הפקת חלבון סה"כ ו2-D שיטות ג'ל אלקטרופורזה עבור Burkholderia מינים

חברים של סוג Burkholderia הם פתוגנים חשיבות קלינית. אנו מתארים שיטה לסך מיצוי חלבון חיידקים, תוך שימוש בהפרעה מכאנית, וג'ל אלקטרופורזה 2-D לניתוח proteomic שלאחר מכן.

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מפה דו-ממדית של פרוטאום חיידקי. זה מושג על ידי גידול תרבית חיידקים וקצירת החלבונים. לאחר מכן, החלבונים שנקטפו מופרדים בממד יחיד בהתאם ל-pH שלהם.

על ידי מיקוד איזואלקטרי לאחר הפרדת הממד הראשון, החלבונים מופרדים עוד יותר בממד השני בהתאם למשקלם המולקולרי. לבסוף, ג'ל הממד השני מוכתם והחלבונים נראים באופן חזותי. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הבדלים בביטוי החלבון באמצעות אלקטרופורזה דו מימדית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתוגנזה של חיידקים, כגון אילו חלבונים מיוצרים בתנאים מסוימים, וכיצד מבודדי חיידקים שונים שונים שונים בייצור חלבון? מידע זה יכול לסייע בזיהוי חלבונים מועמדים שעשויים להיות מעורבים באלימות. לאחר גידול תרבית חלב קרה של 100 מיליליטר לשלב נייח, העבירו 35 מיליליטר לצינור צנטריפוגה וסובבו ב-4, 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

החייאה, השעו את הגלולה ב -35 מיליליטר PBS קר וחזרו על הצנטריפוגה. לאחר ש-Resus תלתה את הגלולה במיליליטר אחד של PBS קר, העבירו את התמיסה לצינור מיקרו סטרילי של שני מיליליטר וסובבו שוב. חזור על הכביסה במיליליטר אחד של PBS קר לפני סיבוב בארבע מעלות צלזיוס ו -14, 000 גרם.למשך דקה אחת, השליכו את הסופרנטנט והוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F העבירו את הכדור המומס לצינור מכסה בורג של שני מיליליטר המכיל כ -0.5 מיליליטר חרוזי זכוכית מעוקרים מראש.

לאחר מכן, בחדר הקירור כדי לשבש את התאים, השתמשו במיני חרוזי חרוזים שלוש פעמים למשך דקה אחת כל אחת והניחו את הדגימה על קרח לאחר כל צנטריפוגה עגולה למשך דקה אחת לפני העברת הסופרנטנט לתוך צינור פוליסטירן סטרילי של חמישה מיליליטר. כדי להגדיל את התשואה, חזור על חבטת החרוזים פעמיים עם תוספת של P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. משוך את הדגימות.

לאחר מכן, לאחר בדיקת כמות החלבון, יש לאחסן 200 מיקרוגרם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לשימוש לביצוע המימד הראשון. מיקוד איזואלקטרי או IEF מתחילים באמצעות תמיסת ניקוי רצועות לניקוי מחזיקי הרצועות. לאחר מכן יש לשטוף את הרצועות במי מילי Q.

לאחר מכן השאירו אותם הפוכים לייבוש לאחר הייבוש, הקצו כל דגימה למספר מחזיק רצועת ג'ל. טען דגימת חלבון של 200 מיקרוגרם שהוכנה בעבר לבאר הרוחבית של מחזיק הרצועה, והשתמש בפיפטה כדי להפיץ את הדגימה לאורך המחזיק באמצעות מלקחיים נקיים. משוך את רצועות הג'ל מהאריזה.

לאחר מכן הסר את שכבת המגן מרצועות הג'ל לפני ריפוד אותן עם הצד המחוספס כלפי מטה בתנועת החלקה איטית כדי להרטיב את הרצועות מהקצה השלילי לקצה החיובי. כדי למנוע שחיקה, הניחו נייר סופג דampעם מים מעוקרים על גבי האלקטרודה ומתחת לרצועות הג'ל. הסר בועות אוויר וכיסוי בשכבה דקה של שמן מינרלי למניעת התייבשות.

יישר את מחזיקי רצועות הג'ל במכשיר IEF. הפעל את הדוגמאות באמצעות התוכנית המפורטת כאן. ניתן להסיר את הג'לים בכל עת במהלך השלב האחרון.

