Name: Nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד ואיתור התנגדות אנטיבקטריאלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: למדו כיצד לכמת התנגדות אנטיביוטית באמצעות חיישני קנטילבר לניתוח מכאני של אינטראקציות סמים-יעד בחיידקים. שיטה זו מאפשרת גילוי סוכנים אנטיבקטריאליים חדשים ביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ג&#39;וזף וו Ndieyira נתמכה על ידי הנדסת מדעים הפיזיקליים מועצה למחקר (EPRSC), מרכז למחקר רב תחומי בננוטכנולוגיה (IRC), חברה המלכותית (RS) וייעוץ ביאנו (BNC). אנו מודים, אלחנדרה Donoso Barrera, Dejian ג&#39;ואו, מנואל Vögtli, מתיו באצ&#39;לור, מתיו א קופר, טורסטן Strunz, טרבור Rayment וגבריאל Aeppli לדיונים מועילים.

1. הכנת cantilevers <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטפלון פינצטה לטבול מספר הנבחר של שבבי שלוחה (כל שלוחה מדידה 500 מיקרומטר הארוך, 100 מיקרומטר רחב ו0.9 מיקרומטר עבה) לפתרון Piranha טרי (ב 1:1 H 2 SO 4 ו-H 2 O 2) במשך 20 דקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 20 דקות להסיר את שבבי שלוחה מפתרון Piranha ולשטוף אותם ביסודיות עם מים deionized ולהעביר באופן מיידי לפתרון Piranha מוכן טרי. חזור על שלב 1.1 לעיל, אם את השבבים מכילים כתמי לכלוך אחר, המשיכו לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניקוי יסודי במי deionized, לשטוף עם אתנול טהור ולייבש את שבבי שלוחה על פלטה חמה על 75 ° C כדי להסיר כל עקבות של מים. לבדוק אותם באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר הניקיון שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את שבבי שלוחה ניקו לתא אידוי ולשאוב למטה, כדי להשיג מיקוד ואקוםלחץ של 10 -7 mbar. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שלחץ הוואקום הנדרש יושג, צד אחד מעיל של כל מערך שלוחה עם טיטניום 2 ננומטר ראשון שפועל כשכבת הדבקה לפני שכבה נוספת של 20 ננומטר זהב עבה. כדי לאשר את העובי שלהם, להשתמש בצג גביש קוורץ ממוקם ישירות מעל למקור היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר שבבי חיישן שלוחה מצופים זהב בתא עבור 1-2 שעות להתקרר תחת ואקום לפני הפתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השבבים טריים התאדו לכלי אחסון ואקום מלאים בארגון, כדי למנוע כל סוג של זיהומים. </li></ol> 2. Functionalization צ&#39;יפ שלוחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , ראשית לארגן צינורות מייקר הנימים על במה functionalization 2 בהתאם לגודל המגרש שלוחה של 250 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן 2 מ&quot;מ פתרונות האתנולית תיאול של מולקולות מטרת משטח, mucopeptides חיידקי IE (D-עלא ו-D-Lac) להזריק, וINER &#39;alkanethiol &#39;לא מסתיים בגליקול triethylene (PEG) ידועה להתנגד biomolecular ספיחה. 16 כל אחד מtubings הנימים צריך להכיל מולקולות ללכוד שטח שונים שנקבעו באופן אקראי, כדי למנוע הטיה משתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הבאה במשך 20 דקות את cantilevers בmicrocapillaries מלאה בפתרונות המכילים מולקולות תיאול לכידת פני שטח. להבטיח כי פתרונות של המולקולות ללכוד משטח מוגבלים על כל חיישן שלוחה אדם, כדי למנוע או למזער זיהומים צולבים. אם תהליך זה הוא מועסק בצורה נכונה, הוא צריך לשנות את אופן שיטתי cantilevers מצופה הזהב שהוכן זה עתה לחיישנים כימיים פעילים שהוקמו על ידי המאפשר לטילים נ&quot;מ של מטרות mucopeptide חיידקים להיווצר על משטחי זהב מצופים כמו קולטנים. </li></ol> 3. הכנות פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.1 מלחי פוספט נתרן מונו ודי בסיסיים-M במי ultrapure (18.2 MΩ · ס&quot;מ התנגדות) ולא לערבבo להניב ערך ה-pH של 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.002% מPS80 לפתרונות שנאגרו כדי למזער את ההשפעות שנגרמו על ידי צבירת אינטראקציות ספציפיות של מולקולות תרופה לכלי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרופות עם פתרונות טריים שנאגרו לריכוזים השונים הרצויים שיאפשר חישוב של K ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את פתרונות סמים המוכנים טרי באמצעות מסנני 0.2 מיקרומטר וsonicate במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר לפני הקאה עם ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור על התהליך עם תרופה בסרום שנאגרו באמצעות כל סרום. מערבולת בעדינות במשך 15 דקות עם 5 דקות נוספות על מנת להבטיח מסיסות מלאה. </li></ol> 4. איתור מתח פני השטח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען שבב חיישן שלוחה פונקציונליות לתוך תא תא זרימת נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את נקודת לייזר על גבי קצה החופשי של כל חיישן ולאשר את היישור על ידי חימום חדר הנוזל ל1 ° C. כל שמונה מערכי חיישן שלוחה המצופים הזהב צריכים לעבור compressive כלפי מטה כיפוף בגלל השפעת bimetallic נגרמת על ידי ההבדלים בשיעורי התרחבות של סיליקון וזהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חימום לכ -10 דקות, לאפשר לcantilevers להתקרר במשך 10 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הווריאציה כיפוף באותות כיפוף המקסימאליים בין חיישני שלוחה בודדים ואם סטיית התקן היחסית של אותות כיפוף היא ≤ 5% לאחר מכן לקבל את היישור כרצוי אחרת לחזור על התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, למדוד את תדרי התהודה של כל שמונה cantilevers לחשב קבועי האביב שלהם. אם הווריאציה של המעיין המתמיד בין כל חיישן שלוחה בתוך שבב היא ≤ 1% אז יקבלו את השבב כבעל תכונות מכאניות עקביות אחרת להחליף את חיישן שבב שלוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להשתמש במערכת fluidic (דגם Genie פלוס) דרך שסתום שש דרך להשיג תמורת הנוזל בתוך תא הזרימה בזמן צריכה להיות מושגת באמצעות רכישת נתונים LabVIEW אוטומטי כךftware. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על שלוחה כיפוף נתונים, להשתמש בפרוטוקולי המדידה הבאים: I) להזריק או פתרון חיץ או בסרום ללא תרופה למדידת טווח לשליטת 5-30 דקות להקים בסיס; II) להזריק פתרון תרופה במשך 30-60 דקות, III) להזריק 10 מ&quot;מ HCl לשטוף עבור 10-60 דקות כדי לנתק מורכב תרופה חייבת; IV) סוף סוף להזריק צעד שטיפה נוסף באמצעות פתרון חיץ לדקות 5-30 אחרת להתחדש פפטידים על פני השטח ולשחזר את אות קו הבסיס. תמיד להבטיח כי כל אותותיו נרכשים תחת קצב זרימת נוזל מתמיד של 30-180 μl / דקות ובטמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס בקבינט בטמפרטורה מבוקרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את אותות כיפוף המוחלטים של כל שמונה cantilevers צריכים להיות במעקב באמצעות זמן סדרת multiplexed שיטת אלומה אופטית עם גלאי רגיש עמדה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את אותות כיפוף מכל ריכוז של תרופה, את כפיפות דיפרנציאלי כתוצאה מכך הם הפכו לstres דיפרנציאליותים בין הצדדים העליונים והתחתונים של שלוחה באמצעות המשוואה של Stoney. </li></ol>

