Name: הפקת חלבון סהכ ו2-D שיטות גל אלקטרופורזה עבור Burkholderia מינים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למדו שיטה להפקת חלבון סה"כ מחיידקי Burkholderia באמצעות הפרעה מכנית ואלקטרופורזה בג'ל דו-ממדי. שיטה זו מאפשרת מיפוי הפרוטאום והבנת הביטוי החלבוני בפתוגנים חיידקיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מלגת לימודים מאוניברסיטת בריטיש קולומביה (לBV) ומענקים מסיסטיק פיברוזיס מכוני קנדה וקנדיים לבריאות מחקר (לDPS). אנו מודים לז&#39;קלין צ&#39;ונג להכנה הראשונית של פרוטוקולים.

<ol><li>Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia+in+cystic+fibrosis%3A+epidemiology+and+molecular+mechanisms+of+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).</li>
<li>Suarez-Moreno, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+Features+of+Environmental+and+Potentially+Beneficial+Plant-Associated+Burkholderia%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia.</a> Microb. Ecol. , (2011).</li>
<li>Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melioidosis%3A+insights+into+the+pathogenicity+of+Burkholderia+pseudomallei%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).</li>
<li>White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Melioidosis.</a> Lancet. 361, 1715-1722 (2003).</li>
<li>Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifarious%2C+multireplicon+Burkholderia+cepacia+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).</li>
<li>Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Burkholderia+cepacia+complex+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Canada.+Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis.</a> Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).</li>
<li>Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+susceptibility+of+Pseudomonas+pseudomallei.+Emergence+of+resistance+in+vitro+and+during+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment.</a> J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).</li>
<li>Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+susceptibility+of+65+isolates+of+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+mallei+to+35+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).</li>
<li>Govan, J. R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+transmission+of+Pseudomonas+cepacia+by+social+contact+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis.</a> Lancet. 342, 15-19 (1993).</li>
<li>Thongboonkerd, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+proteome+in+Burkholderia+pseudomallei+rpoE+operon+knockout+mutant%3A+insights+into+mechanisms+of+rpoE+operon+in+stress+tolerance%2C+survival%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence.</a> J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).</li>
<li>Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+analysis+of+B.+cenocepacia+using+two-dimensional+liquid+separations+coupled+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry.</a> Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).</li>
<li>Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+profiles+and+the+potential+markers+between+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis.+Mol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol.</a> Cell Probes. 21, 81-91 (2007).</li>
<li>Harding, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+surface+proteins+of+Burkholderia+pseudomallei%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei.</a> Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).</li>
<li>Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+%282-D+DIGE%29+reveals+molecular+strategies+employed+by+Burkholderia+cenocepacia+to+adapt+to+the+airways+of+cystic+fibrosis+patients+under+antimicrobial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy.</a> Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).</li>
<li>Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Mucoidy+in+Virulence+of+Bacteria+from+the+Burkholderia+cepacia+Complex%3A+A+Systematic+Proteomic+and+Transcriptomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis.</a> J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).</li>
<li>Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Burkholderia+cenocepacia+H111%3A+setting+up+a+2-DE+reference+map%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map.</a> Proteomics. 6, 207-216 (2006).</li>
<li>Weiss, W., Gorg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+solublization+buffers+for+two-dimensional+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).</li>
<li>von der Haar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protein+extraction+for+quantitative+proteomics+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts.</a> PLoS One. 2, e1078(2007).</li>
<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li>
<li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li>
<li>Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+low-abundance+proteins+using+multidimensional+chromatography+and+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags.</a> J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li>
<li>Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+proteins+from+Burkholderia+pseudomallei+isolated+during+primary+and+relapsing+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis.</a> Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).</li>
<li>Chung, J. W., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+and+characterization+of+bacterial+factors+associated+with+Burkholderia+cenocepacia+survival+in+a+murine+host%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host.</a> Microbiology. 153, 206-214 (2007).</li>
<li>Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Public+health+assessment+of+potential+biological+terrorism+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Public health assessment of potential biological terrorism agents.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).</li>
<li>Thon, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+proteomic+analysis+of+protein+changes+during+platelet+storage+requires+complementary+proteomic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches.</a> Transfusion. 48, 425-435 (2008).</li>
<li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+New+and+Emerging+Proteomic+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In New and Emerging Proteomic Techniques.</a> Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).</li>
<li>Lopez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+silver+stain+and+SYPRO+Ruby+Protein+Gel+Stain+with+respect+to+protein+detection+in+two-dimensional+gels+and+identification+by+peptide+mass+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling.</a> Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטה להכנת חלבונים שתוארה שיכול לחלץ את רוב חלבוני Burkholderia עם שחזור טוב. זו באה לידי הביטוי על ידי קבלת באותו פרופיל חלבון משני תכשירים עצמאיים שבוצעו בימים שונים תוך שימוש באותה התרבות חיידקים גדלה בLB או מרק YEM כפי שמוצג באיור 1. החילוץ היה יעיל לחיידקים גדלו בתקשורת נוזלית, אך יש לנו לא נבדקו בשיטה זו לחיידקים גדלו על צלחות. שיטה זו שימשה גם לאפיון חלבונים נוסף באמצעות כלים proteomic; הקבוצה שלנו למדה בהצלחה שינויי proteome באמצעות ג&#39;ל אלקטרו...

