הפקת חלבון סה"כ ו2-D שיטות ג'ל אלקטרופורזה עבור

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ליצור מפה דו-ממדית של פרוטאום חיידקי. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול תרבית חיידקים וקצירת החלבונים. לאחר מכן, החלבונים שנקצרו מופרדים בממד אחד בהתאם ל-pH שלהם.

באמצעות מיקוד איזואלקטרי לאחר ההפרדה בממד הראשון, החלבונים מופרדים באופן נוסף בממד השני בהתאם למשקל המולקולרי שלהם. לבסוף, הג'ל של הממד השני נצבע והחלבונים מודגשים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות הבדלים בביטוי חלבונים באמצעות אלקטרופורזה דו-ממדית.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפתוגנזה החיידקית, כגון אילו חלבונים מיוצרים בתנאים מסוימים, וכיצד נבדלים ביניהם בידודים חיידקיים שונים בייצור חלבונים? מידע זה יכול לסייע בזיהוי חלבונים מועמדים שעשויים להיות מעורבים באלימות (virulence). לאחר גידול של תרבית מוצרי חלב קרה של 100 milliliter לשלב הסטציונרי, העבר 35 milliliters לשפופרת צנטריפוגה וסבב במהירות של 4,500 Gs ובטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך 20 דקות.

יש לערבב מחדש, להשעות את המשקע ב-35 milliliters של PBS קר ולחזור על הסבב של הסרימרגציה. לאחר ערבוב מחדש והשעיה של המשקע ב-1 milliliter של PBS קר, יש להעביר את התמיסה למיקרו-מבחנה סטרילית של 2 milliliter ולסבב שוב. יש לחזור על השטיפה ב-1 milliliter של PBS קר לפני סבב ב-4 °C וב-14,000 Gs למשך דקה אחת, להסיר את העלייה ולהוסיף 1 milliliter של תמיסת P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F; לאחר מכן יש להעביר את המשקע המומס למבחנה עם פקק הברגה של 2 milliliter המכילה כ-0.5 milliliters של חרוזי זכוכית שעברו סטריליזציה מראש.

לאחר מכן, בחדר הקירור, כדי לפרק את התאים, השתמש במכשיר mini bead beader שלוש פעמים למשך דקה אחת בכל פעם, תוך הנחת הדגימה על קרח לאחר כל סבב. צנטריפוגה למשך דקה אחת לפני העברת הנוזל העליון (supernatant) לשפופרת פוליסטירן סטרילית של 5 mL. כדי להגדיל את התנובה, חזור על תהליך הריסוק בחרוש (bead bashing) פעמיים נוספות עם מנה נוספת של P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. הוצא את הדגימות.

לאחר קביעת כמות החלבון, יש לאחסן מנות של 200 µg בטמפרטורה של 80°C- עד למועד ביצוע הממד הראשון. מיקוד איזואלקטרי או IEF מתחיל בניקוי תומכי הרצועות באמצעות תמיסת ניקוי לרצועות. לאחר מכן יש לשטוף את הרצועות במי milli Q.

לאחר הייבוש, השאירו אותם הפוך להתייבשות, והקצו לכל דגימה מספר של מחזיק רצועות ג'ל. טענו דגימת חלבון של 200 microgram שהוכנה מראש אל הבאר הצדית של מחזיק הרצועה, והשתמשו בפיפטה כדי לפזר את הדגימה לאורך המחזיק באמצעות פינצטה נקייה. הוציאו את רצועות הג'ל מהאריזה.

לאחר מכן, הסר את שכבת ההגנה מרצועות הג'ל לפני הנחתן, כאשר הצד המחוספס פונה כלפי מטה, בתנועת החלקה איטית כדי להרטיב את הרצועות מהקוטב השלילי לקוטב החיובי. כדי למנוע שריפה, הנח נייר ספיגה טבול במים סטריליים מעל האלקטרודה ומתחת לרצועות הג'ל. הסר בועות אוויר וכסה בשכבה דקה של שמן מינרלי כדי למנוע התייבשות.

סדרו את מחזיקי רצועות הג'ל במכשיר ה-IEF. הריצו את הדגימות באמצעות התוכנית המפורטת כאן. ניתן להוציא את הג'לים בכל עת במהלך השלב האחרון.

עם סיום התוכנית, הוצא את הפסים מתושבות הפסים, ואלא אם כן נעשה בהם שימוש מיידי, כסה אותם בניילון נצמד ואחסן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לביצוע SDS page דו-ממדי שני. לאחר הרכבת מערכת יציקת הג'ל עבור SDS page, הכן את תמיסת הג'ל בבקרא עם פיית ואקום ומגנט ערבוב על ידי הוספת 1.5 molar tris buffer ומים מזוקקים, ובצע ניתון גזים (degas) לתמיסה במהירות בינונית באמצעות הוואקום למשך 20 דקות. עם סיום פעולת הוואקום, הוסף 10% SDS לתמיסת הג'ל על ידי פיפטינג לדופן הבקרא. כדי למנוע היווצרות בועות, הוסף לאחר מכן ammonium per sulfate ו-temid שהוכנו טריים, וערבב.

