Name: Assay וMicroinjection פצע בvivo לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב דרוזופילה עוברים. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: למדו לדמיין תגובת פצע עורית בזמן אמת בעוברי Drosophila באמצעות מיקרו-הזרקה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת לחקור ביטוי גנים בתאים סביב פצע לקידום ריפוי רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול זה פותח בשיתוף פעולה עם חברים קודמים של המעבדה מקגיניס, קים א מייס ויוסף ג פירסון. אנו מודים להמשך מאמצים על ידי מרכז מניות דרוזופילה Bloomington עבור עבודתם לארגן ולהפיץ מניות ערך. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM077197 וK12 GM68524) ומשפחתו של הרברט שטרן. MTJ נתמכת כיום על ידי גרנט מספר 5G12RR003060-26 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר וגרנט מספר 8G12MD7603-27 מהמכון הלאומי לבריאות מיעוט ופערים בבריאות. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי על פערים בבריאות ובריאות מיעוט או המכון הלאומי לבריאות.

פרוטוקול הפצע העוברי דרוזופילה ניתן לסכם בחמישה שלבים: (1) אוסף עובר, (2) עובר הכנה (3) העובר פציעה, (4) Microinjection עובר, ו( 5) קיבוע עובר. 1. אוסף עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף זבובים בוגרים, 2-3 ימים לאחר eclosing, להוסיף 50 נקבות וזכרים 25 לכלוב אוסף עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח אגר טרי תפוחי מיץ בתוספת שמרי צלחת בכל בוקר במשך 3 ימים. הערות: לאוסף עובר אופטימלי, מחזור הזבובים על לוח זמנים יומי שעות 12 בחממה 25 ° C (05:00 אורות &quot;ON&quot; ו -17:00 אורות &quot;OFF&quot;); זבובים נשיים להגיב לשינויים במחזור האור ו יפקיד כמויות גדולות יותר של ביצים במתג אורות &quot;ON&quot; לאורות &quot;OFF&quot; 10,11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעתי אחר הצהריים של יום 3, במקום מיץ טרי תפוח בתוספת צלחת אגר שמרים על הכלוב ולאסוף עובר במשך שעה 2. הנח שמרי צלחת חדשה בכלוב ולשמור2 צלחת אוסף משאבי אנוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את צלחת האוסף ל14 שעות נוספות ב ° C25 לגיל העוברים. הערות: ריפוי פצע יכול להיות assayed בכל שלב במהלך פיתוח דרוזופילה, יש לי כתבי תעתיק מושרה הפצע המתואר במאמר זה פעילות אופטימלית בין שלבי 15-16 דצמבר. בשלב מאוחר 17, העובר הוא זקן מדי כדי לחדור בקלות לציפורן ההתבגרות וביעילות להפעיל את כתבי פצע או לזהות שעתוק מושרה פצע. כדי לאפשר את זמן האיסוף וזמן הפציעה להתרחש במהלך מעבדה שעות שיא, אנו עוקבים אחר לוח זמנים של אוסף עובר במשך שעה 2 (16:00-18:00), להחליף את צלחת האוסף עם צלחת חדשה בשעת 18:00, גיל צלחת האוסף ב25 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות (לילה), ופצע העוברים בשעה 08:00 (למחרת). </li></ol> 2. הכנת עובר הערות: פרוטוקול זה כולל את השימוש בכלים רבים וחפצים שאינם חדים או עשוי gילדה. לטפל בכל המכשירים החדים וחפצי זכוכית בזהירות כדי למנוע פגיעה בגוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות עוברים מצלחות אוסף עם מכחול על ידי הוספת 2-3 מיליליטר מים לצלחת ומתערבל. העבר את המים ועוברים מצלחת לרשת ניילון וצינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 4-5 מיליליטר של אקונומיקה לכובע של צלחת פטרי צלחת פלסטיק ולספוג סוף המכוסה הרשת של צינור האוסף המכיל את העוברים באקונומיקה למשך 2 דקות, אשר מסיר את קליפת הביצה החיצונית של העובר. באופן ידני לסובב את צינור האיסוף כמה פעמים כדי למנוע מעוברים שהלם באקונומיקה. יש לשטוף את העוברים עם 10x מים ולייבש את צינור איסוף הרשת מכוסה המכיל את עוברי dechorionated על מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באיזמל מנתחים להעביר ~ 50 עוברים מרשת הניילון לצלחת אגר. אנו מוסיפים צבע מאכל ירוק לצלחת אגר להוסיף קונטרסט וסיוע ביישור עובר. תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות שתי שורות מקבילות של ~ 25 עוברים, יישור אמברימערכת הפעלה בשקופית, כך שהם יהיו בזווית ישרה למחט לנקב על מנגנון microinjection. השאר מעט מקום (כ 1 עובר אורך) בין העוברים לצורכי חילוף גזים. שתי שורות מקבילות צריכים להיות כ 5 מ&quot;מ זה מזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית עם קלטת כפולה מקל על גבי העוברים המיושרים ובזהירות לחץ על השקופיות להעברת עוברים מהצלחת הירוקה לשקופית. ואז אוויר יבש עובר ~ 25 דקות כדי להפחית