Burkholderia הסוג מונה יותר מ 62 מינים, אורגניזמים שליליים גרם מבודדים ממגוון רחב של נישות, והוא מחולק לשני אשכולות עיקריים 1,2. האשכול הראשון כולל בני אדם, בעלי חיים ואורגניזמים phytotrophic, ורוב המחקרים התמקדו במינים פתוגניים של קבוצה זו בשל החשיבות הקלינית שלהם. החברים פתוגניים ביותר הם B. pseudomallei ו-B mallei (מה שגורם melioidosis ונחרת בהתאמה) 3,4 ופתוגנים אופורטוניסטיים (17 מינים המוגדרים של מתחם Burkholderia cepacia, BCC) 5, הגורמים למחלות בסיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת granulomatous כרונית (CGD) 1. האשכול השני, עם יותר מ 30 מינים nonpathogenic, כולל חיידקים הקשורים צמחים או בסביבה, והם נחשבים למועילים פוטנציאליים למארח 2. סיבוכים רבים לצאת frזיהום חיידקי אום עם החברים פתוגניים של סוג Burkholderia, כגון העברת של הפתוגן בין חולים, התפשטות המחלה וכישלון טיפול בשל ההתנגדות הפנימית או נרכשה לאנטיביוטיקה הופכת קשה למגר ברוב המקרים 6-9. לכן, צובר הבנה ברורה יותר של הבסיס להקמתה של זיהום חיידקים הוא חיוני לטיפול במחלות הנגרמות על ידי אורגניזמים אלה. על מנת לקבל תובנות לגבי הקמתה של זיהום, חקירות נרחבות על רכיבי חיידקים הקשורים בפתוגנזה יש צורך. לימודים מתמקדים בניתוח proteomic של אורגניזמים Burkholderia תוך שימוש בגישות proteomic תיארו חלבונים שהיו מעורבים בפתוגנזה של חיידקים, כמו גם שינויים בproteome פרופילי 10-16. שיטות הפקת חלבון באמצעות sonication ומחזורי הקפאה מופשרת במאגר תמוגה המכיל גבוה קונצרט כלשהוentration של אוריאה, thiourea בשילוב עם חומרי ניקוי וampholytes כבר יושם במחקרי proteomic Burkholderia 10-13. למרות האוריאה היא די יעילה לdenaturation חלבון, זה יכול לבסס שיווי משקל בתמיסה מימית עם איזוציאניד אמוניום, אשר יכול להגיב עם קבוצות חומצת אמינו, ובכך יוצר חפצים (תגובת carbamylation) 17. לכן, מומלץ לכלול ampholytes המוביל, אשר פועל כמו אוכלי נבלות cyanate ולהימנע מטמפרטורות מעל 37 מעלות צלזיוס 17. יתר על כן, כדי למנוע כל הפרעה כימית של מאגר תמוגה עם כימות חלבון, אותו המאגר תמוגה יכול לשמש כדי ליצור עקומת הסטנדרט, כדי שהדגימות והסטנדרטים יש לו הרקע 10. מתודולוגיות אחרות כרוכות בשימוש במאגרים וחומרי ניקוי בסיסיים עם תקופות דגירה חום 17,18, אולם תנאים אלה עלולים לגרום לשינויים בproteome ושחומרי ניקוי מסוימים אינם תואמים ליחסי ציבוריישום oteomics אלא אם כן צעדים להסרת חומר ניקוי שלאחר מכן כלולים 17,18. לאחר חילוץ וכימות נאותים, ביטוי חלבון הגלובלי של כל חלבון בודד ניתן ללמוד באמצעות גישות proteomic כגון דו ממדים (2-D) ג&#39;ל אלקטרופורזה. טכניקה זו תוארה לראשונה על ידי O&#39;Farell 19 ומורכב בהפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית על ידי איזואלקטרית התמקדות בממד הראשון, ולאחר מכן בהתאם למשקל המולקולרי שלהם על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה acrylamide בממד השני. בשל הרזולוציה והרגישות שלה, טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לניתוח