מזגו את הג'ל והמתינו עד להתייצבותו, ולאחר מכן המיסו DTT בתוך תמיסת השיווי (equilibration solution) שהוכנה מראש. הוציאו את הרצועות מאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס, פתחו את העטיפות והניחו את רצועות ה-IPG כשהצד של הג'ל פונה כלפי מטה לתוך הבאפר, והדגירו למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 4.5 ליטר של באפר אלקטרופורזה למיכל ההרצה.

לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הוצא את הרצועות מתמיס השיווי משקל והשתמש בנייר סופג כדי לנקז את עודפי הבופר. פרק את מכשיר יצירת הג'ל ושטוף את לוחיות הזכוכית במים חמימים. לאחר החלפת המים בחלקו העליון של הג'ל בבופר ריצה, השתמש בפינצטה נקייה כדי להניח רצועה על גבי הלוחית הארוכה, כאשר צד הג'ל פונה אליך.

יש לשמן את הרצועה באמצעות buffer 1x ולהשתמש ברצועת פלסטיק כדי להחליק את רצועת ה-IPG למטה אל מול הג'ל, תוך הסרת כל בועות האוויר שבין הרצועה לג'ל. יש להוסיף תמיסת איטום agarro לחלק העליון של הרצועה כדי לאטום אותה במקומה. לאחר חזרה על התהליך עבור כל הרצועות, יש להוריד אותן אל תוך מיכל הג'ל.

לאחר שהבטחת שרמת תמיסר ה-1x במדף החיצוני היא ברמה שנקבעה, חבר את המדף העליון. הנח את מסגרת תא התמיסר העליון מעל ללוחות הזכוכית ולחץ כלפי מטה. הוסף תמיסר הרצה 2x לתא העליון עד לקו האמצע.

לאחר מכן, הוסיפו את ה-running buffer בריכוז 1x לתא החיצוני עד להגעה לקו העליון. הניחו את המכסה מעל והפעילו את יחידת האלקטרופורזה ואת ספק הכוח. הריצו את הדגימות למשך הלילה במתח של 52 volts, זרם של 96 milliamps והספק של five watts.

הריצו את הג'לים עד שהקווים המובילים נמצאים במרחק של סנטימטר אחד מהתחתית. לאחר סיום ההרצה, הוציאו את הפלטות מהמסגרת. ברגע שהג'לים הופרדו מהפלטות הזכוכית, קבעו אותם בתמיסה 1 למשך שעה אחת לפחות או למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר מכן, העבירו את הג'לים לתמיסת קיבוע שתיים והניחו אותם בערבול (rocking) למשך שעה אחת. שטפו את הג'לים במים מזוקקים (Milli Q water) ארבע פעמים למשך 15 דקות בכל פעם. לאחר מכן, השתמשו בתמיסת silver nitrate לצביעת הג'לים למשך 30 דקות או עד 48 שעות.

לאחר שטיפת הג'לים במשך דקה במים מזוקקים (Milli Q), העבירו אותם לתמיסת פיתוח עד שהג'ל נצבע. לאחר כ-5 עד 30 דקות, כדי לעצור את התגובה, העבירו את הג'לים לתמיסת עצירה למשך 10 דקות. מוצג כאן ג'ל שנצבע ב-Kumasi Blues של תמריתי חלבון מתאי שלם של *O. dia multivorans*.

בידודים קליניים שגודלו במצע LB או במצע צמיחה של שמרים ומנליטול ונאספו בשלב הסטציונרי. ניתוח השוואתי של פרופילי החלבונים שהופקו מאותם תרביות חיידקים בשתי הזדמנויות שונות הראה דפוסי רצועות דומים, המעידים על הפקות חלבון מוצלחות. באיור זה, ניתוח אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי (2D gel electrophoresis) של 200 micrograms של חלבון כולל מ-Bural dio, pseudo מראה שפע של יותר מ-500 נקודות שניתן לזהותן באופן אינדיבידואלי באמצעות ספקטרומטריית מסות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ציטומטריה על מנת לקבוע הבדלים כמותיים ואיכותיים בין בידודים בקטריאליים בעלי זיקה הדוקה. בנוסף, באמצעות התאמה של שיטת הצביעה, חוקרים יכולים לקבוע את זהותן של נקודות חלבון באמצעות גזירת נקודות וספקטרומטריית מסה.