Name: הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: למדו הדמיית תא חי של תחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים בתרביות נוירונים ראשוניים באמצעות חלבוני פלואורסצנט. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת חלקיקים ויראליים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LWE ור.ק. נתמכים על ידי המוסד האמריקאי הלאומי לבריאות מענקי R37 NS033506-16 ו R01 NS060699-03. MPT נתמכה על ידי מלגת אגודת אמריקנית לסרטן דוקטורים מחקר (PF-10-057-01-MPC). העצות והידע של ד&quot;ר מתיו ויימן ד&quot;ר אורן Kobiler סייעו בעיצוב תצורת המיקרוסקופ ושיטות הדמיה תא חיות. אנחנו גם להרחיב בזכות בארלו ניל ובריאן קין ט של ניקון מכשירים לסיוע הטכני שלהם ברכישה, ההתקנה והביצוע של המיקרוסקופ.

סעיף 1 - תנאי בקרה סביבתיים למיקרוסקופ פלואורסצנטי Live-תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 דקות לפני כל ניסוי הדמיה להתחבר ולהתחיל לחמם את המיקרוסקופ השלב העליון החממה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ, מקורות אור מועברים וepifluorescent, ופקדי חומרה אוטומטיים. פתח את תוכנת בקרת מיקרוסקופ, אלמנטי ש&quot;ח, כדי להתחבר למיקרוסקופ ולהתחיל קירור המצלמה EM-CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף עדשות חמה יותר למטרה המתאימה (או 60x או טבילת שמן 100X). הערה: בחר עדשה אובייקטיבית המבוססת על סוג הניסוי. התערבות ההפרש לעומת זאת 100X (DIC) היא הטובה ביותר עבור מעקב של מכלולי virion הובלת אנטרוגרדית תוך מטרת שלב 60x מתאימה כדי להמחיש התפשטות אנטרוגדית. ההגדלה נמוכה, טבילה מטרות שאינן נפט אינן דורשות עדשה חמה יותר כמו שהם לא ליצור קשר ישיר עם המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף שלב חממה עליונה על הבמה הממונעת של מייל<html> croscope. להבטיח את התותב המתאים שיקיים המדגם נמצא במקום. צרף את קו אוויר humidified משליטת החממה ליציאת הקלט על הבמה העליונה החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל חממה ועדשת פקדים חמים יותר ולהתאים את הגדרות לתנאי טמפרטורה מאומתים עבר ספציפיים למטרה והדוגמא שצלמה (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שסתום הבקרה על 5% CO 2/95% טנק אטמוספרי כדי לספק אוויר CO 2 בתוספת לשלב חממה עליונה. קצב הזרימה צריך להיות בין 60 ל 80 מ&quot;ל של גז לדקה. שיעורים מהר יותר יגרמו להתייבשות מדגם נרחבת למרות קאמרי humidifying. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שמן עדשה לעדשה אובייקטיבית ולמקם את התרבות שיהיה צילמו לשלב העליון החממה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר איזון של טמפרטורה בתרבות למינימום של 10 דקות. שעה אחת עדיפה, במיוחד עבור ההדמיה הלילה המתוארת בסעיף 3. </li></ol>ve_title &quot;&gt; סעיף 2 - הדמיה בזמן אמת של פרוטוקול התחבורה virion אנטרוגרדית אירועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שש עד שמונה שעות לפני ההדמיה, להדביק צלחת 35 מ&quot;מ coverslip התחתון של נוירונים SCG בוגרים, ניתק עם 1 x 10 6 יחידות פלאק להרכיב של הנגיף של עניין (ראה טבלת מס &#39;1 לוירוסים לדוגמה), תוך שימוש בשיטה המתוארת בטיילור ואחרים אל. 2012a 11. אם בדיקת וירוס אחד או יותר, חיסונים קיזוז על ידי 30-60 דקות, כדי לאפשר הדמיה של דגימות רציפות בזיהום הודעה פעמים דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס לתוך צלחת שלב העליונה חממה למינימום של 10 דקות לפני הפעלת כל ניסוי. בעוד טמפרטורת equilibrates, מישור המוקד עובר ויהיה להשפיע לרעה על כל ניסויי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אור מועבר והעינית של המיקרוסקופ, למצוא גוף תא עצבי שיש לו סיומת axonal בבירור מבודדת. לחלופין, השתמש בתאורה המתאימה לקרינה למצוא תא להביע detecכמויות טבלה של חלבוני ניאון. חשוב להגביל את החשיפה של מדגם לתאורת פלורסנט, בשלב זה והשלבים הבאים, בגלל נזק לתאים מושרה אור והלבנה של חלבוני ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליש תאורת הקרינה כדי להפחית את עוצמת אור עירור לתאים שנחשפים. לעסוק אור הממתן צפיפות ניטרלי (ND) במסנני הקרינה נתיב אור התאורה. עבור סרטים שנמשכים יותר מ 1 דקות, מינימום של ND4 חייבים לשמש כדי למנוע צילום הלבנת של חלבוני ניאון ותמונות נזק של אקסונים נרחבים. מבנים מאוד ניאון בדרך כלל יכולים להיות דמיינו עם מסנן ND8 במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת מיקרוסקופ (איור 2 ומשלימת הסרט 1A), להדליק את האור, הדרך למצלמה EM-CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע זמני הדמיה אופטימליים ותנאים לכל ערוץ ניאון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום חלון תמונה חי באמצעות כפתור &quot;הפעל&quot;. &lt;/ P&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הגדרות חשיפת המצלמה האופטימליות עבור כל חלבון פלואורסצנטי. לא תעלה על 300 אלפית שנייה לכל ערוץ כסטיות motional של מבני virion זזו מהר יתרחש. לנצל את רווח EM של המצלמה להגדרה של 300 (יצרן הציע רווח מרבי), כדי לצמצם את זמן חשיפה ולשפר את זיהוי של אותות עמומים. זמני חשיפה נכונים צריכים לייצר תמונה עם רקע בעוצמה נמוכה ואותות ספציפיים גבוהים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגדרת חשיפות ומציאת אזור מוגדר היטב של האקסון, יש להגדיר את התוכנה כדי לבצע רכישת תמונה אוטומטית. עצור את חלון ההדמיה לחיות כדי למנוע הלבנת מדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת אלמנטי ש&quot;ח, בחר 6 ד - הגדר / הפעלת יישום ניסוי מירידת &quot;יישומים&quot; למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון רכישת ND, לחץ על כרטיסיית הזמן שתקבע את תדירות רכישה של תמונה. הגדר את המרווח ל&quot; אין עיכוב &quot;ואת משך הזמן עד 5 דקות. הלאחר מכן תוכנת דואר תרכוש מסגרות תמונה בתדירות הגבוהה ביותר האפשרית עבור משך זמן של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;למבדה&quot;, המאפשרת בחירה של תצורות החומרה שנקבעו מראש המשמשות לרכישת תמונת ניאון מרובה. לחץ על התיבה הראשונה ולאחר מכן בירידה למטה בתפריט כדי לבחור תצורת חומרה מתאימה. חזור על פעולה עבור כל חלבוני הניאון להיות צלמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח את הכרטיסיות לפוזיציות &quot;XY&quot;, &quot;Z-סדרה&quot; ו &quot;תמונה גדולה&quot; הן דה שנבחרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעל לכרטיסיות, בחר בתיבה המסומנת &quot;שמור לקובץ&quot; כדי לשמור את התמונות באופן אוטומטי לדיסק הקשיח במהלך רכישה. הגדר את המיקום ואת שם קובץ של קובץ פלט הניסוי. כניסויים רציפים מבוצעים, התוכנה תוסיף את מספר סידורי בסוף שם הקובץ המיועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הכרטיסיות שנבחרו. ליזום את הניסוי