרוסות על מנת לחשוף את התאים הנודדים שמתחת. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת להצגת דפוס התאים הנודדים בתוך ג'ל הקולגן.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון מתן הבנה טובה יותר של יחסי הגומלין בין מסלולי איתות שונים העומדים בבסיס היווצרות מערכת העצבים ההיקפית. 12 יום לאחר מציאת פקק נרתיקי, המתת חסד של נקבת העכבר והוצאת הרחם, הכניסו את הרחם לצלחת פטרי מזכוכית מלאה בקרח. PBS קר חותך את הרחם לרוחב בין נפיחויות דאום בודדות כדי לבודד כל אתר השתלת עובר תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר את שכבת השריר של הרחם.
פתח את שק החלמון הקרביים ואת מי השפיר כדי לחשוף את העובר. היזהר בעת ניתוק כלי הדם, חיבור העובר לשק החלמון כשהם שזורים במעיים המתפתחים. לאחר מכן, הכניסו מלקחיים סגורים לחלל הבטן ממש מעל הכבד בצבע אדום כהה ואפשרו להם להיפתח.
זה יוצר פתח רוחבי בחלל הבטן. משוך את המלקחיים הפתוחים כלפי מטה לכיוון הקצה האחורי של העובר כדי לפתוח את הבטן לחלוטין. לאחר הפתיחה, תפסו את רקמת החיבור מאחורי הכבד ומשכו את המעיים החוצה.
מקפידים לא לשבור את המעיים. חתכו את המעי הגס בכל מקום כדי לשחרר את המעיים משאר העובר. שמור את חלק הזנב למועד מאוחר יותר.
הקניטו את רקמת החיבור מהצקום ולאחר מכן את המעיים, עבדו בזהירות כדי לא לפצוע אותם בקצה הרוסטרלי של המעי הדק. חתכו את הכבד והקיבה, כמו גם את המזו, הנפרו ורכסי איברי המין אם קיימים. לבסוף, בודדו את המעי הדק על ידי כריתת הצקום והמעי הגס, כמו גם את רקמת החיבור שנותרה.
כמו קודם, הקפד לא לחתוך את המעי. השאירו את המעי הדק ב- PBS בטמפרטורת החדר לזמן קצר ככל האפשר לפני ההטמעה. לאחר כריתת העובר בצוואר, רשום את מספר הסומיטים בזנב כדי לקבוע במדויק את שלב ההתפתחות העוברית.
לפני שתמשיך בנתיחת עוברים, ממיסים 1.5 גרם אגרוס ב 100 מיליליטר PBS ושומרים על 50 מעלות צלזיוס. הכן את תבנית ההטבעה על ידי חיתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר לאורכו כדי לכרות כרבע מדופן הצינור. יוצקים את האגרוס המומס לתבנית ונותנים לו להתקרר עד שהוא רק מעט חם למגע.
כשהוא מוכן, החזיקו את המעי בעזרת מלקחיים בקצה הרוסטרלי המקופל ומשכו אותו לאט מאוד דרך האגרוס, לאורך התבנית. זה עוזר לשמור על המעי ישר בזמן שהערכות החקלאיות משחררות את הרקמה ברגע שהיא מתחילה להתנגד להזזה ולעקוב אחר כיוון המעיים של המעיים. לאחר מכן, הכניסו את התבנית למקרר למשך שתיים-שלוש דקות להתייצבות מלאה.
לאחר ההתייצבות, הוציאו את האגרוס מהתבנית וחתכו את עודפי האגרוס בשני הקצוות, תוך יצירת חתכים בניצב למעי. הדביקו את הקצה הרוסטרלי של בלוק האגרוס לשלב המתכת של מיקרוטום וחתכו את הארוס העודף מכל הצדדים. לאחר מכן, הרכיב את שלב המתכת על תא המיקרוטום הרוטט.
במידת הצורך, התאם את זווית השלב כך שהמעי יהיה אנכי ככל האפשר. כסו את הדגימה ב-PBS קר כקרח לפני שמורידים את להב המיקרוטון לכמה מילימטרים מתחת לפני החיץ. כשהוא מוכן, בצע חתכים רוחביים של 200 מיקרון של המעי הדק ביותר.