<ol><li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li>
<li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li>
<li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+of+prostate-specific+antigen+%28PSA%29+using+microcantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).</li>
<li>Fritz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+biomolecular+recognition+into+nanomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating biomolecular recognition into nanomechanics.</a> Science. 288, 316-318 (2000).</li>
<li>Dwyer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-induced+bacterial+cell+death+exhibits+physiological+and+biochemical+hallmarks+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis.</a> Mol. Cell. 46, 561-572 (2012).</li>
<li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mistranslation+of+membrane+proteins+and+two-component+system+activation+trigger+antibiotic-mediated+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death.</a> Cell. 135, 679-690 (2008).</li>
<li>Kahne, D., Leimkuhler, C., Wei, L., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycopeptide+and+lipoglycopeptide+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Revs%22%5BJournal%5D)">Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics.</a> Chem. Revs. 105, 425-448 (2005).</li>
<li>Williams, D. H., Maguire, A. J., Tsuzuki, W., Westwell, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+origins+of+a+cooperative+binding+energy+of+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An analysis of the origins of a cooperative binding energy of dimerization.</a> Science. 280, 711-714 (1998).</li>
<li>Bugg, T. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular-basis+for+vancomycin+resistance+in+enterococcus+faecium+BM4147-+biosynthesis+of+a+depsipeptide+peptidoglycan+precursor+by+vancomycin+resistance+proteins+VanH+and+VanA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA.</a> Biochem. 30, 10408-10415 (1991).</li>
<li>Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crisis+in+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The crisis in antibiotic resistance.</a> Science. 257, 1064-1073 (1992).</li>
<li>Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+confer+antibacterial+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance.</a> Nature. 406, 775-781 (2000).</li>
<li>Xu, J., Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemistry+of+self-assembled+long-chain+alkanethiol+monolayers+on+gold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">The chemistry of self-assembled long-chain alkanethiol monolayers on gold.</a> J. Colloid Interface Sci. 176, 138-149 (1995).</li>
<li>Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+for+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers for biosensors.</a> Analyst. 122, 43-50 (1997).</li>
<li>Cho, Y. R., Entress, R. M., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cell-wall+analogues+of+vancomycin-resistant+enterococci+using+solid+phase+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cell-wall analogues of vancomycin-resistant enterococci using solid phase peptide synthesis.</a> Tetrahedron Lett. 38, 5229-5232 (1997).</li>
<li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+organic+monolayers+-+model+systems+for+studying+adsorption+of+proteins+at+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembled organic monolayers - model systems for studying adsorption of proteins at surfaces.</a> Science. 252, 1164-1167 (1991).</li>
<li>Rotschafer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+of+Vancomycin%3A+Observations+in+28+Patients+and+Dosage+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics of Vancomycin: Observations in 28 Patients and Dosage Recommendations.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 22, 391-394 (1982).</li>
<li>Cooper, M. A., Fiorini, M. T., Abell, C., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+vancomycin+group+antibiotics+to+D-alanine+and+D-lactate+presenting+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers.</a> Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).</li>
<li>Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+surface+plasmon+resonance+to+study+the+binding+of+vancomycin+and+its+dimer+to+self-assembled+monolayers+presenting+D-Ala-D-Ala%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+Proteins+as+Microarrays+for+High-Throughput+Function+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
<li>Baller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cantilever+array-based+artificial+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">A cantilever array-based artificial nose.</a> Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).</li>
<li>Burg, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weighing+of+biomolecules%2C+single+cells+and+single+nanoparticles+in+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid.</a> Nature. 446, 1066-1069 (2007).</li>
<li>Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+the+generation+of+surfaces+presenting+ligands+for+studies+of+binding+based+on+an+active+ester+as+a+common+reactive+intermediate%3A+A+surface+plasmon+resonance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study.</a> Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).</li>
<li>Nugaeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+cantilever+array+sensors+for+selective+fungal+immobilization+and+fast+growth+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).</li>
<li>Von Muhlen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomarker+sensing+in+undiluted+serum+with+suspended+microchannel+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators.</a> Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).</li>
<li>Godin, M., M,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+buoyant+mass+to+measure+the+growth+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Using buoyant mass to measure the growth of single cells.</a> Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).</li>
<li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gas+trace+of+hydrofluoric+acid+using+microcantilever%5BTitle%5D)+AND+%22Sens.+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever.</a> Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).</li>
<li>Porter, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solidstate+sensor+platform+for+the+detection+of+hydrogen+cyanide+gas%5BTitle%5D)+AND+%22Sens.+Actuator+B+Chem%22%5BJournal%5D)">A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas.</a> Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים מוצהר