על ידי לחיצה על הכפתור &quot;Run-עכשיו&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את קצב רכישת התמונה דרך הגדרות חשיפה ומתאר לעצמיגודל דואר. שימוש באזור קטן של שטח תמונה, מסוגל לעתים קרובות להאיץ את שיעורי רכישת מסגרת. הגדר את האזור של עניין באמצעות כלי ההחזר על ההשקעה בש&quot;ח-אלמנטים, בחירת אזור שבין 25% ל 50% משטח התמונה הכולל. לחלופין, זמני חשיפה קצרים יותר יגדילו את שיעורי רכישת מסגרת, אבל מקטין את איכות האות (ראה דיון). </li></ol></li></ol> סעיף 3 - זמן לשגות הדמיה של אירועי לילה מורחים אנטרוגדית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבע שעות לפני הדמיה, להדביק תרבות עצבית ממודרת נבנתה על 35 מ&quot;מ μ-תבשיל. לחסן גופי תאים עצביים עם 1 x 10 6 יחידות פלאק להרכיב של הנגיף של עניין (ראה טבלת מס &#39;1 לוירוסים לדוגמה), תוך שימוש בשיטה המתוארת בטיילור et al. 2012b 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות צלחת התרבות לשלב העליונה החממה. ודא את המיקום של המטרה מוגדר לצד המנה. לאט לאט מביא את המטרה אל מוקד, ensuring האובייקטיבי לא לדחוף לתוך המדגם. ברגע ששדה המיקוד זוהה, לנוע באיטיות במטרה למרכז הצלחת, ליד המחסום הפנימי demarking הצד הפנימי של תא האקסון. במהלך תנועה, להבטיח את עומק המיקוד נשמר ולהימנע מלדחוף לתוך המדגם. סטייה של משטח הפלסטיק על ידי המטרה תגרום ניזק לאקסונים והפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כ -2 מ&quot;ל של חם (~ 37 מעלות צלזיוס) בופר פוספט למנת התרבות חיצונית של טבעת הטפלון. זה מקיף את התרבות העצבית עם טבעת של PBS כדי למזער את ההתייבשות לדוגמה ומספקת בידוד תרמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר טמפרטורה לאזן עבור מינימום של שעה 1 לפני ייזום רכישת תמונה אוטומטית (3.8). שלבים 3.5 עד 3.7 יכולים להיות מוגדרים בתקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביל את עוצמת התאורה לרמה הנמוכה ביותר האפשרית על ידי העוסק כל מסנני הצפיפות ניטראליים. זה יאפשר רכישת תמונה תכופה oveפרקי זמן ארוכים ללא תמונה r-נזק מוגזם. הפחתת תאורה תגרום לאות נמוכה, הדורשת חשיפה ארוכה יותר (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהגדרות חשיפה היסטורי או לפני ניסיוני ההגדרה ליצור מנה מקבילה של תאי האפיתל נגועים להביע את חלבוני ניאון היעד להקים הגדרות חשיפה כמתואר בסעיף 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגדרת חשיפות לאפיקים הדרושים, זה זמן להגדיר את התוכנה לרכישת תמונה אוטומטית. עצור את חלון ההדמיה לחיות להגביל מדגם הלבנת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת אלמנטים (איור 2 וסרט משלים 2), בחר 6 ד - הגדר / הפעלת יישום ניסוי מהירידה &quot;יישומים&quot; למטה בתפריט כדי להעלות את חלון רכישת ND. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון רכישת ND, לחץ על כרטיסיית השעה. הגדר את המרווח ל&quot; 5 דקות &quot;. הגדר את משך הזמן עד 20 שעות. שדה הלולאות יחושב באופן אוטומטי למספר חזרות prograמ &#39;יבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;למבדה&quot;. לחץ על התיבה הראשונה ולאחר מכן בירידה למטה בתפריט בחר בתצורה המתאימה למבדה בניגוד שלב. חזור לעמדות שלאחר מכן, בחירת התצורות המתאימות לכל חלבון פלואורסצנטי להיות צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;התמונה גדולה&quot;, הקובעת את הפרמטרים של מספר רב של תמונות כדי להיות משולבים לתוך שדה אחד גדול של נוף. אזור טוב בגודל מורכב 5 תמונות x 2 באמצעות חפיפה תפרים 7%. זה יאפשר למספר המרבי של תאים לכל עמדה להיות צילמו מבלי להשפיע על התדר של רכישת תמונה. כמו כן, בטל את סימון התיבה עבור &quot;תריס פעיל סגור במהלך תנועת הבמה&quot;. אפשרות זו משפרת את המהירות של רכישה על ידי לא סוגר תריסים בין תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;XY פוזיציות&quot;, כדי לזהות מספר רב של עמדות שיהיה צלמו ברצף במקביל במהלך הסרט בין לילה. בחר עמדות המגדירות את פו המרכזint עבור כל אזור בתמונה גדול. בחר 6-8 עמדות תמונה במדגם. שטח תמונה טוב יהיה אשכולות קטנים של תאים בפרד קרוב לאקסונים מוגדרים בבירור. תאים לא צריכים להיות נערם זו על גבי זו bundling האחרת והאקסון צריך להיות ממוזערים. נקודת המיקוד היא גרעין התא. מקם את המטרה כך שמעטפת גרעין מוגדר היטב נתפס עבור רוב התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח את הלשונית &quot;Z-הסדרה&quot; אינה מסומנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התכונה &#39;שמירה אוטומטית כאמור לעיל בסעיף 2.6.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את החשיפה והגדרות מיקום על ידי לחיצה על &quot;זמן הלולאה 1&quot;. להעריך את התמונות משודר לתאורת אור, מיקוד ומסגור כתוצאה מכך. אם המיקוד השתנה, לאפס את המוקד לכל עמדה תחת לשונית XY. חכה 10 דקות ולחזור על פעולה זו עד שהדגש הוא יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אומתו את כל ההגדרות ונבדקו, ליזום ניסוי האוטומטי על ידי לחיצה על הכפתור &quot;הפעל כעת&quot;. </li></ol></li&gt; </ol> עיבוד תמונה ויצוא - סעיף 4 נתוני יצוא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכי נתונים שהושגו במהלך לחיות תאי הדמיה של אירועי תחבורה או התפשטות צריכים להיות מיוצאים מהתוכנה שקל אלמנטים לסוגי קבצים בשימוש נפוצה לשימוש מאוחר יותר במצגות ופרסומים (משלימה סרט 3). כדי לייצא סרטים לפתוח את הקובץ המתאים nd2 הגלם. באלמנטי ש&quot;ח ובחר את התצוגה &quot;פיצול המרכיב&quot; כדי להמחיש את ערוצי הניאון הרצויים. השמעת הקובץ במהירות מתאימה, 5 מסגרות לשנייה היא נקודת התחלה טובה להדמיה של תחבורה מהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל חותמת זמן כדי לייצג את שעון בזמן אמת בעת צפייה בסרט. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר, הוסף ND-מידע. מונה דיגיטלי יופיע בפינה השמאלית העליונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערוך את חותמת הזמן כדי להציג את המידע. לחץ לחיצה ימנית על הדלפק ובחר עריכת ND-מידע. בחלון הקופץ שלאחר מכן, ערוך את הטקסט כדי לשקף Imagiפרמטרים ng שחשובים. עריכת גופן, צבע וגודל לבהירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכו לתפריט &quot;ערוך&quot; ולמצוא את &quot;יצירת תמונת מצב תצוגה&quot; או לחץ על המקש &quot;X&quot;. פקודה זו פותחת את החלון &quot;תצוגת תמונת המצב&quot;. בחר &quot;תחול על כל המסגרות&quot; לייצר 8 סיביות, RGB, קובץ יצוא מוכן המכיל את ערוצי ניאון מכל הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור כקובץ. אבי עבור תאימות בין הפלטפורמה. קבע שיעור השמעה ב 200 אלפיות שנייה לכל מסגרת. את קבצי AVI. נוצרו על ידי אלמנטי ש&quot;ח אז ניתן לדחוס עוד יותר עם תוכנת המרה אחרת לסוג הקובץ הרצוי. </li></ol>