את הלחץ פנימי על העובר ולמנוע פרץ כשפצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 2-3 טיפות של תערובת שמן halocarbon על העוברים על מנת למנוע התייבשות נוספת. </li></ol> 3. עובר פציעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף העובר בשלב מיקרוסקופ ההזרקה. מצא את העוברים בשדה הראייה ולתרגל להזיז את הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה. הערות: לפני העבודה עם המחט, להתמקד במישור אמצע העובר לאורך ציר dorsoventral. כדי לאפשר לפציעתם יעילה שלעוברים מיושרים, מתחילים פוצעים השורה קרובה יותר למנגנון המחט. הזז את הבמה כדי להביא את החלק העליון של השורה של עוברים מיושרים לשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום ולהבטיח את משך מחט בבעל המחט. השתמש micromanipulator להזיז את המחט לכיוון שקופיות. יישר את המחט עם העובר, באותו מישור מוקד. ברגע שהמחט נמצאת בפוקוס עם העובר, לא להזיז את המחט עם micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הבמה כדי לנקב את העובר ולפנים, ולאחר מכן לעבור לעובר הבא בשורה. כאשר נעשה פצעו את השורה הראשונה, השתמש בmicromanipulator להזיז את המחט לגמרי, הרחק מהבמה לפני שעברתי את השקופית; ידני לסובב את השקופית 180 ° ופצע בשורה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את העוברים תחת שמן halocarbon בטמפרטורת חדר ולהמשיך עם קיבעון עובר אם עושה הכלאה באתרו או מכתים נוגדן (ראה שלב נוהל 5). לחלופין, לאחסן את העוברים ל4-6 שעותתחת שמן halocarbon ולהמשיך בויזואליזציה פצע תעתיק כתב ניאון (נציג תוצאות). הערות: לקבלת ההדמיה של כתב הניאון, אנחנו מרדימים את העוברים באמצעות 50% 1-phenoxy-2-propanol 13. העוברים יוסרו משמן halocarbon והניחו בשקופית חדשה. אנחנו שמים חרוזי זכוכית סביב העוברים, להוסיף כמה טיפות של חומר ההרדמה, ולמקם את תלוש לכסות על העוברים. </li></ol> 4. Microinjection עובר הערות: מנגנון microinjection שאנו משתמשים בפרוטוקול אינו אוטומטי כדי לספק נפח מסוים במהלך assay. אנו מוסיפים צבע לפתרון כדי להמחיש את microinjection ולנסות לנרמל את הנפח נמסר. אם יותר מדי פתרון מוזרק לתוך העובר, קרום vitelline יתפוצץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט עומס מאחור עם 1 μl של תמיסה כימית בתוספת צבע (למשל 0.6 MH 2 O 2). לאפשר נימיםפעולה כדי לצייר את הפתרון הכימי לקצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את מחט, במקום להחליק כיסוי בזווית בשקופית ומעיל הקצה עם תערובת שמן halocarbon. להביא את המחט רכוב אל מוקד עם קצה להחליק את המכסה בזווית ובעדינות להעביר קצה לכסות להחליק על פני קצה המחט עד שבורה. להפעיל לחץ על מנגנון microinjection ולבדוק כי הפתרון הכימי בתוספת הצבע זורם החוצה את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף המכיל עובר מיושרים על הבמה מיקרוסקופ. המשך למקד את העובר ואת המחט באותו המטוס. במקביל לנקב ותמיסה כימית microinject בתוספת צבע לתוך כל עובר. הערות: מחטי סתימה מתרחשות בתדירות גבוהה; לשבור מחט חדשה, כדי למנוע microinjection שלם. קצה מחט בוטה אינו פצע כמו נקי ככל קצה מחט בזווית. התאמת coverslip להלא 90 ° זווית במהלך השבירה היא אופטימלית לייצר קצה מחט בזווית. </li></ol> 5. Fi פורמלדהידxation הערות: הכימיקלים המשמשים לקיבוע דרוזופילה זה מזיקים. יש להשתמש בציוד מגן אישי (למשל, כפפות, מעיל מעבדה, ומשקפי בטיחות) בעת טיפול בכימיקלים. פעל לפי הנחיות מוסדיות פרט לסילוק של כימיקלים מוסדרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פציעתו, חכה 15, 30, 60, או יותר דקות להפעלת תעתיק של גנים מושרה פצע כדי להתעורר. כדי להסיר עוברי משקופיות הזרקה, לנקז בזהירות את תערובת שמן halocarbon מהשקופיות, להישען השקופיות נגד מתלה ולמחוק את הסוף עם Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה זכוכית לשטוף heptane על השקופית ולשטוף את נוזל השטיפה לתוך צלחת פטרי זכוכית. Heptane יהיה לפזר את הקלטת ולשחרר את העוברים. תמשיך לשטוף עד שכל העוברים יוסרו מן השקופיות. המשך לשקופית הבאה, עד שכל העוברים יוסרו משקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את heptane בתוספת פתרון עובר מצלחת הזכוכית למדע 20 מיליליטרבקבוקון ntillation. נער את הבקבוקון ל2-3 דקות, להסיר את heptane ולהוסיף 5 מיליליטר של heptane הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של תמיסה טרי, קיבעון (ראה רשימת חומרים כימיים למתכון). מכסה את הבקבוקון ולצרף ייקר