הפרדיגמה נתחים המולקולריים ההכרה ניצבת בבסיס גדול של ביולוגיה ורפואה. בפרמקולוגיה, למשל המטרה היא להפריע למסלול פתולוגית על ידי מיקוד משתתף מרכזי בתהליך ביוכימי כגון transglycoslyation או transpeptidation שמזרז crosslinking של פפטידים קיר תא חיידק. תכנון התרופות מצטמצם ולכן להגדרת מולקולה מתאימה כדי למקד את אתר עגינה חיידקים ספציפי כדי לגרום להתאמה מושלמת. דוגמה קלאסי לחיקוי ההצלחה של גישה זו היא ונקומיצין (ואן), אשר מטרות דופן תא פפטידוגליקן, תכונה מבנית שימור של חיידק. בחיידק גראם חיובי המתהווה, מטריצת פפטידוגליקן מורכבת של פפטידים המסתיימים ברצף ליזין-D-אלנין-D-אלנין, קשורים באמצעות C55 8-10 מקשר שומנים כאן מכונה D-עלא. פפטידים אלו שנחשפו על מבשרי peptidoglycan הם יסוד להגנה מכאנית של התאים חיידקיים נגד כוחות סביבתיים קשים, וחשוב מכך, לא נמצא בתאים אנושיים, מה שהופך אותם למטרות אידיאליות לתרופות אנטיביוטיות. אן במיוחד נקשר לC-הסופית של פפטידים קיר תא החיידק יוצרים ואן-פפטיד חזק בינוני מורכב, כפי שמוצג באיור 1. אינטראקציה זו בין ואן ואת אבני פפטידים שנחשפו מעשיו של transpeptidases וtransglycosylases, אשר לזרז cross-linking של קירות תא 1, ביעילות לעצור אותם מcrosslinking ולכן nanomechanically מחליש את תא החיידק שהוביל למותה על ידי קרע 1,6, 7. הופעתה של vancomycin עמיד אנטרוקוקוס (VRE) היא בעיה בריאות 11 גוברת ובגלל עמידות החיידקים בEnterococci מתעוררת עקב השינוי העדין של לין אמיד<html> Kage להצמדת אסתר 8, שינוי מבני פשוט מטעה זה על פני השטח של החיידק מוחק קשר מימן אחד מאתר עגינה של ואן עם השינוי הבא של הכיס המחייב. חשוב לציין את התהליך הזה משנה את הווה אלאנין מסוף pentapeptide בונקומיצין רגיש אנטרוקוקוס (VSE) ליזין 10,12-D-אלנין-D-חומצת חלב, המכונה כאן D-Lac, מניב לירידה משמעותית בזיקה מחייבת ואן-D-Lac ידי שלושה סדרי הגודל ואן טיוח טיפולי יעילה נגד זיהומי Enterococcal 1, הצמיחה המדאיגה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה הוא נוהגים פיתוח גישות חדשניות אפוא להאיץ ולשחזר את הפעילות אנטיבקטריאלי של סוכנים אנטיבקטריאלי או גילוי של תרופות יותר חזקות נגד חיידקים עמידים multidrug זיהומים. = &quot;Jove_content&quot; כיתה&gt; הניסויים שלנו באמצעות cantilevers שעמד חופשי בהשראת המערכות כגון תאים אשר לרתום אנרגיה כימית לתנועה. היכולת של חיישני שלוחה לתרגם אנרגיה כימית לתנועה מכאנית גורמת להם בדיקות ייחודיות עם יתרונות רבים לניטור הפרעות מכאניות של מטרות קיר תא חיידק בזמן אמת. את חיישני שלוחה דורשים &#39;תגים&#39; לא כתב וביומולקולות מזוהות במהירות בתגובה בשלב יחידה. הם יכולים להקרין תרופות מרובות במקביל בסביבות פיסיולוגיות כגון פתרונות שנאגרו וכל סרום. בנוסף, הטכנולוגיה משתמשת בשלוחת התייחסות אתר למדידות דיפרנציאלי המאפשרים להם לזהות באופן ספציפי אינטראקציות סמים והיעד, מכוח הייצור שלהם באמצעות מסלולים מוליכים למחצה לעיבוד סטנדרטי, הם נוחים לייצור המוני ועמות להקרנת תפוקה גבוהה של אלפי של תרופות לשעה. בparticחיישן מערכים מרובים שלוחה ular הם כלים שימושיים לחקר עמידות לאנטיביוטיקה לונקומיצין - בגלל התנגדות לוונקומיצין היא בעיקרו בעיה מכאנית 1,6,7. התגובות שבין מודל יעד חיידקי דופן תא ואן בפתרון יכולות להיות מזוהות על ידי מעקב אחר השינויים במתח רלוונטי קליני הנגרמים מתגובות בין תרופתי מחייבות גבוהה מהיעד. המתח שנוצר משטח תגובות אשר באו לידי ביטוי באות כיפוף שלוחה מנותח על ידי חיישנים אופטי מאירים עם קרן לייזר. יתרה מזאת על ידי התאמת הציפוי פתוח של מולקולות מטרת משטח חיידקים על גבי חיישן שלוחה, קרוב למספר בלתי מוגבל של analytes (ואן), האינטראקציות ביוכימיות הספציפיות וביומכניקה של תא חיידק מודל קיר מטריצה ​​מנוטרת בזמן אמת. מלבד אירוע ההכרה המולקולרי, ישנם מספר גורמים שיכולים לגרום לחיישני שלוחה defבוחר בי, הכולל - וריאציות טמפרטורה, מחייב נוקבים או שינויים של מקדם שבירה של הפתרון. כדי להסביר את אותות ספציפיים, במדידות באתרו דיפרנציאלי מבוצעים בו הכיפוף של שניהם המדידה וcantilevers התייחסות מנוטרים באופן רציף כדי לנתח אינטראקציות ספציפיות. יתר על כן, ניתן לשפר את זיהוי של רגישויות חיישני שלוחה הנשען על פני השטח וגיאומטרית chemistries ידי כוונון צפיפות השטח עמ &#39;(עמ&#39; שבו מוגדר כיחס בין שטח הפנים שנכבש על ידי מולקולות לכידה לאזור המשטח העליון של כל שלוחה מכוסה על ידי האוכלוסייה של מולקולות, כפי שנקבע על ידי X-Ray Photoelectron ספקטרוסקופיה (XPS) 1. הנה פרטי פרוטוקול זה איך ונקומיצין או כל אנטיביוטיקה אחרת מחייב אנלוגים חיידקי דופן תא מבשר (mucopeptides) בריכוזים רלוונטיים קליני בפתרון שנאגרונסיוב דם ND יכול להיות מזוהה על ידי טכנולוגיית שלוחה תווית ללא שימוש. משטחי זהב טריים משמשים כי monolayers עצמית התאספו (Sams) נוטות ליצור שכבות יציבות בקלות על זהב נקי 13,14. טילים נ&quot;מ מורכב בדרך כלל ממולקולות קצרות עם מחצית תיאול המצורפת קוולנטית במשטח הזהב בזמן שיחידת לכידה הרצויה בצד השני מותרת להגיב בחופשיות עם המטרות אנליטי בתמיסה. Thiols ליצור מערכת גמישה במיוחד בהתחשב כי תרכובות תיאול רבות עם קבוצות קצה כימיות שונות זמינות באופן מסחרי או מסונתזים בקלות במעבדה. עם זאת, יש להקפיד על מנת להבטיח שמולקולות עם מחצית תיאול חייבת את קבוצות הקצה הנכונות, לדוגמה בחלבון או נטיה פפטיד, הקבוצה אמינית צריכה להתמודד פנימה לתגובה עם קבוצת carboxylic של מחצית תיאול קשורה על פני השטח כדי להתעורר. הנה, את thiols היה מצומדת ישירות עם mimetics tripeptide של חיידקי שומנים משניים בדופן תא acterial יעדים מסונתזת על ידי המתודולוגיה שלב מוצקה באמצעות זמין מסחרי מראש וואנג-D-עלא וואנג-D-Lac שרפים והסטנדרטי Fmoc הגנת קבוצת הכימיה 15. למרות שתיאור זה מתמקד לוונקומיצין, ברור שזה יכול להתארך לאנטיביוטיקה אחרות, ואכן מחקרים נוספים מוזמנים על ידי חוקרים מתחומים שונים ובמיוחד בביוכימיה, פרמקולוגיה, מדעי חומר ולאמץ פרוטוקול זה לניסויים שלהם בקלות.