<ol><li>Johnson, D. C., Baines, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+remodel+host+membranes+for+virus+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses remodel host membranes for virus egress.</a> Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).</li>
<li>Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesvirus+assembly%3A+a+tale+of+two+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpesvirus assembly: a tale of two membranes.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).</li>
<li>Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+accumulation%2C+envelopment%2C+and+exit+in+growth+cones+and+varicosities+in+mid-distal+regions+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons.</a> Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).</li>
<li>Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+Simplex+Virus+Capsids+Are+Transported+in+Neuronal+Axons+without+an+Envelope+Containing+the+Viral+Glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).</li>
<li>Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+gE%2FgI+and+US9+proteins+promote+transport+of+both+capsids+and+virion+glycoproteins+in+neuronal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons.</a> Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).</li>
<li>Tomishima, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).</li>
<li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li>
<li>Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+case%3A+Married+versus+Separate+models+of+alphaherpes+virus+anterograde+transport+in+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons.</a> Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).</li>
<li>Antinone, S. E., Smith, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+herpesvirus+trafficking+in+neurons%3A+membrane+acquisition+directs+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).</li>
<li>Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+a+fluorescent+tegument+component+in+single+pseudorabies+virus+virions+and+enveloped+axonal+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies.</a> Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).</li>
<li>Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+an+alphaherpesvirus+membrane+protein+that+is+essential+for+anterograde+axonal+spread+of+infection+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons.</a> mBio. 3 (2), (2012).</li>
<li>Taylor, M. P., Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphaherpesvirus+axon-to-cell+spread+involves+limited+virion+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li>
<li>Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesvirus+replication+compartments+originate+with+single+incoming+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes.</a> mBio. 2 (6), (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).</li>
<li>Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmented+neuron+cultures+for+directional+infection+by+alpha+herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).</li>
<li>Zareen, N., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+culturing+sympathetic+neurons+from+rat+superior+cervical+ganglia+%28SCG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG).</a> J. Vis. Exp. (23), e988(2009).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-to-Cell+Spread+of+Pseudorabies+Virus+in+a+Compartmented+Neuronal+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System.</a> Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).</li>
<li>Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+compartmented+cultures+of+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).</li>
<li>Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+Mediates+Axonal+Sorting+and+Directional+Transport+of+Alphaherpesvirus+Particles+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons.</a> Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).</li>
<li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+use+bidirectional+fast-axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466(2001).</li>
<li>Kramer, T., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphaherpesvirus+Infection+Disrupts+Mitochondrial+Transport+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).</li>
<li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).</li>
<li>Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+Hippocampal+Neurons+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).</li>
<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

המטרה של הדמיה תא החי היא התבוננות בתהליכים ביולוגיים כפי שהם מתרחשים ללא שינוי משמעותי על ידי הפעולה של התבוננות. מטרה זו מושגת על ידי אופטימיזציה של שלוש משתנה: איכות סביבה, מהירות של הדמיה, ותאורת פלואורסצנטי. משתני היתר תלויים אלה חייבים להיות מאוזנת כדי להשיג תנאי הדמיה קיימא. הפרוטוקולים שהוצגו לנצל תנאים מסוימים כדי להפיק את התוצאות המייצגות. אנו נדון באיכות הסביבה ונזק תצפיתי בקצרה לפני מפרט את השיטות הספציפיות שהוצגו. <p class="jove_content" style=";text-align:right;d...