בסיום התוכנית, הסר את הרצועות ממחזיקי הרצועות ואלא אם כן נעשה בהן שימוש מיידי, יש לכסות בניילון נצמד ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לבצע דף SDS ממד שני לאחר הרכבת מכשיר גלגל הג'ל לדף SDS, הכינו את תמיסת הג'ל בבקבוק עם קצה ואקום ומוט ערבוב על ידי הוספת מאגר טריס מולארי דרקל 1.5 ומערבבים מים MCU ומסירים את התמיסה במהירות בינונית עם הוואקום למשך 20 דקות. בסיום הוואקום, הוסף 10% SDS לתמיסת הג'ל על ידי פיפטינג במורד דופן הבקבוק. כדי להימנע מהכנסת בועות, הוסיפו אמוניום טרי שהוכן לכל סולפט וטמיד וערבבו

יוצקים את הג'ל ומניחים לו להתייצב ואז ממיסים DTT לתמיסת שיווי משקל שהוכנה בעבר. מוציאים את הרצועות מאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס, פורקים אותן ומניחים את רצועות הג'ל של רצועות ה-IPG כלפי מטה במאגר ודוגרים למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 4.5 ליטר מאגר אלקטרופורזה למיכל הפועל.

לאחר מכן בעזרת פינצטה, הסר את הרצועות מתמיסת שיווי המשקל e והשתמש במגבת נייר כדי לנקז את המאגר העודף. לפרק את מכשיר גלגלת הג'ל ולשטוף את צלחות הזכוכית במים חמים. לאחר החלפת המים בחלק העליון של הג'ל במאגר זורם, השתמש בפינצטה נקייה כדי להניח רצועה על גבי הצלחת הארוכה כשצד הג'ל פונה אליך.

יש לשמן את הרצועה עם מאגר x אחד ולהשתמש ברצועת פלסטיק כדי להחליק את רצועת ה-IPG למטה כנגד הג'ל, להסיר את כל בועות האוויר בין הרצועה לג'ל. הוסף תמיסת איטום אגרו לחלק העליון של הרצועה כדי לאטום אותה במקומה. לאחר מכן לאחר חזרה על התהליך עבור כל הרצועות, הורד אותו למיכל הג'ל.

לאחר שווידאתם שרמת החיץ x אחת בתא החיצוני נמצאת ברמה המיועדת, חבר את החדר העליון. הנח את המסגרת לתא החיץ העליון על גבי לוחות הזכוכית ולחץ כלפי מטה. הוסף את שני המאגרים הפועלים לתוך החדר העליון עד לקו האמצעי.

לאחר מכן הוסף את המאגר הפועל אחד x לתא החיצוני עד שהוא מגיע לקו העליון. הנח את המכסה למעלה והפעל את יחידת האלקטרופורזה ואת חבילת החשמל. הפעל את הדגימות למשך הלילה ב-52 וולט, 96 מיליאמפר וחמישה וואט.

הפעל את הג'לים עד שהקווים המובילים נמצאים סנטימטר אחד מלמטה. לאחר זמן הריצה, הסר את הצלחות מהגלגל. לאחר הוצאת הג'לים מצלחות הזכוכית, מקבעים אותם בתמיסה אחת למשך שעה לפחות או לילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מעבירים את הג'לים לתיקון תמיסה שתיים ומתנדנדים למשך שעה. שטפו את הג'לים במי Milli Q ארבע פעמים למשך 15 דקות כל אחד. לאחר מכן השתמש בתמיסת כסף חנקתי כדי להכתים את הג'לים למשך 30 דקות או עד 48 שעות.

לאחר שטיפת הג'לים במשך דקה במי Milli Q, העבירו אותם לתמיסת מפתח עד שהג'ל מוכתם. כחמש עד 30 דקות כדי לעצור את התגובה, העבירו את הג'לים להפסקת התמיסה למשך 10 דקות. מוצג כאן ג'ל כתמים של Kumasi Blues של מיצוי חלבון תאים מלאים מ-ol dia multivorans.

מבודדים קליניים הגדלים במרק מניטול LB או שמרים ונקצרים בשלב נייח. ניתוח השוואתי של פרופילי החלבון שהופקו מאותן תרביות חיידקים בשתי הזדמנויות שונות הראה דפוסי פסים דומים המעידים על מיצוי חלבון מוצלח. באיור זה ניתוח אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי של 200 מיקרוגרם של חלבון כולל מ-Bural dio, פסאודו מראה שפע של יותר מ-500 כתמים שניתן לזהות בנפרד על ידי ספקטרומטריית מסה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ציטומטריה על מנת לקבוע הבדלים כמותיים וכמותיים בין מבודדי חיידקים קרובים זה לזה. בנוסף, עם שינוי בשיטת הצביעה, החוקרים יכולים לקבוע את זהותם של כתמי חלבון על ידי כריתה נקודתית וספקטרומטריית מסה.