<table><tbody><tr><td>Scentris Scentris</td><td></td><td>, Veeco Instruments, Inc</td><td>לא בייצור</td></tr><tr><td>שסתום</td><td></td> שישה כיוונים <td>MVP, המילטון, רינו, NV</td><td>מאפשר הזרקת ריכוז מרובה</td></tr><tr><td>מאייד</td><td></td><td>EB BOC Edwards Auto 500, בריטניה</td><td>קרן אלקטרונים עדיפה בגלל עיוות של שלוחים הנגרם מבעיות חימום תרמי</td></tr><tr><td>כלי</td><td></td> אחסון <td>Agar Scientific, בריטניה</td><td>שומר על סרטים מצופים זהב טריים</td></tr><tr><td>נימי</td><td></td> זכוכית <td>קינג דיוק זכוכית, קלרמונט, קליפורניה, ארה"ב</td><td>לפונקציונליזציה נימית של מערכי השלוחה</td></tr><tr><td>משאבת</td><td></td><td>דגם Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, ארה"ב</td><td>טוב לקצב זרימה מבוקר של דגימות נוזלים בתעלות מיקרופלואידיות</td></tr><tr><td>0.2-4.5 &mu; m מסננים</td><td>1511940001</td><td>Merck Millipore</td><td>לסינון מדגם</td></tr><tr><td>שבבי</td><td></td> שלוחה <td>המרכז לונדון לננוטכנולוגיה (LCN)</td> <td>נתרן פוספט</td></tr><tr><td>מונוביסיק</td> רגיש במיוחד <td>10049-21-5</td><td>סיגמא-אולדריץ', בריטניה</td><td>להכנת פתרונות חיץ</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>7558-79-4</td><td>סיגמא-אולדריץ', בריטניה</td><td>להכנת פתרונות חיץ</td></tr><tr><td>פוליסורבט 80 (PS80) או Tween 80</td><td>9005-65-6</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>משמש בתמיסות חיץ למניעת אינטראקציות לא ספציפיות על כלי זכוכית</td></tr><tr>DI<td>water</td><td></td><td>Millipore Co., Billerica, MA, ארה"ב</td><td>משמש לייצור</td></tr><tr><td>פתרונות סרום שלם</td><td>GEM-700-110-H</td><td>Sera Laboratories International Ltd, בריטניה</td><td>משמש במדידות המחקות תנאים פיזיולוגיים</td></tr><tr><td>Vancomycin (Van)</td> <td>1404-93-9</td><td>סיגמא-אולדריץ', בריטניה</td><td>שימוש בתרופה</td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>7664-93-9</td><td>סיגמא-אולדריץ', בריטניה</td><td>משמש להליכי ניקוי כלי זכוכית</td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>7722-84-1</td><td>סיגמא-אולדריץ', בריטניה</td><td>משמש להליכי ניקוי כלי זכוכית</td></tr><tr><td>D-Ala ו-D-Lac</td><td></td><td>המרכז לננוטכנולוגיה בלונדון (LCN)</td> <td>קולטני שטח מצופים על השלוחה לזיהוי אינטראקציות</td></tr> <tr>בין תרופות למטרה<td>LabView</td><td></td><td>National Instruments Co., אוסטין, טקסס, ארה"ב</td><td>תוכנה המשמשת לממשק אינסטרומנטלי כדי לאפשר מדידות מבוקרות</td></tr></tbody></table>

nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד ואיתור התנגדות אנטיבקטריאלי