פלטפורמה מסלולית. נער את הבקבוקון המכיל את העוברים ל25 דקות ב220-230 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלחץ, בואו הבועות בפופ הממשק. להסיר לחלוטין את השלב התחתון, מימית עם טפטפת, הימנעות מושכת את העוברים. השכבה התחתונה מורכבת מפתרון הקיבעון וצריכה להיות מסולקת כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של מתנול, מכסה את הבקבוקון ולנער במרץ ביד ל20-30 שניות, מערבולת ולמקם אותו על הספסל. עוברים פצועים יישארו בשלבי ביניים ולא לשקוע בתחתית. הערות: לאחר קיבוע קרום vitelline של עובר unwounded יהיה בדרך כלל פרץ במהלך שלב ההתייבשות עם מתנול. עם זאת, קרום vitelline בעובר פצוע כבר נשבר וצעד ההתייבשות לא יסיר את memb vitellineRANE. יד devitellinzation נדרש כדי להשלים את פרוטוקול הקיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את שכבת heptane העליונה ולאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר של מתנול הטרי. נער את הבקבוקון ואת העוברים צריכים לשקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מתנול בתוספת פתרון עובר עם טפטפת העברת זכוכית ולאסוף בצינור איסוף רשת ניילון בצלחת זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מתנול ולשטוף את העוברים עם פתרון 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים מרשת הניילון לצלחת מיץ תפוחים. מורחים את העוברים החוצה על פני השטח של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים לשקופית זכוכית סרט דו מקל. כסה את העוברים עם 1x PBS. הערות: העוברים נוטים גוש בגלל קרום vitelline. שימוש במקום מיץ תפוחים מאפשר הפרדה מהירה של העוברים בכבדות. העוברים יש להסיר מן הצלחת והועברו לשקופית זכוכית קלטת מקל כפול משום שעוברים לשקוע בצלחת אגר כאשר הכוח מוחל כדי להסיר את העובר מןקרום vitelline. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף בזהירות את העוברים עם מחט לנתח ל&quot; פופ &quot;קרום vitelline. העובר צריך לשקוע בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה זכוכית להעביר PBS 1x בתוספת עובר לצינור 1.5 מיליליטר. יש לשטוף את העוברים עם 1x PBS ולאחסן ב 4 ° C. המשך ליבש את העוברים באמצעות אתנול: סדרת PBS וימשיך עם הכלאה באתר או בפרוטוקול immunolocalization 14. </li></ol>

<ol><li>Germeraad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+in+Drosophila+by+microinjection+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA.</a> Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).</li>
<li>Payre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+epidermis+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li>
<li>Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidermal+barrier+wound+repair+pathway+in+Drosophila+is+mediated+by+grainy+head%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head.</a> Science. 308 (5720), 381-385 (2005).</li>
<li>Ting, S. B., Caddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+Drosophila+grainy+head+is+essential+for+epidermal+integrity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice.</a> Science. 308 (5720), 411-413 (2005).</li>
<li>Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+transcription+factor+codes+activate+epidermal+wound-response+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).</li>
<li>Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+in+Drosophila+melanogaster+uncovers+a+novel+set+of+genes+required+for+embryonic+epithelial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair.</a> Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).</li>
<li>Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+UAS-RNAi+screen+in+Drosophila+larvae+identifies+wound+closure+genes+regulating+distinct+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes.</a> Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duox%2C+Flotillin-2%2C+and+Src42A+are+required+to+activate+or+delimit+the+spread+of+the+transcriptional+response+to+epidermal+wounds+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila.</a> PLoS Genet. 7 (12), e1002424(2011).</li>
<li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+light+condition+modification+on+the+circadian+rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).</li>