זיהום של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) על ידי וירוסי alphaherpes כגון נגיף הרפס סימפלקס (HSV) -1, -2, ונגיף pseudorabies (PRV) כולל מספר שלבים מורכבים ופיקוח הדוק לאורך כל מחזור החיים של הנגיף. תחבורה בתוך הנוירונים של PNS היא קריטית באירועים של שניהם זיהום ויראלי ראשוני והתפשטות בין מארח שלאחר מכן. המנגנונים המולקולריים המווסתים שני מרכיבים של מחזור החיים של הנגיפים; התחבורה בבימויו של מכלולים נגיפיים הרחק מגופי תא בתוך אקסונים (הובלת אנטרוגרדית) והשידור הבא של virions לתאים רגישים (התפשטות אנטרוגרדית) הם חשובים להבנת הפתוגנזה ההרפס. התחבורה והיציאה של חלקיקים נגיפיים בתאי עצב תלוי בהרכבה של 1,2 virion זיהומית בוגר. מבחני בעבר קבועים, כולל immunofluorescence (IF) ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), שמשו כדי ללמוד את מדינת ההרכבה החלקיקים וprotאינטראקציות ein קשורות לתחבורת virion והתפשטות 3-6. עם זאת באופי הדינמי של virions ההובלה וממצאים ניסיוניים שהוצג על ידי קיבוע כימי מבולבל פרשנות קבועה תמונות 7,8. לאחרונה, מספר החלבונים נגיפיים היתוך-ניאון כבר תאר לHSV וPRV שיש השפעות זניחות על תפקוד חלבון. חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וחלבוני ניאון אדומים (mCherry או mRFP) fluorophores הם לזווג לעתים קרובות כדי לאפשר הדמיה של שתיים משלושת הרכיבים המבניים של virion בוגר: קופסית, קלפה, וגליקופרוטאין 9-11. לחיות הדמיה תא של התחבורה אנטרוגדית באמצעות וירוסים כפול שכותרתו מדמיין את מדינת ההרכבה של חלקיקים נגיפיים במהלך הובלה. fluorophore הדומה הביע זני נגיפים המשמשים לדמיין מספר והמגוון של הגנום נגיפי בעקבות התפשטות 12,13. את המאפיינים של חלבוני הניאון (הנסקרת ב 14,15) להשפיע באופן משמעותיהיכולת לדמיין מכלולים נגיפיים או סלולריים. את המאפיינים המהותיים של החלבון פלואורסצנטי, כולל אינטראקציות עצמיות ויציבות, יש לשקול בעת תכנון ובדיקת החלבון fusions חדשני לשימור טבע מהסוג פונקציונלי. בשיתוף עם איחודי חלבון פלואורסצנטי, שתי היטב מאופיינים במערכות תרבות תאים במבחנה מועסקים הדמיה תא חי של הידבקות בנגיף הרפס: 16 מנותקים וממודר 17 (איור 1 א) גרעיני עכברוש (SCG) נוירונים צוואר הרחם מעולים. בשתי המערכות, עוברי של SCG הם גזורים, ניתקו לגופי תא בודדים, ומצופה במבחנת culturing 18. נוירונים SCG הם חלק ממערכת העצבים האוטונומית ויכולים להיות מתורבתים בקלות ומובחן על ידי גורם גדילה עצבי (NGF) לvivo לשעבר המדינה מקוטבת בוגר. נוירונים SCG ניתקים יוצרים רשת מורחבת של האקסונים המאפשרת Fאו ההדמיה של חלקיקים נגיפיים כפי שהם עוברים הובלת אנטרוגרדית 6. תרבויות SCG ממודרים לספק בידוד fluidic של גוף התא העצבי (תא S) וTermini האקסון דיסטלי (תא N) 19. מספר הפרוטוקולים המפורטים לבנייה ולשימוש בתאי עצב ממודר באמצעות שונים Campenot תאי 17 או 20 מקורי כבר פורסם בעבר. בידוד Fluidic מאפשר לזיהום סלקטיבית של גופי תאים עצביים ואיתור של virions צאצאים לאחר ההובלה לטרמיני האקסון מבודד. ציפוי תאי האפיתל במשך טרמיני לפני ההדבקה מספק תאי נמען להתפשטות זיהום נגיפי. יש הרבה מרכיבים חיוניים חשובים לכל הניסויים ההדמיה התא חיים, אבל רלוונטי ביותר לפרוטוקולים שלנו הם: רכישה אוטומטית תמונה, תאורת ניאון, מהירות של הדמיה, ושליטה על הסביבה. עבור כל ניסויי ההדמיה, אנו משתמשים,, מיקרוסקופ הפוכה אוטומטית epifluorescence תאורה (איור 1). מיקרוסקופ בנוי סביב ניקון אקליפס טי הבסיס ומעסיק מספר מערכות מחשב שבשליטת ממונעת למהירות להגדיר מחדש את המיקרוסקופ במהלך רכישת תמונה אוטומטית. תאורה הקרינה, אנו משתמשים במנורת קשת ספקטרום רחב כספית שיכולה להיות מוחלש עם מסנני צפיפות ניטראליים לאורך נתיב ההארה. מסנני עירור להגביל את הספקטרום של תאורת ניאון וכאשר יחד עם מראות dichroic מרובות עוברות ומסנני פליטת הקרינה לדמיין תרכובות ניאון ספציפיות. את מסנני העירור ופליטה הם רכובים בגלגלים עצמאיים, מהר מיתוג סינון כדי לאפשר רכישה רציפה מהירה של ערוצי ניאון שונים. המהירות של רכישת תמונה עוד יותר משופרת עם מצלמת CCD EM-רגישה ומהירה, שימושית לזיהוי של אותות בעצימות נמוכים ותדמית קצרה לקרוא פעמים. שליטה בסביבת microscאופ מושגת עם למעלה שלב חממה מחומם ודוד עדשת מטרה לשמור על דגימות בטמפרטורות גבוהות תוך אווירה מועשרת 2 CO humidified והוא עבר לחממה. מיקרוסקופ נשמר בחדר חשוך עם טמפרטורת הסביבה נשמר קרוב ל 25 מעלות צלזיוס ואור בחוץ ממוזערים עם וילונות האפלה על כל החלונות. הפרוטוקולים הבאים לתאר את השימוש במערכת זו להובלת אנטרוגרדית ומבחנים להתפשט. קיים מספר החלופות לשליטה למשתנים של הדמיה תא חי. השליטה על הגדרות מיקרוסקופיה יכולה להתבצע באופן ידני או באמצעות מערכות אוטומטיות תלויות בתוכנת קניינית. תאורת הקרינה ניתן להשיג עם ההלוגן, LED או מקורות לייזר. המהירות של הדמיה היא שונה על ידי המהירות של מיתוג מסנן ואת הזמן כדי להמחיש את האות עם מערכת זיהוי לזווג. בקרה סביבתית יכולה להיות מושגת באמצעות חומרה מיוחדת במיילשלב croscope, מתחם של חלק ממיקרוסקופ בתיבה מחוממת וhumidified או כל, או על ידי העלאת הטמפרטורה של החדר שבו מיקרוסקופיה תבוצע. כל אחת מחלופות אלה יש יתרונות וחסרונות הקשורים למחיר וביצועים. בפרוטוקול שלאחר מכן, אנחנו פירוט השימוש בהדמית תא חי ללמוד תחבורה אנטרוגדית מהירה והתפשטות של וירוסי אנטרוגדית alphaherpes באמצעות השימוש בזני נגיפי רקומביננטי. הדמיה תא חי בזמן אמת visualizes קופסית, קלפה ו / או גליקופרוטאין שיתוף לוקליזציה על מבנים דינמיים העוברים תחבורה בתוך 11 אקסונים. ההדמיה timelapse הלילה של תרבויות העצביות הממודרות מדמיין יציאה virion axonal וזיהום של תאים רגישים 12. הפרוטוקולים שהוצגו כאן כבר מותאמים לשימוש עם מערכת ההדמיה המסוימת שלנו, אבל מוצגים במונחים רחבים ביחס לארבעה היסודות של הדמיה תא חי. בדיון שהיינויפרט עוד כמה אופטימיזציה כי הוא הכרחי לניסויים מוצלחים.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבות תחתית זכוכית 35 מ"מ</td><td>MatTek Corporation; אשלנד, MA</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ &mu;-Dish </td><td>Ibidi USA LLC, ורונה, WI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>גוף מיקרוסקופ </td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nikon Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ממונע שלב X-Y קודם</td><td>מדעי; Rockland, MA</td><td>H117 ProScan</td> גלגלי מסנן ממונעים שטוחים <td></td></tr><tr><td></td><td>עליונים Prior Scientific</td><td>HF110 גלגל מסנן 10 מצבים</td> מקור תאורה פלואורסצנטי Lumen Dynamics;<td></td></tr><tr><td> </td><td> מיסיסוגה, אונטריו קנדה</td><td>X-Cite 120Q</td><td></td></tr><tr><td>מסנני פלואורסצנציה רב-פסים ערכות Chroma</td><td>Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td><td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry -</td> מצלמת ET <td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>אנדור טכנולוגיה ארה"ב; דרום וינדזור, CT</td><td>iXon3 897</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide שלב החממה הסביבתית המובילה</td><td>Live Cell Instruments; סיאול, דרום קוריאה</td> מחמם עדשות <td>אובייקטיבי TC-L-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bioptecs; באטלר, בקר 150803 פנסילבניה</td><td>150819-12-08 תוכנת ניתוח תנורי חימום</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments Inc.; מלוויל, ניו יורק</td><td>NIS אלמנטים</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס alphaherpes ומורחים