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

חיישן שלוחה, הפועל כמתמר של תגובות בין מודל חיידקי דופן תא משותקת על פני השטח שלו ותרופות אנטיביוטיות בפתרון מטריצה, הראה פוטנציאל רב ביישומי חישה ביוכימיים ברגישות וסגוליות 1-5 חסר תקדים. את אינטראקציות סמים היעד ליצור מתח פני השטח, וגרם שלוחה להתכופף, והאות ניתן לנתח אופטי כאשר הוא מואר על ידי לייזר. השינוי במשטח לחץ נמדד בדייקנות בקנה מידה ננו מאפשר שיבושים בביומכניקה של קיר תא חיידק מודל המטרות כדי להיות במעקב בזמן אמת. למרות מציע יתרונות משמעותיים, חיישן מערכי שלוחה מרובים מעולם לא יושמו בכימות אינטראקציות מחייבות סמים היעד. כאן אנו מדווחים על השימוש במערכים מרובים שלוחה סיליקון מצופה עצמית התאספו monolayers alkanethiol מחקה חיידקי קיר מטריצת תא כמותית לסטהאינטראקציות מחייבות אנטיביוטיות dy. כדי להבין את ההשפעה של ונקומיצין על המכניקה של מבני קיר תא חיידק 1,6,7. אנחנו פיתחה מודל חדש שמציע 1 שלוחה כיפוף שיכולה להיות מתוארת על ידי שני גורמים בלתי תלויים; I) כלומר גורם כימי, אשר ניתן על ידי ספיחת האיזותרמה אנגמיור קלסית, שממנו אנו מחשבים את שיווי משקל תרמודינמי ניתוק הקבוע (K ד) ו ii) גורם גיאומטרי, למעשה מדד של כמה קולטנים פפטיד חיידקים מופצים על פני שלוחה. משטח ההפצה של קולטנים פפטיד (עמ &#39;) משמשת כדי לחקור את התלות של גיאומטריה וטעינה ליגנד. הוא הראה כי ערך סף של p ~ 10% הוא קריטי ליישומי חישה. שמתחתיו אין אות זיהוי תוך כיפוף מעל ערך זה, אות הכיפוף מגדילה כמעט ליניארי, חושפת כי לחץ הוא תוצר של חומר כימי מקומי מחייבים facטור וגורם גיאומטרי בשילוב של הקישוריות מכאנית של אזורים הגיבו ומספק פרדיגמה חדשה לעיצוב של סוכנים רבי עוצמה כדי להילחם בזיהומי superbug.

שינוי המתח נמדד באמצעות דיוק בקנה מידה ננו עם רגישות חסרת תקדים למחיקת H-אג&quot;ח בודד, מנוצל כדי לעקוב אחר השיבושים ביומכניקה קיר תא חיידק מודל בזמן אמת (איורים 2 א, ד). המגבלה של רגישות גילוי סמים ולאן נחקרה על ידי דילול סדרה ריכוזיה בצעדים מ1,000 מיקרומטר ≤ 10 ננומטר, חושף 10 ננומטר (~ 15 ng / ml) כריכוז הנמוך ביותר לזיהוי והוליד ממוצע של ~ -9 ± 2 ננומטר כמו כיפוף אותות דיפרנציאליים (איור 2 ג). היכולת לזהות אנטיביוטיקה תחת הסביבה פיזיולוגית הייתה עוד יותר נחקר בסרום בטווח ריכוז רלוונטי קליני של 3-27 מיקרומטר 17. על הזריקה של 7 מיקרומטר ואן בסרום (90% נסיוב עגל העוברי בתוספת 10% pH חיץ פוספט נתרן 7.4) על פני כל cantilevers בתנאים זהים, את אות ההפרש עבורDala בסרום היה 105 ± 4 ננומטר ואילו עבור cantilevers מצופה DLac, לא נצפה כיפוף (איור 3). את אותות כיפוף הניכרים שנצפו למצופה dala (vancomycin רגישה) cantilevers נגרמים על ידי יחסי גומלין מחייבים תרופה היעד החזקים. עם זאת למצופה DLac (vancomycin עמיד) cantilevers, הנוכחות של דחיית מצב קרקע של הזוג הבודד חמצן ואת קשר NH המופחת בכיס 10,12 vancomycin המחייבת תורם להיחלשות של אינטראקציות מחייבות סמים היעד שהתוצאה פחות או כיפוף לא שלוחה, במיוחד לריכוזים נמוכים יותר vancomycin (איור 3). עם זאת, לריכוז גבוה וונקומיצין, אנו צופים אותות כיפוף מדידים לDLac. יתר על כן, עיצוב הניסיון שלנו הוא חשוב להתייחסות באתר שבו כל cantilevers מצופה שניהם dala וDLac חשוף בו זמנית לאותו אנליטי בזמן אמת. כדי להבין את תפקידו המדויק של כימיה וגיאומטריה, תכננו 1 מודל המתאר את הקשר בין אינטראקציות ממס משטח מכניקה. זה מייצר את מתח פני השטח: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> עבור p&gt; מחשב ואפס אחר (1) כהונתו הראשונה במשוואה (1) היא אנגמיור ספיחת Isotherm, והיווה אירועים מחייבים סמים היעד והקדנציה השנייה היא צורת שלטון החוק המתארת ​​את ההשלכות מכאניות בקנה מידה גדולה של היווצרות רשת לחוץ. הקבועה מתאים למתח פני השטח מרבי כאשר כל אתרי הקישור הנגישים הם כבושים וK D הוא חסרונות דיסוציאציה שיווי המשקל על פני השטחTANT על שלוחה. הניתוח כפי שמוצג באיור 4 הוא התוצאה של ההתאמה הגלובלית של משוואה (1) על גבי אותות מתח דיפרנציאלי מדודים חושפים; ~ 29.7 ± 1.0 או 14.1 ± 3.0 Mn / מ &#39;ו-K ד ~ 1.0 ± 0.3 או 800 ± 310 מיקרומטר לפפטידים DLac D-עלא או, שבו מקביל מידה של משטח לחץ, כאשר כל אתרי הקישור הנגישים תפוסים. הרגישות המוגברת של שלוחה הייתה מכוונת על ידי שיטתי משתנה עמ צפיפויות פפטיד תוך ניטור נתוני הלחץ כפונקציה של p קבוע ואילו ריכוזי אנטיביוטיקה בגיל 10, 100, ו -250 מיקרומטר, בהתאמה (איור 5). התהליך חזר על עצמו עם מצבי לחץ כפונקציה של ריכוז ואן בזמן קבוע את צפיפויות פפטיד בעמ &#39;~ 100%. &lt;IMG alt = &quot;איור 1&quot; עבור: תוכן-width = src &quot;5IN&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1. גילוי שלוחה של אינטראקציות מחייבות משטח אנטיביוטי. ייצוג סכמטי) של מערך שלוחה חיישן והמצב שבו אינטראקציות סמים היעד מזוהות nanomechanically. ב) מחייבת אינטראקציה כימית בין מולקולת תרופה (ואן) והאנלוגי mucopeptide החיידקים (D-עלא או D-Lac). ג) המנגנון שבו מוטציה חיידקים רגישים Vancomycin (VSE) רוכש עמידות לוונקומיצין ידי מחיקת H-אג&quot;ח בודד בכיס המחייב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; איור 2. מעקב אחר השיבושים ביומכניקה קיר תא חיידק המודל בזמן אמת. א) אותות כיפוף מוחלטים של cantilevers מצופה PEG בחיץ פוספט וונקומיצין 250 מיקרומטר D-עלא, D-Lac ו. את אותות התייחסות PEG דיפרנציאלי מוצגים בקווים שחורים. ב) אותות כיפוף הפרש של cantilevers מצופי D-Lac בחיץ פוספט וונקומיצין 250 מיקרומטר. ג) סטיית שלוחה ההפרש של אות תלויה במינון כפונקציה של זמן D-עלא ו בנוכחות ריכוזי vancomycin בבסדר הגודל של 10 ננומטר (קו צהוב), 100 ננומטר (קו אדום) ו -1,000 ננומטר (קו אדום כהה) בהתאמה. ד) אותות סטיית שלוחה ההפרש לשלושה חיישני שלוחה מצופי D-עלא כ פונקציה של זמן בנוכחות 10vancomycin ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> איור 3. מעקב של השיבושים ביומכניקה מודל חיידקי דופן התא בזמן אמת לcantilevers מצופי D-Lac בנוכחות vancomycin מיקרומטר 7 בסרום עוברי עגל D-עלא ו. <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> איור 4. חוקר את nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד. מגרש מראה את תגובת לחץ משטח ההפרש הנמדדת עבור D-עלא (עיגולים שחורים) וcantilevers מצופה כפונקציה של ונקומיצין D-Lac (עיגולים אדומים)ריכוז בתמיסה [אן]. הנתונים שתוארו על ידי משוואה (1) (קווים מוצקים). 1 <img alt="איור 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> איור 5. אופטימיזציה של רגישות זיהוי nanomechanical של קולטן ליגנד אינטראקציות על ידי חוקר את התלות של העמסת קולט וגיאומטריה באמצעות monolayers מעורבת. תגובות דחק משטח דיפרנציאלי המדודות של חיישני שלוחה כפונקציה של D-עלא פני השטח כיסוי, עמ &#39;בנוכחות ריכוזים קבועים בvancomycin פתרון ב10 מיקרומטר (קו שחור), 100 מיקרומטר (קו אדום), וכ -250 מיקרומטר (קו ירוק).