וזיהוי של חלבונים ממקורות ביולוגיים מורכבים 19,20. טכניקת הפרדה זו זמינה כיום בגישות חלבון ממוקד עם היתרון הגדול של פתרון isoforms החלבון נגרם על ידי שינויים לאחר תעתיק או עיבוד פרוטאוליטי. שינויים הכמותייםיכול להיות מזוהה על ידי השוואת עוצמת הנקודה המקבילה לאחר הצביעה של ג&#39;ל 20. עם זאת, טכניקה זו אינה מתאימה לזיהוי של חלבונים גדולים מאוד, חלבונים בממברנה, חלבונים מאוד בסיסיים וחומצי או הידרופובי, והיא טכניקה קצת מייגע וגוזל זמן 20. גישות פפטיד הממוקד חדשות (המבוסס על ג&#39;ל שאינו), כי הם יותר חזקים והמטרה להיות זמינות וניתן להשתמש בם להשוואת כמותית בשיטות תיוג איזוטופ היציב ההפרש כגון תיוג ציסטאין ידי זיקה מקודדת איזוטופ תיוג (ICAT) 21, וקבוצת אמינו תיוג על ידי תיוג איזוטופ כדי לכמת יחסי ומוחלט (iTRAQ) 22. השימוש בטכניקת proteomic אחת עשויה לתת מידע מספיק, ולכן השימוש בשני גישות proteomic משלימות הוא הכרחי עבור רוב השינויים בהערכה באופן מלא בproteome. עם זאת, ג&#39;ל אלקטרופורזה 2-D נעשתה שימוש נרחב ויכולה להיות מיושמת באופן שיגרתי לקוואןtitative ביטוי של מספר חלבונים באורגניזמים שונים. כאן אנו מתארים מיצוי חלבון כל התא ונהלי ג&#39;ל אלקטרופורזה 2-D למיני Burkholderia שהותאמו ומותאמים מ2-D עקרונות אלקטרופורזה GE Healthcare ושיטות Handbook 80-6429-60AC 2004 <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">(www.amershambiosciences.com).</a> הפקת החלבון בוצעה באמצעות מקצף חרוז בחרוזי זכוכית בנוכחות של PBS המכילה 5 מ&quot;מ EDTA (חומצת tetraacetic ethylenediamine) ו1 מ&quot;מ PMSF (פלואוריד phenylmethylsulfonyl). הליך זה מאפשר כימות של חלבונים עם השפלה מינימלית הוא amendable לגישות proteomic כ15,23,24 שדווחו בעבר. ג&#39;ל אלקטרופורזה 2-D בוצעה באמצעות 24 סנטימטר ארוך משותק pH 4-7 שיפוע וחלבונים הופרדו על פי נקודה איזואלקטרית. אז חלבונים הופרדו על פי Molecמשקל תואר בלבד על ידי ג&#39;ל SDS-polyacrylamide. בנוסף, אנו תיארתי שיטת צביעת כסף להדמיה של חלבוני מקום, ושיטת כתם כסף שהוא תואם לניתוח ספקטרומטריית מסה. יחד נהלים אלה יכולים לאפשר זיהוי של חלבונים חשובים ממינים Burkholderia שיכול להיות מעורב בפתוגנזה.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</חזקים></td></tr><tr><td>פניל-מתאןסולפוניל פלואוריד (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>אצטון רעיל, קורוזיבי</td></tr><tr><td></td><td>פישר</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>מאגר PBS</td> דליק <td>Bioscience</td><td>R028</td><td></td></tr><tr><td>אתילנדיאמין-טטראצטי חומצה (EDTA)</td><td>פישר</td><td>BP118-500</td><td>חרוזי זכוכית רעילים</td></tr><tr><td>(0.1 מ"מ)</td> <td>מוצרי BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה של Nalgene Oak Ridge, פוליקרבונט (50 מ"ל)</td> <td>VWR</td><td>21009-342</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי חלבון MicroBCA</td><td>פירס</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל צינורות כובע בורג חרוטי עם מכסה וטבעת</td><td>O פישר</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי דו-ממדית</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>Invitrogen</td><td>15505-050</td><td></td></tr><tr><td>מגרה CHAPS</td><td>אמרשם ביוסיינסס</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>MPביורפואי, LCC</td><td>856126</td><td>מגרה</td></tr><tr><td>אימובילין רצועות יבשות pH 4-7 24 ס"מ</td><td>אמרשם ביוסיינסס</td><td>176002-46</td><td></td></tr><tr><td>Duracryl</td><td>Proteomic Solutions</td><td>80-0148</td><td>רעיל מאוד, מסרטן</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>פישר</td><td>BP179-100</td><td>דליק, רעיל, קורוזיבי</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט דליק (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>רעילות חריפה,</td></tr><tr><td>אגרוז</td> דליק <td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר</td><td>HC1100-1GL</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td> דליקה, רעילה <td>פישר</td><td>A491-212</td> דליק<td>, קורוזיבי</td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד</td><td>פישר</td><td>G151-1</td><td>רעיל מאוד, קורוזיבי, מסוכן לסביבה</td></tr><tr><td>אשלגן טטרתיונאט</td><td>סיגמא</td><td>P2926</td><td></td></tr><tr><td>מגרה נתרן אצטט</td><td>EM Science</td><td>7510</td><td></td></tr><tr><td>כסף חנקתי</td><td>סיגמא</td><td>209139</td><td>קורוזיבי, מסוכן לסביבה</td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>נתרן תיוסולפט</td> רעיל <td>סיגמא</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>EMD</td><td>9230</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>MPBiomedical, LCC</td><td>808831</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>MPBiomedical, LCC</td><td>800688</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר</td><td>A412-4</td><td>דליק, רעיל, סכנה בריאותית</td></tr><tr><td>נתרן פחמתי נטול מים</td><td>EMD</td><td>SX0400-3</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td> רעיל <td>ACROS</td><td>415080010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק> </td></tr><tr><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה JA-20</td><td>בקמן קולטר</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>מיני מקצף חרוזים</td><td>מוצרי Biospec</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיקוד איזואלקטרית Ettan IPGphor II ואביזרים</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6505-03</td><td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td></tr><tr><td>Ettan DALT מערכת אלקטרופורזה אנכית גדולה</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-27</td><td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td></tr></tbody></table>