הקפדה על כך שכל פרוסת אגרו מכילה חתך מעיים מלא. הפקידו בעדינות את הפרוסות הטריות שנחתכו על ג'ל קולגן שהוכן בעבר. מניחים פרוסה אחת לכיוון אמצע כל באר כדי לאפשר נדידה של תאי נוירו-קרסט מתוך החצילים, דוגרים על הפרוסות למשך שלושה ימים.
לאחר זמן זה, הסר את הפרוסות מג'ל הקולגן בעדינות בעזרת מלקחיים והקפיד לא לפגוע בג'ל שמתחת. כדי להבטיח שדפוס נדידת התאים לא יופרע, חשוב להימנע מלגעת ישירות בג'ל הקולגן במהלך שלבי הדגירה והשטיפה הבאים. ראשית, תקן את התאים עם 500 מיקרוליטר של 4% PFA לבאר למשך שעה בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, החלף את הקיבוע ב -500 מיקרוליטר תמיסת DPI לבאר ודגר למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, הסר בזהירות את תמיסת ה- DPI ושטוף כל באר שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBS למשך חמש דקות. לבסוף, צלם את התאים הפלואורסצנטיים המוטבעים בג'ל הקולגן בתוך כל באר.
בדוגמה זו, נעשה שימוש בגורמי גדילה כדי לעורר את הנדידה של GFP המבטאים תאי קרום עצבי אנטרי. הקו המקווקו מייצג את הגודל והמיקום המשוערים של התצוגה. לפני שהוסר מהג'ל, נמצא כי המספר וההתפשטות של תאים המבטאים GFP הנודדים מחוץ למשטח המעי היו גדולים משמעותית במצבים מטופלים לעומת מצבים לא מטופלים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע את פוטנציאל הנדידה של אבות עצביים מעיים על ידי דגירה של פרוסות מעיים מעל ג'ל קולגן המכיל גורמי גדילה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג בדיקת נדידת תאים ex vivo שנועדה לכמת את פוטנציאל הנדידה של תאי רב-עצביות של הרבץ האנטרי (enteric neural crest cells) בתגובה לגורמי גדילה שונים. המתודולוגיה כוללת נתיחה של מעיים דקים עובריים של עכבר ושימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיית התאים הנודדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- תאי רב-עוצמה של הרב המעיים (Enteric neural crest cells) ממלאים תפקיד מכריע בפיתוחו של המערכת העצבית האנטרית.
- הבנת נדידתם חיונית להשגת תובנות לגבי הפרעות במערכת העיכול.
- גורמי גדילה יכולים להשפיע על התנהגותם של תאים אלו במהלך הפיתוח.
- בדיקות ex vivo מספקות סביבה מבוקרת לחקר נדידת תאים.
מטרת המחקר
- כימות פוטנציאל הנדידה של תאי אב נוירונליים אנטריים.
- הערכת ההשפעה של גורמי גדילה שונים על נדידת תאים.
- פיתוח בדיקה מהימנה למחקרים עתידיים על תאי רבב עצבי אנטריים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- דיסקציה של מעיים דקים עובריים של עכבר המכילים תאי רשת עצבית (neural crest cells) פלואורסצנטיים.
- הכנת פרוסות בעובי 200 micron באמצעות מיקרוטום רוטט.
- אינקובציה של פרוסות רקמה על ג'ל קולגן עם גורמי גדילה.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה להדמיה וניתוח של תאים נודדים.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של דפוסי נדידת תאים בתגובה לגורמי גדילה.
- הדמיה של תאים נודדים מתחת לפרוסות הרקמה.
- הדגמה של יעילות הבדיקה בחקר התנהגותם של תאי רב-עצביים של הרכס העצבי האנטרי.
- תובנות לגבי תפקידם של גורמי גדילה ספציפיים בנדידת תאים.