רכשה עמידות לאנטיביוטיקה היא בעיה בריאות ציבורית גדולה והיא מדורגת כיום על ידי ארגון הבריאות העולמי כאחת הסכנות הגדולות ביותר לחיי אדם. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית שלוחה לכמת התנגדות אנטיבקטריאלי, קריטית לגילוי של סוכני רומן ורבי עוצמה נגד multidrug חיידקים עמידים.

Nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד ואיתור התנגדות אנטיבקטריאלי

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את השינויים בתכונות המכניות של תאי חיידקים המשמשים כמודלים למטרות, הנגרמים כתוצאה מאינטראקציות של קישור תרופה למטרה, ולכמת עמידות אנטיבקטריאלית. דבר זה מושג תחילה על ידי השכבת סרט זהב בעובי של 20 nanometers על צד אחד של מערך חיישני הקנטילבר (cantilever) שעברו ניקוי מוקדם. השלב השני הוא הרכבה עצמית של מטרות שטח מתאימות, המדמות פנוטיפים של חיידקים הרגישים לתרופות וחיידקים העמידים לתרופות, על שישה מחיישני הקנטילבר, בעוד ששני חיישני הקנטילבר הנותרים מורכבים עם מטרות מודל בקטריאליות לא רלוונטיות כדי לשמש כביקורת למדידה.בשלב הבא, מערכי חיישני הקנטילבר (cantilever) מוכנסים לתא זרימה נוזלית. השלב הסופי הוא הכנת תמיסות תרופות בטווחים של ריכוזים רלוונטיים קלינית והזרקה רצפית של כל ריכוז תרופה על מערכי חיישני הקנטילבר. לבסוף, נעשה שימוש באור לייזר הממוקד בקצוות החופשיים של מערך חיישני הקנטילבר כדי להדגים את סטיות הקנטילבר הנגרמות משינויים במתח הפני, הנובעים מאינטראקציות של קישור בין התרופה למטרה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון surface plasmon resonance ו-quartz crystal microbalance, הוא שהיא מזהה את המתיחה של הפני השטח הנוצרת כתוצאה מאינטראקציות של קישור בין תרופה למטרה, ובכך מודדת באופן ישיר כוחות ננו-מכניים ספציפיים הנגרמים על ידי קישור של כל תרופה למטרות שעל פני השטח. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הפארמקולוגיה, כגון מהירות, יעילות ודיוק של מינון. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בנושא יתקשו בביצוע בשל תהליך יישור הדגימות המתיש.עם זאת, פיתחנו לאחרונה מנגנון קריאה חדש, שאינו דורש יישור ראשוני של הדגימה, ובעתיד השימוש בשיטה זו יהיה קל וידידותי יותר למשתמש. כדי להתחיל, השתמשו בפינצטת טפלון כדי להטביל שבב קנטילבר (cantilever chip) לתוך תמיסת פאראמה (parama) שהוכנה טרי למשך 20 דקות. הקנטילברים המשמשים בניסוי זה הם באורך 500 microns, ברוחב 100 microns ובעובי 0.9 microns.לאחר 20 דקות, הוצא את הזרוע (cantilever) ושטוף אותה ביסודיות במים דה-יוניים. בדוק את השבב המנוקה באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לחפש זיהומים. החזר שבבים שעדיין נותר עליהם אבק או לכלוך לתוך תמיסת piranha טרייה למשך 20 דקות נוספות.לאחר ניקוי יסודי במים דה-יוניים, שטפו את השבב באתנול טהור וייבשו אותו על פלטה חמה בטמפרטורה של 75 °C למשך כ-30 שניות כדי להסיר כל עקבות של מים. לאחר מכן, בצעו בדיקה חוזרת באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר את ניקיונם. העבירו את שבב הקנטילבר המנוקה לתא אידוי המכיל מקורות של טיטניום וזהב.שאבו את המערכת עד להשגת לחץ ואקום של 1×10⁻⁷ millibar. לאחר הגעת הוואקום הנדרש, ציפו צד אחד של כל מערך קנטילברים בשכבה בעובי של 2 nm של טיטניום. לאחר מכן, הגדירו את המערכת להשקיע שכבת זהב בעובי של 20 nm מעל הטיטניום, המשמש כשכבת הידבקות.אששו את עוביהן של כל אחת מהשכבות באמצעות מד קריסטל קוורץ הממוקם ישירות מעל למקור המטרה. ברגע שהושג העובי הנכון, השאירו את שבבי הקנטילבר המצופים בזהב בתא למשך שעה עד שעתיים כדי שיתקררו תחת ואקום לפני פתיחת התא. לאחר מכן, העבירו את שבב חיישן הקנטילבר לכלי אחסון בוואקום מלא בארגון כדי למנוע כל סוג של זיהום.ניתן לאחסן את שבבי הקנטילבר (cantilever chips) כאן לזמן בלתי מוגבל. עם זאת, אם אין כלי אחסון זמין, יש להשתמש בשבב מיד לפני הניסוי. סדרו צינורות מיקרו-קפילריים בתעלות על גבי במת פונקציונליזציה בהתאם למרווח הקנטילברים של 250 microns.לאחר מכן, יישרו אותם באמצעות פרוסת זכוכית והדקו אותם למקומם כדי למנוע תזוזה במהלך הניסוי. בשלב הבא, הכינו תמיסות מילימולריות של רצפטורים שטח פנים חומצתיים המורכבים ממטרות דופן תאי בקטריות רגישות לתרופות ועמידות לתרופות, באמצעות אתנול טהור. לאחר מכן, הכניסו קנטילבר נפרד לתוך כל אחת מהצינוריות המיקרו-קפילריות.