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-d שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; burkholderia</em&gt; מינים

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

החקירה של רמות החלבון תאית של מיני חיידקים היא בעלת חשיבות להבנת המנגנונים פתוגניים במחלות הנגרמים על ידי אורגניזמים אלה. כאן אנו מתארים הליך להפקת חלבון ממינים Burkholderia מבוססת על תמוגה מכאנית באמצעות חרוזי זכוכית בנוכחות חומצת ethylenediamine tetraacetic ופלואוריד phenylmethylsulfonyl בופר פוספט. שיטה זו יכולה לשמש למיני Burkholderia שונים, לתנאי גידול שונים, וסביר להניח מתאים לשימוש במחקרי proteomic של חיידקים אחרים. לאחר מיצוי חלבון, טכניקת proteomic דו ממדים (2-D) ג&#39;ל אלקטרופורזה מתוארת ללמוד שינויים הגלובליים בproteomes של אורגניזמים אלה. שיטה זו מורכבת של הפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית על ידי איזואלקטרית התמקדות בממד הראשון, ואחריו הפרדה על בסיס משקל מולקולריעל ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה acrylamide בממד השני. הדמיה של חלבונים מופרדים מתבצעת על ידי צביעת כסף.

ניתוח השוואתי של פרופילי החלבון המופקים מאותה התרבות חיידקים בשתי הזדמנויות שונות הראה פסי דפוסים דומים המצביע על עקירות חלבון מוצלחות. חלבונים במשקל מולקולריים שחולצו נעו 10-150 kDa. איור 1 מציג נציג ג&#39;ל Coomassie כתמי כחולים של עקירות חלבון כל התא מmultivorans Burkholderia (חבר של BCC) קליני מבודדים גדל בLB או שמרים / Manitol מרק (YEM) ו נקטף משלב נייח. לניתוח ג&#39;ל אלקטרופורזה 2...