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

התקדמות בטכניקות תא חי הקרינה מיקרוסקופיה, כמו גם הבנייה של זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון אפשרה להדמיה בזמן אמת של תעבורה והתפשטות של זיהום בנגיף alphaherpes של נוירונים. השירות של חלבוני היתוך ניאון רומן קרום ויראלי, קלפה, וcapsids, בשילוב עם הדמיה תא חי שנוצר על מכלולי חלקיקים נגיפיים העוברים תחבורה בתוך האקסונים. כלים דומים כבר מועסקים בהצלחה לניתוחים של תאי תאים פזורים של חלקיקים נגיפיים לכמת את המספר והמגוון של virions מועבר במגע בין תאים. חשוב לציין, בטכניקות של הדמיה תא החי של תחבורה והתפשטות אנטרוגדית לייצר שפע של מידע ובכלל מהירויות חלקיקי תחבורה, הפצות של חלקיקים, וניתוחים זמניים של לוקליזציה חלבון. לצד טכניקות גנטיות נגיפיות הקלסיים, מתודולוגיות אלה סיפקו תובנות קריטיותלשאלות מכניסטית חשובות. במאמר זה נתאר בפירוט את שיטות ההדמיה שפותחו כדי לענות על שאלות בסיסיות של תחבורה וירוס alphaherpes והתפשטות.

התחבורה אנטרוגדית יישום של פרוטוקול זה לזיהומים של תרבויות SCG ניתק עם PRV 348, זן PRV רקומביננטי לבטא חלבוני איחוי קרום GM-mCherry GFP-Us9 ו, יש להקל הדמיה של התחבורה אנטרוגדית של virions (איור 3 וסרט משלימה 4). שילוב של החלבונים האלה ההיתוך לתוך תוצאות נגיפיות חלקיקים באיתורם בהובלת puncta ותנאי ההדמיה האמורים למזער את הקיזוז של כל fluorophore על חלקיק בתנועה במהלך מיתוג מסנן. בחלון הדמיה של שלוש ...