יש לוודא כי תמיסות מולקולות הלכידה של הפני השטח מוגבלות לכל חיישן קנטילבר בנפרד כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, הקצו באופן אקראי תערובת של מולקולות לכידה אלו לצינורות המיקרו-קפילריים, והזריקו 8 µL של תמיסות המטרה של פני השטח לצינורות שהוקצו להן. אפשרו לקנטילברים להתרגול בתמיסות למשך 20 דקות.במהלך זמן זה, הקנטילברים בעטיפת הזהב שהוכנו זה עתה יהפכו לחיישנים פעילים כימית באמצעות הרכבה עצמית של מטרות פפטיד מוקו-בקטריאלי לשכבה אחת על פני השטחים בעטיפת הזהב שלהם. התחילו בהמסה של מלחים של נתרן פוספט חד-ובסמי-בסיסי בריכוז 0.1 מולרי במים אולטרה-טהורים, ערבבו כדי להגיע לערך pH של 7.4, והשתמשו במסנני 0.2 מיקרון כדי לסנן את התמיסה. לאחר מכן, הוסיפו 0.002% של polysorbate 80 לתמיסה המבופרת.פעולה זו תמזער השפעות של אגרגציה הנגרמות מאינטראקציות לא ספציפיות של מולקולות התרופה עם כלי הזכוכית. לאחר מכן, דללו את ה-vancomycin וה-orin עם תמיסות חוצץ (buffer) טריות לריכוז הרצוי, בין 100 pico molar ל-250 micromolar, מה שיאפשר את חישוב ה-KD. בצעו ערבוב במערבל (vortex) וסוניקציה לדגימות כדי להבטיח המסה מלאה של התרופה בחוצץ ובסרום, וזאת כדי לקבוע אם פעולת התרופה משתנה על ידי חלבוני סרום. חזרו על הליך זה עם אותם ריכוזי תרופה, אך הפעם הוסיפו אותם לסרום מלא.בנוסף, ערבבו את דגימות הסרום במערבל Vortex למשך 20 דקות בסך הכל במהלך הערבוב כדי להבטיח מסיסות מלאה של התרופות. לבסוף, שטפו את התמיסות עם ארגון (Argonne) כדי להתחיל בגילוי של מאמץ פני (surface stress) לאורך הקנטלבליים. ראשית, העמיסו את שמונת חיישני הקנטבלב המפונקציונליים שעל השבב לתוך תא תזרים נוזלי.בשלב הבא, יישרו את נקודת הלייזר אל הקצה החופשי של כל חיישן. אששו את היישור על ידי חימום תא הנוזל במעלה אחת של °C. כל שמונה מערכי החיישנים בעלי הקניטלבוריים המצופים בזהב יעברו כיפוף דחיסה כלפי מטה עקב האפקט הבימטאלי הנגרם מההבדלים בשיעורי ההתרחבות של הסיליקון והזהב.לאחר חימום למשך כ-10 דקות, חשב את שונות הכפיפה באותות הכפיפה המקסימליים בין חיישני הקנטילבר הבודדים. אם סטיית התקן היחסית של האותות היא 5% או פחות, קבל את היישור כראוי. אחרת, חזור על התהליך לאחר היישור.המתינו 10 דקות עד שהקנטילברים יתקררו חזרה לטמפרטורת החדר כדי להבטיח שיווי המשקל. לאחר מכן, מדדו את תדרי התהודה של כל שמונת הקנטילברים וחשבו את קבועי הקפיץ שלהם. אם השונות של קבוע הקפיץ בין כל חיישן קנטילבר היא 1% או פחות, קבלו את הכיול.לחלופין, החליפו את מערכת הנוזלים המקשרת לחיישן שבב הקנטילבר, כגון משאבת המזרק המוצגת כאן, אל השבב המקובל באמצעות שסתום שיש-דרכי. הגדירו את קצב הזרימה של המערכת כך שתפעל בקצב קבוע שבין 30 ל-180 µL לדקה, והציבו את המערכת כולה בארון בבקרה תרמית בטמפרטורה של 25 °C. לאחר מכן, התחילו להזריק תמיסת בופר או סרום בלבד, ללא תרופה, כדי לקבל מדידת בסיס (baseline) לשלילה למשך חמש עד 30 דקות.הפעל את תוכנת התצוגה המעבדתית האוטומטית כדי לרכוש את נתוני השקיעה מכל אחד מהקנטילברים בו-זמנית. נטר את אותי הכפיפה המוחלטים של שמונת הקנטילברים באמצעות שיטת קרן אופטית עם ריבוב זמן סדרתי עם גלאי בודד הרגיש למיקום. לאחר רכישת קו הבסיס, הזרם תמיסת תרופה למשך 30 עד 60 דקות בעקבות דגימת הבדיקה.שטיפה של HCl בריכוז 10 millimolar מוזרקת למשך 10 דקות עד שעה אחת כדי להפריד קומפלקסים קשורי תרופה. באמצעות מערכת זו ניתן להשיג דיוק ברמה הננומטרית ורגישות חסרת תקדים להסרה של קשר מימן בודד. שינוי בקצה של שרשרת פפטידית מ-D alanine ל-D lactate גורם להפחתה משמעותית של קישור הוואנקומייצין, מה ש renders חיידקים עם רצף DLAC עמידים לטיפול זה. כאשר נבחנו ריכוזים משתנים של התרופה על שרשראות פפטידים המסתיימות ב-D alanine, הוכח כי לוואנקומייצין יש השפעה תלוית מינון, כאשר כ-10 nanomolar הוא הריכוז הנמוך ביותר שניתן לזיהוי.יכולתו של מערכת זו לזהות אנטיביוטיקה בסביבה פיזיולוגית נחקרה בהמשך בסרום בריכוז רלוונטי קלינית של שבעה micromolar. בעוד שהקנילבירים המצופים ב-D alanine עדיין הראו כיפוף ניכר בתנאים אלה, אלו המצופים ב-DLAC לא הראו זאת. באמצעות נקודות נתונים של מספר ריכוזי תרופה, ניתן ליצור מודלים המתארים את אירועי הקישור של התרופה למטרה.קווי ההתאמה המוצגים כאן משלבים את ספיגת ה-langur, איזותרמה, וביטוי המתאר את ההשלכות המכניות בקנה מידה גדול של היווצרות רשת מאומצת. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה תוך דקות כדי לאשר את היעילות והדיוק של מינון התרופה, וכן לזהות כל סימן להתנגדות בקטריאלית, במידה שהיא בוצעה כהלכה.