חברים של סוג Burkholderia הם פתוגנים חשיבות קלינית. אנו מתארים שיטה לסך מיצוי חלבון חיידקים, תוך שימוש בהפרעה מכאנית, וג&#39;ל אלקטרופורזה 2-D לניתוח proteomic שלאחר מכן.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ליצור מפה דו-ממדית של פרוטאום חיידקי. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול תרבית חיידקים וקצירת החלבונים. לאחר מכן, החלבונים שנקצרו מופרדים בממד אחד בהתאם ל-pH שלהם.באמצעות מיקוד איזואלקטרי לאחר ההפרדה בממד הראשון, החלבונים מופרדים באופן נוסף בממד השני בהתאם למשקל המולקולרי שלהם. לבסוף, הג'ל של הממד השני נצבע והחלבונים מודגשים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות הבדלים בביטוי חלבונים באמצעות אלקטרופורזה דו-ממדית.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפתוגנזה החיידקית, כגון אילו חלבונים מיוצרים בתנאים מסוימים, וכיצד נבדלים ביניהם בידודים חיידקיים שונים בייצור חלבונים? מידע זה יכול לסייע בזיהוי חלבונים מועמדים שעשויים להיות מעורבים באלימות (virulence). לאחר גידול של תרבית מוצרי חלב קרה של 100 milliliter לשלב הסטציונרי, העבר 35 milliliters לשפופרת צנטריפוגה וסבב במהירות של 4,500 Gs ובטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך 20 דקות.יש לערבב מחדש, להשעות את המשקע ב-35 milliliters של PBS קר ולחזור על הסבב של הסרימרגציה. לאחר ערבוב מחדש והשעיה של המשקע ב-1 milliliter של PBS קר, יש להעביר את התמיסה למיקרו-מבחנה סטרילית של 2 milliliter ולסבב שוב. יש לחזור על השטיפה ב-1 milliliter של PBS קר לפני סבב ב-4 °C וב-14,000 Gs למשך דקה אחת, להסיר את העלייה ולהוסיף 1 milliliter של תמיסת P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F; לאחר מכן יש להעביר את המשקע המומס למבחנה עם פקק הברגה של 2 milliliter המכילה כ-0.5 milliliters של חרוזי זכוכית שעברו סטריליזציה מראש.לאחר מכן, בחדר הקירור, כדי לפרק את התאים, השתמש במכשיר mini bead beader שלוש פעמים למשך דקה אחת בכל פעם, תוך הנחת הדגימה על קרח לאחר כל סבב. צנטריפוגה למשך דקה אחת לפני העברת הנוזל העליון (supernatant) לשפופרת פוליסטירן סטרילית של 5 mL. כדי להגדיל את התנובה, חזור על תהליך הריסוק בחרוש (bead bashing) פעמיים נוספות עם מנה נוספת של P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. הוצא את הדגימות.לאחר קביעת כמות החלבון, יש לאחסן מנות של 200 µg בטמפרטורה של 80°C- עד למועד ביצוע הממד הראשון. מיקוד איזואלקטרי או IEF מתחיל בניקוי תומכי הרצועות באמצעות תמיסת ניקוי לרצועות. לאחר מכן יש לשטוף את הרצועות במי milli Q.לאחר הייבוש, השאירו אותם הפוך להתייבשות, והקצו לכל דגימה מספר של מחזיק רצועות ג'ל. טענו דגימת חלבון של 200 microgram שהוכנה מראש אל הבאר הצדית של מחזיק הרצועה, והשתמשו בפיפטה כדי לפזר את הדגימה לאורך המחזיק באמצעות פינצטה נקייה. הוציאו את רצועות הג'ל מהאריזה.לאחר מכן, הסר את שכבת ההגנה מרצועות הג'ל לפני הנחתן, כאשר הצד המחוספס פונה כלפי מטה, בתנועת החלקה איטית כדי להרטיב את הרצועות מהקוטב השלילי לקוטב החיובי. כדי למנוע שריפה, הנח נייר ספיגה טבול במים סטריליים מעל האלקטרודה ומתחת לרצועות הג'ל. הסר בועות אוויר וכסה בשכבה דקה של שמן מינרלי כדי למנוע התייבשות.סדרו את מחזיקי רצועות הג'ל במכשיר ה-IEF. הריצו את הדגימות באמצעות התוכנית המפורטת כאן. ניתן להוציא את הג'לים בכל עת במהלך השלב האחרון.