הדמיה תא חי של נגיף alphaherpes מאפשרת ניתוח של האירועים הדינמיים של תחבורה בבימויו והתפשטות בין תאית. כאן, אנו מציגים מתודולוגיות לנצל זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון כדי להקל על הדמיה של מכלולים במהלך הזיהום נגיפיים של נוירונים העיקרי.

הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לדמות אירועים של הובלה והפצה של נגיף ההרפס באמצעות חלבוני פוזיה פלואורסצנטיים בתרביות של נוירונים ראשוניים. דבר זה מושג תחילה על ידי ביסוס דגיינות של הדגימות בטמפרטורות רלוונטיות פיזיולוגית על מיקרוסקופ המסוגל להחליף במהירות את התאורה הפלואורסצנטית. בשלב השני, פרמטרי הדמיות הפלואורסצנציה נקבעים כך שיגבילו נזק פוטו-תאי תוךما רכישת נתונים סבירים.בשלב הבא, מתבצעת רכישה רצפית של הערוצים הפלואורסצנטיים או רכישה ממיקומים מרובים. בשלב הסופי נרכשות תמונות בפריסה של משבצות (tiled frames). הנתונים מנותחים ומעוצבים מחדש לצורך הצגה ופרסום.בסופו של דבר, שיטה זו של דימוי תאים חיים משמשת למעקב אחר תנועתם של חלקיקי נגיף פלואורסצנטיים בתוך נוירונים ולמעקב אחר הזיהום בעודו מתפשט בין תאים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ההובלה וההפצה של נגיף ההרפס בנוירונים. ניתן ליישמה גם על אירועים דינמיים אחרים בביולוגיה של התא ובמיקרוביולוגיה, כגון ספיגה אנדוציטית של חלקיקים או נדידה של תאים.לפני כל ניסוי של דימות, חברו והתחילו בחימום של המדגרה שמעל במה של המיקרוסקופ. לאחר 30 דקות, הפעילו את המיקרוסקופ, את מקורות האור לשיקוף ולפלואורסצנציית epi, ואת הבקרים האוטומטיים של החומרה. לאחר מכן פתחו את NIS elements, תוכנת הבקרת המיקרוסקופ, כדי להתחבר למיקרוסקופ.כאן מוצגת צילום מסך של ממשק משתמש סטנדרטי ב-NIS elements. כפתורי הניגון והעצירה שולטים בחלון התמונה החיה המתאר את תצורות החומרה הנוכחיות לדימות, וכן את מה שמדומם כעת. לאורך הפאנל העליון מופיעה סדרה של תצורות אופטיות המיישמות את הגדרות החומרה המוגדרות מראש כדי להגדיר את המיקרוסקופ לזיהוי בתאורה חולפת (trans illuminated) או פלואורסצנציה.בקרת המצלמה והגדרות החשיפה מאפשרות הגדרה של זיהוי המצלמה כדי למטב את איכות התמונה והמהירות. כל הניסויים מתואמים באמצעות בקרת הרכישה של ה-ND. לאחר מכן, חברו מחמם עדשות לעדשת השקיעה בשמן המתאימה, ואז חברו את האינקובטור העליון של השולחן לשולחן המוטורי של המיקרוסקופ.ודאו שהמתאם המתאים להחזקת הדגימה נמצא במקומו, ולאחר מכן חברו את צינור האוויר הלח מהבקר של האינקובטור לפתח הכניסה באינקובטור שעל הבמה. הפעילו את בקרי האינקובטור ומחממי העדשות, ולאחר מכן כווןו את הגדרות הטמפרטורה לתנאים שאישרו מראש עבור המטרה והדגימה המצולמות. לבסוף, פתחו את שסתום הבקרה של מיכל ה-5%carbon dioxide 95%atmospheric כדי לספק אוויר מועשר בפחמן דו-חמצני לאינקובטור שעל הבמה.כדי לדמות אירועי הובלה של ויריונים בדרגה מסוימת בזמן אמת, ראשית, הכניסו צלחת תרבית תאים המכילה נוירונים מזוהמים לאינקובטור שמעל הבמה למשך 10 דקות לפחות לפני תחילת הניסוי. לאחר מכן, באמצעות אור מועבר והעינית של המיקרוסקופ, אתרו גוף תא עצבי בעל שלוחה אקסונית מבודדת בבירור.מציאת אזורים שניתן לדגם בתמונה בתרבית העצבית היא החלק הקשה ביותר בהליך זה. ניתן להבטיח את הצלחת התהליך על ידי הצבת מספר תרביות למקרה של צמיחה דלה של תאים או זיהום, או על ידי שיבוש פיזי של התרבית במהלך הדמיה. כעת השתמש בתוכנת המיקרוסקופ כדי להעביר את נתיב האור למצלמת ה-EM CCD, ולאחר מכן לחץ על כפתור ההפעלה (play) כדי לפתוח חלון תמונה בזמן אמת.לאחר קביעת הגדרות החשיפה האופטימליות של המצלמה עבור כל סט של חלבונים פלואורסצנטיים, הגדירו את הגב strongest של הכפלת האלקטרונים במצלמה ל-300. זאת כדי למזער את זמן החשיפה ולהגביר את הגילוי של אותות חלשים. הפסיקו את חלון הדימוי בזמן אמת כדי למנוע הלבנה (bleaching) של הדגימה.בשלב הבא, לאחר קביעת זמני החשיפה ומציאת אזור מוגדר היטב של האקסון ב-NIS elements, הגדירו את התוכנה לרכישת תמונות רצופית. פתחו את התפריט הנפתח של האפליקציות ובחרו באפליקציית six D define run experiment. בחלון הרכישה של ND, לחצו על לשונית הזמן (time) כדי לקבוע את תדירות רכישת התמונות.הגדירו את המרווח ללא השהיה (no delay) ואת המשך הפעולה לחמש דקות. כעת לחצו על לשונית ה-Lambda כדי לבחור את הגדרות החומרה המוגדרות מראש המשמשות לרכישת תמונות פלואורסצנטיות מרובות. לחצו על התיבה הראשונה ולאחר מכן, בתפריטי הבחירה הנפתחים הבאים, בחרו את הגדרת החומרה המתאימה.סמנו את תיבת השמירה לקובץ והגדירו את המיקום ואת שם הקובץ של פלט הניסוי. לאחר הגדרת כל הפרמטרים הללו, לחצו על כפתור ההפעלה כעת (run now) כדי להתחיל בניסוי. קצב רכישת התמונות מותאם באופן אופטימלי באמצעות הגדרות החשיפה וגודל התמונה שנרכשת.השתמש בכלי הגדרת אזור העניין (ROI) ב-NIS elements כדי להגדיר את אזור העניין. בחר שטח שבין 25% ל-50% משטח התמונה הכולל לצורך ביצוע דימוי time lapse למשך הלילה של אירועי פריסת enter a grade. ראשית, הנח בעדינות את צלחת התרבית לתוך האינקובטור המותקן על הבמה.לאחר וידוא שמיקום העדשה נקבע בצד הצלחת, התאם את המיקוד באיטיות, תוך הקפדה שהעדשה לא תדחף כלפי מעלה לתוך הדגימה. ברגע ששדה המיקוד זוהה, העבר באיטיות את העדשה למרכז הצלחת סמוך למחסום הפנימי, תוך סימון הצד הפנימי של תא האקסון, תוך הקפדה על שמירת עומק המיקוד ומניעת דחיפה של העדשה לתוך הדגימה. לאחר מכן, הוסף סביב הנוירונים בצלחת התרבית כ-2 mL של PBS בטמפרטורה של 37 °C מחוץ לטבעת הטפלון, כדי למזער התייבשות של הדגימה ולספק בידוד תרמי.