מסקנות
- הבדיקה מחוץ לגוף (ex vivo) מספקת כלי בעל ערך לחקר נדידת תאי רכס עצביים של מערכת העיכול.
- גורמי גדילה משפיעים באופן משמעותי על פוטנציאל הנדידה של תאים אלו.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מתודולוגיה זו כדי לבחון מטרות טיפוליות להפרעות בדרכי העיכול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
בדיקות כמותיות של נדידת תאים עבור תאי אב עצביים אנטריים של עכברים מאפשרות הערכה מדויקת של השפעות גורמי גדילה על ניידות תאי רב עור (neural crest), פרמטר קריטי בשלבים מוקדמים של גילוי ותיקוף מטרות למחקרים בנושאי התפתחות עצבית ומערכת העיכול. פלטפורמה זו, המבוצעת ex vivo, מספקת נתונים חזקים וניתנים לשחזור לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים ותמיכה בביטחון חיזוי באסטרטגיות של מודולציה של מסלולים. התוצרים הכמותיים של הבדיקה מקלים על קבלת החלטות בתיק הפיתוח, מותאמות לסיכון, בנקודת המפגש שבין ביולוגיה התפתחותית למדעי העצבים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולי איתות של גורמי גדילה המשפיעים על נדידת תאי רבוי (neural crest cells).
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות מועמדות המעורבות בפיתוח מערכת העצבים האנטרית.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי כימות תגובות תאיות למודולציה של מסלולים.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מטרות להמשך הערכה פרה-קלינית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקימה מערכת ex vivo מתוקפת להערכה כמותית של נדידת תאים.
- מספקת תוצאות הניתנות לשחזור המבוססות על פלואורסצנציה, המתאימות לניתוח השוואתי.
- תומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך סריקת תרכובות או חומרים ביולוגיים בשלבים הבאים.
- מאפשרת הערכה מהימנה של השפעות גורמי גדילה או מעכבים על ניידות של תאי אב עצביים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות של הפרעות במערכת העיכול והפרעות התפתחותיות נוירולוגיות.
- מספק רצף משלב בחינת המסלולים בשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות מועמדות.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור פנוטיפים של נדידה תאית לפעילות המסלול.
- מסייע בקידום מותאם-סיכון של היפותזות טיפוליות המכוונות לנדידת תאי רבב העצבים (neural crest).
אינטגרציה של תהליכי עבודה ושלביי עיבוד (Pipeline & Workflow)
בדיקת נדידה כמותית זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים למחקר תרגומי על התפתחות מערכת העצבים האנטרית.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את נדירת תאי אב עצביים בתגובה לגורמי גדילה מוגדרים, ובכך תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת תוצאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור לצורך הערכה השוואתית של מודולטורים פוטנציאליים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של מרחק הנדירה ומספר התאים, דבר המקל על השוואה סטטיסטית בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים של נדירה ex vivo לנקודות קצה רלוונטיות למחלה במודלים של מערכת העיכול והתפתחות עצבית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמת בדיקה שניתן להשתמש בה שוב, הניתנת להתאמה לגורמי גדילה, מעכבים ורקעים גנטיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי הגירה של תאי רב רב-עשיר (neural crest).
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה של בדיקות (assays) סטנדרטיים, ניתנים להרחבה ולשחזור עבור צוותים רב-תחומיים.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת של המשך או עצירה (go/no-go) ובקידום יעיל של משאבים בתוכניות פיתוח נוירו-התפתחותיות וגסטרו-אינטסטינליות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות ומסלולים מותאם-סיכון לצורך פיתוח פרה-קליני נוסף.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של עוברים, פריסת רקמות ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- דורש גישה למיקרוטומים רוטטים, הכנת ג'ל קולגן ותשתית דימוג.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הגדרת הבדיקה ופרוטוקולים של אנליזה כמותית.
- ניתן להתאמה לגורמי גדילה ומודלים גנטיים שונים, אך מוגבל לתנאי ex vivo.
- תלוי בזמינות של קווי עכברים טרנסגניים עם תאי רב גלולי (neural crest cells) המסומנים פלואורסצנטית.