עם סיום התוכנית, הוצא את הפסים מתושבות הפסים, ואלא אם כן נעשה בהם שימוש מיידי, כסה אותם בניילון נצמד ואחסן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לביצוע SDS page דו-ממדי שני. לאחר הרכבת מערכת יציקת הג'ל עבור SDS page, הכן את תמיסת הג'ל בבקרא עם פיית ואקום ומגנט ערבוב על ידי הוספת 1.5 molar tris buffer ומים מזוקקים, ובצע ניתון גזים (degas) לתמיסה במהירות בינונית באמצעות הוואקום למשך 20 דקות. עם סיום פעולת הוואקום, הוסף 10% SDS לתמיסת הג'ל על ידי פיפטינג לדופן הבקרא. כדי למנוע היווצרות בועות, הוסף לאחר מכן ammonium per sulfate ו-temid שהוכנו טריים, וערבב.מזגו את הג'ל והמתינו עד להתייצבותו, ולאחר מכן המיסו DTT בתוך תמיסת השיווי (equilibration solution) שהוכנה מראש. הוציאו את הרצועות מאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס, פתחו את העטיפות והניחו את רצועות ה-IPG כשהצד של הג'ל פונה כלפי מטה לתוך הבאפר, והדגירו למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 4.5 ליטר של באפר אלקטרופורזה למיכל ההרצה.לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הוצא את הרצועות מתמיס השיווי משקל והשתמש בנייר סופג כדי לנקז את עודפי הבופר. פרק את מכשיר יצירת הג'ל ושטוף את לוחיות הזכוכית במים חמימים. לאחר החלפת המים בחלקו העליון של הג'ל בבופר ריצה, השתמש בפינצטה נקייה כדי להניח רצועה על גבי הלוחית הארוכה, כאשר צד הג'ל פונה אליך.יש לשמן את הרצועה באמצעות buffer 1x ולהשתמש ברצועת פלסטיק כדי להחליק את רצועת ה-IPG למטה אל מול הג'ל, תוך הסרת כל בועות האוויר שבין הרצועה לג'ל. יש להוסיף תמיסת איטום agarro לחלק העליון של הרצועה כדי לאטום אותה במקומה. לאחר חזרה על התהליך עבור כל הרצועות, יש להוריד אותן אל תוך מיכל הג'ל.לאחר שהבטחת שרמת תמיסר ה-1x במדף החיצוני היא ברמה שנקבעה, חבר את המדף העליון. הנח את מסגרת תא התמיסר העליון מעל ללוחות הזכוכית ולחץ כלפי מטה. הוסף תמיסר הרצה 2x לתא העליון עד לקו האמצע.לאחר מכן, הוסיפו את ה-running buffer בריכוז 1x לתא החיצוני עד להגעה לקו העליון. הניחו את המכסה מעל והפעילו את יחידת האלקטרופורזה ואת ספק הכוח. הריצו את הדגימות למשך הלילה במתח של 52 volts, זרם של 96 milliamps והספק של five watts.הריצו את הג'לים עד שהקווים המובילים נמצאים במרחק של סנטימטר אחד מהתחתית. לאחר סיום ההרצה, הוציאו את הפלטות מהמסגרת. ברגע שהג'לים הופרדו מהפלטות הזכוכית, קבעו אותם בתמיסה 1 למשך שעה אחת לפחות או למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C.לאחר מכן, העבירו את הג'לים לתמיסת קיבוע שתיים והניחו אותם בערבול (rocking) למשך שעה אחת. שטפו את הג'לים במים מזוקקים (Milli Q water) ארבע פעמים למשך 15 דקות בכל פעם. לאחר מכן, השתמשו בתמיסת silver nitrate לצביעת הג'לים למשך 30 דקות או עד 48 שעות.לאחר שטיפת הג'לים במשך דקה במים מזוקקים (Milli Q), העבירו אותם לתמיסת פיתוח עד שהג'ל נצבע. לאחר כ-5 עד 30 דקות, כדי לעצור את התגובה, העבירו את הג'לים לתמיסת עצירה למשך 10 דקות. מוצג כאן ג'ל שנצבע ב-Kumasi Blues של תמריתי חלבון מתאי שלם של *O. dia multivorans*.בידודים קליניים שגודלו במצע LB או במצע צמיחה של שמרים ומנליטול ונאספו בשלב הסטציונרי. ניתוח השוואתי של פרופילי החלבונים שהופקו מאותם תרביות חיידקים בשתי הזדמנויות שונות הראה דפוסי רצועות דומים, המעידים על הפקות חלבון מוצלחות. באיור זה, ניתוח אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי (2D gel electrophoresis) של 200 micrograms של חלבון כולל מ-Bural dio, pseudo מראה שפע של יותר מ-500 נקודות שניתן לזהותן באופן אינדיבידואלי באמצעות ספקטרומטריית מסות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ציטומטריה על מנת לקבוע הבדלים כמותיים ואיכותיים בין בידודים בקטריאליים בעלי זיקה הדוקה. בנוסף, באמצעות התאמה של שיטת הצביעה, חוקרים יכולים לקבוע את זהותן של נקודות חלבון באמצעות גזירת נקודות וספקטרומטריית מסה.