לאחר מכן, הפעל את כל מסנני הצפיפות הניטרלית (neutral density filters) כדי להגביל את עוצמת התאורה לרמה הנמוכה ביותר האפשרית, דבר המאפשר רכישת תמונות תכופה לאורך פרקי זמן ממושכים ללא נזק פוטו-כימי מוגבר. בחלון רכישת ה-ND, לחץ על לשונית התמונה הגדולה ובחר אזור המורכב מחמש על שתיים תמונות. השתמש בחפיפת תפירה (stitching overlap) של 7% כדי לדגום תמונות של מספר מיקומים במקביל ובאופן רצף.במהלך צילום הסרט למשך הלילה, בחרו בלשונית מיקומי XY. לאחר מכן, הגדירו את המיקומים שישמשו כנקודת המרכז עבור כל אזור תמונה גדול. נקודת המיקוד צריכה להיות גרעין התא; מקמו את העדשה כך שמעטפת הגרעין תיראה מוגדרת בבירור עבור מרבית התאים.לאחר מכן, לחצו על loop פעם אחת כדי לבחון את הגדרות החשיפה והמיקום, והעריכו את התמונות שהתקבלו מבחינת אור מועבר, תאורה, פוקוס ומסגור. לאחר שכל ההגדרות אומתו ונבחנו, התחילו את הניסוי האוטומטי על ידי לחיצה על כפתור run now כדי לייצא סרטים שהתקבלו במהלך הדימוי של תאים חיים. ראשית, פתחו את קובץ ה-raw ND two המתאים ב-NIS elements ובחרו בתצוגת split component view.כדי להציג את הערוצים הפלואורסצנטיים הרצויים, השמיעו את הקובץ במהירות מתאימה. חמישה פריימים לשנייה מהווים נקודת התחלה טובה להצגה של הובלה מהירה, כולל הוספת חותמת זמן שתייצג שעון זמן אמת במהלך השמעת הסרטון. לחצו לחיצה ימנית על התמונה ובחרו ב-ADD ND information.מונה דיגיטלי יופיע בפינה השמאלית העליונה; כדי לערוך את חותמת הזמן, לחץ לחיצה ימנית על המונה ובחר בעריכת מידע ND (edit ND information). בחלון הפופ-אפ שייפתח, ערוך את הטקסט כך שישקף את פרמטרי הדמיя הרלוונטיים. ערוך את צבע וגודל הגופן של הטקסט לצורך בהירות.לאחר מכן, עברו לתפריט העריכה ובחרו ב-Create view snapshot כדי לפתוח את חלון צילום התצוגה (view snapshot), במטרה להפיק קובץ ייצוא מוכן בפורמט RGB של שמונה ביטים המכיל את הערוצים הפלואורסצנטיים מכל הסרט; בחרו ב-apply to all frames. לבסוף, שמרו את הקובץ בפורמט AVI לצורך תאימות בין פלטפורמות שונות, והגדירו את קצב ההשמעה ל-200 מילישניות לכל פריים. בתמונת ניגוד הפאזה זו, מוצגת תרבית מייצגת ובוגרת של נוירונים מופרדים מהגנגליון הצווארי העליון (superior cervical ganglia או SCG) המשמשת לדימות של הובלת ויריונים רטרוגרדית; נוירונים המודבקים בנגיף הפסאודורביס (pseudo rabies virus או PRV) מביעים חלבוני היתוך לממברנה מסוג GFPS nine ו-GMM cherry.באיור זה מוצג דימוי מייצג של תאים חיים של אקסונים של SCG שמונה שעות לאחר הדבקה ב-P RV 3 48; מבנים המובלים בתובלה אנטרוגרדית בתוך אקסונים דיסטליים מוצגים בשני ערוצים פלואורסצנטיים, GFP ו-mCherry. מבנה המובל בתובלה אנטרוגרדית, כפי שמסומן על ידי החצים הלבנים, מתקדם בתוך האקסון. שני החלבונים הפלואורסצנטיים מופסטים מרחבית בשל הרכישה הרצפית של הערוצים הפלואורסצנטיים והתנועה המהירה של המבנים הוויראליים.יישום פרוטוקול זה על זיהומים של תרביות מפוצלות של SCG עם PRV 3 48 אפשר את הוויזואליזציה של ההובלה האנטרוגרדית של Vons. שילובם של חלבוני פיוז'ן אלו בחלקיקים ויראליים מוביל לזיהוים בנקודות הובלה, כפי שנראה באמצעות הנקודות הפלורסצנטיות הנעות. תנאי הדימות שהוזכרו לעיל ממזערים את ההיסט של כל פלואור בחלקיק נע במהלך החלפת המסננים.שימוש בגלגלי מסננים בעלי מיתוג מהיר ובמראות דיכרואיות רב-מעבריות תואמות מאפשר רכישה רצפית מהירה של שניים או יותר של ערוצי פלואורסצנציה במהירות של עד 0.8 פריימים לשנייה בחלון הדמיה של שלוש דקות. ניתן להבחין ב-Punta רבות המובלות, ומדגמים גדולים לאנליזות קולוקליזציה נוצרים במהירות. כאן מוצגת סכימה של מערכת התרבית המאורגנת בתאים המודגמת בתמונה זו, כאשר נוירונים מסוג SCG נזרעו בתא השמאלי, והבליטות האקסוניות נמתחות תחת המחסומים הפנימיים אל התא הימני הרחוק.התמונות הבאות נבחרו מסרט time-lapse רחב המורכב מאריחים של תמונות, המציג מעבר של virion מאקסונים שנדבקו ב-PRV 4 27 לתאי אפיתל מקבלים. בלוח ראשון זה מוצגות תמונות פלואורסצנטיות של YFP ו-RFP שהועברו בנקודת זמן לאחר ההדבקה. מוצגות התמונות כאשר התאים המקבלים מתחילים להבטא חלבוניהם של YFP קשורי ממברנה ו-VP 26 MRFP.התיבה הלבנה מדגישה אזור בתאי האפיתל המקבלים המכיל מקבצי קפסיד מדביקים. כאן מוצג אותו אזור כפי שנראה בתמונה הקודמת, כאשר הצפייה היא בערוץ ה-RFP בלבד. הקו הלבן הרציף מסמן ייצוג סכמטי של מתאר התא.הקווים הלבנים המקווקווים מצביעים על גרעיני התאים והקווים הכחולים מתוחים סביב האקסונים. בלוח שני זה, מוצגים יחד ערוצי ה-YFP וה-RFP בלבד. שימו לב למספר הרב של נקודות (puncta) של MRFP הקשורות למסלולי האקסונים.תאים אלו הודבקו לאחרונה ואינם מבטאים אף אחד מחלבוני היתוך. ניתן לעקוב אחר התאים המודבקים לאחור כדי להדמיא את הקפסيدات הפלורסצנטיות שהביאו לתחילת הזיהום הוויראלי. ניתן לבודד תאים בודדים אלו מהמסגרת הגדולה ולעקוב אחריהם ללא איבוד משמעותי של פרטים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שמיקרוסקופיה של תאים חיים משפיעה על התהליך הביולוגי הנצפה. עם זאת, אופטימיזציה קפדנית של פרוטוקולים אלו מאפשרת ויזואליזציה ללא שינוי של התהליך.