nanomechanics-drug-target-interactions-antibacterial-resistance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים בדיקת ביוסנסור מוליך כדי לחקור את האינטראקציה של נוגדן עם אנטיגן מטרה משותק על שבב מתמר. הביוסנסור מהונדס כך שיהיה לו חלבון כימרי דו-תפקודי – אנזים β-לקטמאז עם אתר קטליטי פונקציונלי המאוחה לננון לצורך קשירה לאנטיגן המטרה המשותק. עם הקשירה, ההידרוליזה הקטליטית של מצע אנטיביוטי על ידי האנזים β-לקטמאז מייצרת אות חשמלי - המאשר את האינטראקציה בין אנטיגן לנוגדן.

בדיקת ביוסנסור מוליך מבוססת β-לקטמאז לאינטראקציות חלבון-חלבון

biosensors phage ממוסס וחרוזים נוגדנים מסוגלים להבחין בין Methicillin עמיד (MRSA) וחיידקים סטפילוקוקוס רגישים. לפאגים היו משותקים על ידי שיטת אנגמיור-Blodgett על גבי משטח של חיישן microbalance גביש קוורץ ועבדו כבדיקות סטפילוקוקוס מגוון רחבות. חרוזים נוגדנים לזהות MRSA.

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

פיתחנו פלטפורמה מיקרופלואידית לבדיקות רגישות לאנטיביוטיקה במהירות. נוזל מועבר במהירויות גבוהות על חיידקים משותקים בתחתית ערוץ מיקרופלואידי. בנוכחות מתח ואנטיביוטיקה, זנים רגישים של חיידקים מתים במהירות. עם זאת, חיידקים עמידים יכולים לשרוד את התנאים מלחיצים אלה.

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

שילובים תרופתיים סינרגטי הם וממושכת לזהות את הנתונים באופן אמפירי. כאן נתאר שיטת זיהוי ואימות של מולקולות קטנות סינרגטי.

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

ב פרוטוקול זה, נתאר כיצד להפוך Loewe סמים additivity אינטראקציה מדידות של pairwise ואת שילובים תרופתיים-כיוונית.

שיטת באלכסון כדי למדוד סינרגיה בין כל מספר של סמים

פלואור שתייגת אנטיביוטיקה הם כלים רבי-עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד היבטים מרובים של עמידות מיקרוביאלית. מאמר זה מתאר את הכנת אנטיביוטיקה מתויג fluorescently היישום שלהם כדי ללמוד עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. רגשים יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים של עמידות חיידקים (למשל, אפלוקס) על ידי ספקטרופוטומטר, זרימה cy try, ו מיקרוסקופ.

ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרופות בחלבונים.

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור את כל השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד. שיטה זו מבוססת על הבדיקה הסטנדרטית של 96 באר צלחת מיקרו דילול וחישוב של ריכוזים מעכבי שבר (FICs) כדי להעריך את התוצאות.

לוח בדיקה מרובע: שינוי לוח השחמט התלת מימדי לחקר שילובי סמים

פרוטוקול זה מציג בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה (AST) תוך 2.5 שעות על ידי הדמיית פיזור ראמן מגורה בתא יחיד של חילוף החומרים של D2O. שיטה זו חלה על חיידקים בשתן או בסביבת דם שלמה, שהיא טרנספורמטיבית עבור AST פנוטיפי מהיר של תא יחיד במרפאה.

בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה על ידי הדמיה מגורה של פיזור ראמאן של שילוב דאוטריום בחיידק יחיד

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

למדו כיצד לכמת התנגדות אנטיביוטית באמצעות חיישני קנטילבר לניתוח מכאני של אינטראקציות סמים-יעד בחיידקים. שיטה זו מאפשרת גילוי סוכנים אנטיבקטריאליים חדשים ביעילות.

Nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד ואיתור התנגדות אנטיבקטריאלי

גלה סרטונים נוספים