total-protein-extraction-2-d-gel-electrophoresis-methods-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

כלי ו chemistries מתוארים ברצף כדי לבודד חומצות גרעין ואחריו חלבונים ממדגם ללא צורך בחשמל. כלי מורכב sorbent שנערך בתוך פיפטה העברת בעוד chemistries בידוד מבוססים על עקרונות מוצק בשלב החילוץ. מקרומולקולות את בודדים ניתן לנתח על ידי מבחני חיסונית מבוססי PCR מבוסס.

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

ביטוי משותף של חלבונים הוא אלטרנטיבה רבת עוצמה לבנייה מחדש במבחנה של קומפלקסים של חלבונים, והוא מסייע בביצוע בדיקות ביוכימיות וגנטיות in vivo. כאן אנו מדווחים על השימוש בביטוי משותף של חלבונים ב-Escherichia coli כדי להשיג קומפלקסים של חלבונים, ולכוונן את תדירות המוטציות של התאים.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

ביטוי של חלבוני מלריה במערכות תא מבוסס נותר מאתגר. אנו מדגימים שתי מערכות ביטוי תא חופשי צעד וIVT צעד אחד (בתרגום חוץ גופית) לביטוי חלבוני rhoptry רקומביננטי מלריה מתאי הלה. אנו משתמשים במערכת לטיהור מבוססת זיקת Ni-שרף לטהר את חלבוני rhoptry.

מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry חלבונים

חיידקים גראם שליליים מייצרים שתי ממברנות בעלי הפרדה. הקרום החיצוני מחולק מהקרום הפנימי על ידי פריפלמטר ושכבת פטיפדוגליקן. היכולת לבודד את הbilayers כפול של חיידקים אלה היה קריטי להבנת הפיזיולוגיה שלהם פתוגנזה.

הפרדת מעטפת התא עבור חיידקים גראם שליליים לתוך שברים פנימיים וחיצוניים ממברנה עם כוונונים טכניים עבור בעלי הביטוח העצמי

פרוטוקול זה מתאר את החילוץ והדמיון של חלבונים מצטברים ומסיסים מ Escherichia coli לאחר טיפול עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. בעקבות הליך זה מאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבון ב- vivo בזני חיידקים שונים ו/או בין טיפולים.

מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי

פרוטוקול זה מתאר כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל, טכניקה ניתנת לשחזור להעשרת בועיות חוץ-תאיות של Mycobacterium tuberculosis מסופרנטים של תרביות.

מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל

חלבונים חיוניים לפתוגנזה של חיידקים, ומאפשרים פלישה והתחמקות חיסונית. מיצוי חד-שלבי של חלבונים ציטופלזמיים וממברנה של חיידקים בצורתם הפעילה הוא מטריד. מאמר וידאו זה מדגים מיצוי של חלבונים תאיים שלמים של לפטוספירה לניתוח זימוגרפיה לאיתור ואפיון ג'לטינאזות.

מיצוי חד-שלבי וניתוח זימוגרפי של ג'לטינזות חיידקיות

פרוטוקול זה מפריד בין חלבוני דופן התא והממברנה הבלתי מסיסים לשברים פשוטים (1-5 חלבונים) באמצעות מיקוד איזואלקטרי מכין (IEF) המבוסס על נקודה איזואלקטרית, ואחריו הפרדה לפי משקל מולקולרי. ניתן להשתמש בשברים המתקבלים ישירות לניתוח אימונולוגי ופרוטאומי ללא טיהור נוסף.

הפרדה ופיצול של חלבוני דופן התא וקרום התא מ-Mycobacterium tuberculosis לניתוח חלבונים במורד הזרם

למדו שיטה להפקת חלבון סה"כ מחיידקי Burkholderia באמצעות הפרעה מכנית ואלקטרופורזה בג'ל דו-ממדי. שיטה זו מאפשרת מיפוי הפרוטאום והבנת הביטוי החלבוני בפתוגנים חיידקיים.

הפקת חלבון סה"כ ו2-D שיטות ג'ל אלקטרופורזה עבור

גלה סרטונים נוספים