live-cell-imaging-alphaherpes-virus-anterograde-transport

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הדמיה תא חי היא של כלי מסוים כאשר לומדים את הדינמיקה של סחר אברון. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בנוירונים בתרבית שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גמיש ניתן להתאים האברונים תמונה אחרים כגון המיטוכונדריה, endosomes, ואת peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

ניסוי זה הוא מדריך חזותי עבור ניצול שיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV עבור לחיות ניסויים הדמיה confocal.

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

תהליכים תאיים כגון נדידת תאים מסורתי נחקרו על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. דו"ח זה מתאר טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון וניתוח הדינמיקה חלבון בתאי נודדות בתוך מטריצה ​​יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תלת מימדי,.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

אנו מתארים פרוטוקול עבור videoimaging בזמן האמת של הנדידה עצבית במוח הקדמי בעכבר. ההגירה של מבשרי נוירונים שכותרת-ויראלי או מושתלים נרשמה בפרוסות חיות חריפות באמצעות הדמית ניאון שדה רחב עם מרווח רכישה מהירה יחסית כדי ללמוד את השלבים השונים של נדידת תאים, כולל את משכי הזמן של שלבי הגירה והנייחת והמהירות הגירה.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

סרטון זה מדגים שיטה לניטור חלבון תא נגוע 0, ICP0 סחר בזיהום הרפס סימפלקס-1. לאחר סינתזת נובו, ICP0 עובר טרנסלוקציה לגרעין, ומאוחר יותר עובר לציטופלסמה במהלך התקדמות הזיהום. מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי חושף ומנתח את הלוקליזציה התת-תאית של החלבון, ומציע תובנות לגבי הסחר שלו לאורך שלבי זיהום.

טכניקת אימונופלואורסנציה ללוקליזציה של חלבונים נגיפיים בתאים נגועים

הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיקת neuroblast ידי מעקב וידאו.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

אנו מתארים פרוטוקול לניטור ניידות רדיאלית של תאים חיסוניים שאינם נצמדים במבחנה באמצעות מנגנון סעפת/החלקה של שקיעת תאים. נדידת תאים עוקבת אחר חד-שכבות של תאי גידול או על חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. בדיקה במיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בניידות התא ובתפקוד הציטוטוקסי.

מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים

ICP0 עובר טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. מנגנון מולקולרי של אירוע זה אינו ידוע. כאן נתאר את השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי ככלי לכמת ICP0 בתנועת זיהום HSV-1, אשר מניחה את היסודות לניתוח באופן כמותי ICP0 רוברטסונית במחקרים מכניסטית בעתיד.

ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית

כאן אנו מתארים בשיטת הדמיה לחיות מחוץ לתמונה כדי להמחיש הובלה תאיים של אורגלים וסחר של חלבונים קרום פלזמה ב astrocytes מורטין. פרוטוקול זה מציג גם מתודולוגיה לניתוח תמונה כדי לקבוע מסלולים להובלת מטענים וקינטיקה.

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

הובלה אנדוציטית ונסיגה של חלבונים מקרום הפלזמה לרשת הטרנס-גולגי חיונית לשמירה על הומאוסטזיס הממברנה ולוויסות האיתות. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה וכימות של הובלה אנדוציטית של חלבוני מטען טרנסממברניים על ידי מיקרוסקופ תאים חיים באמצעות ננו-גופים נגזרים נגד GFP בתאי HeLa.

הדמיית תאים חיים של הובלה אנדוציטית באמצעות ננו-גופים פונקציונליים בתאים מתורבתים

למדו הדמיית תא חי של תחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים בתרביות נוירונים ראשוניים באמצעות חלבוני פלואורסצנט. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת חלקיקים ויראליים בזמן אמת.

הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים

גלה סרטונים נוספים