<li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+photoperiod+ld+12%3A12+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster.</a> Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).</li>
<li>Pierre, S. E., Thurmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlyBase+101+-+the+basics+of+navigating+FlyBase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase.</a> Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).</li>
<li>Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Phenoxy-2-propanol+is+a+useful+anaesthetic+for+gastropods+used+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology.</a> J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846(2004).</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Drosophila+transgenic+reporters%3A+insulated+P-element+vectors+expressing+fast-maturing+RFP%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP.</a> BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).</li>
<li>Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+proteolytic+pathway+activation+reveals+an+expanded+ensemble+of+wound+response+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila.</a> PloS one. 8 (4), e61773(2013).</li>
<li>Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+melanogaster+embryonic+hemocyte+migrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations.</a> J. Vis. Exp. (36), e1696(2010).</li>
<li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J. Vis. Exp. (63), e3347(2012).</li>
<li>Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+repair+and+regeneration+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs.</a> Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).</li>
<li>Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+transdetermination+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs.</a> Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תגובת רגולציה תעתיק מיידית לרמזים חיצוניים מאפשרת לתאים כדי לתאם את תגובה מקומית לגירויים תאיים, אשר יכול לכלול מתח, נזק, או זיהום. השליטה לא נכונה של תגובה מקומית יכולה להיות השפעה מזיקה על תאי שכנים, כמו גם בזבוז של משאבים כדי לתקן את הפציעה. עובר דרוזופילה מספק מערכת מצוינת לבצע ניסויי ריפוי פצע בסיסיים באורגניזם מודל-to-לשמור קל זול ו. הפוטנציאל לשיתופי פעולה בין המחקר באורגניזמים מודל אחרים ודרוזופילה מספק הזדמנות ייחודית לחקור שאלות רבות ביולוגיות. טכניקה נוספת של כתבי הפצע היא שילוב הגנטי של רקע מוטציה, המספקת שיטה יעילה לבדיקת תרומתם של גנים חדשים להפעלה של מסלול תגובת הפצע באפידרמיס. יש לנו כתבי תעתיק מושרה פצע אפידרמיס אבailable בשני nd 2 ו 3 rd כרומוזומים 5. במחקר זה אנו משתמשים בכלי טייס ומערכות GAL4 של ביטוי יתר 16. ללימודים עם אללים מוטציה קטלניים אנו קובעים רקע הגנטי באמצעות כרומוזום איזון ניאון, למשל Kruppel-GFP 17. יש לנו ניתחנו את לוקליזציה כתב פצע בכמה רקע גנטי (טבלה 1). שינוי אפשרי של הטכניקה הוא לשלב microinjection ופציעתם. Microinjection ניתן להשתמש כדי להציג את הפתרון כימי לעובר. כמה תרכובות כימיות נבדקו ונמצאו להסדיר את פעילותם של כתבי פצע אפידרמיס 9. שיטה זו של פציעה וmicroinjection בו זמנית יכולה להיות שימושית כדי להגדיל את מספר התאים בעובר דרוזופילה שיגיב אות פצע וניתן להשתמש בם ישירות כדי לעקוב אחר שינויי ביטוי גנים לאחר פצע 18. יישום עתידי של טכניקת microinjection יהיה לבחון כימיקלים חדשניים לויסות תגובת הפצע באפידרמיס. דרוזופילה כמערכת מודל למחקרים גנטיים מציעה מגוון רחב של פרוטוקולים פשוטים כדי לטפל ביעילות בשאלות מורכבות. הדיווחים אחרונים על ההיתכנות של טכניקות דרוזופילה מדגיש את השימוש של הגירת hemocyte 19 וזיהום הצרעה טפילית 20 כאמצעי להרחבת השפעתה של קהילת מחקר דרוזופילה נוספת. בנוסף ללימודי תיקון פצע, דרוזופילה מספקת מודל קלאסי להתחדשות עם מערכת הדיסק דמותי 21,22. ההתקדמות בשילוב במחקרי התחדשות דיסק דמותי ופציעה לנקב / microinjection מספקת מערכת מצוינת לגלות רכיבים נשמרים היטב של תיקון רקמות.

מניפולציה של עוברי דרוזופילה בטכניקת microinjection היא assay מבוסס היטב 1. המשמעות של שיטת כתב תגובת פצע אפידרמיס היא לשלב את הפרוטוקול ללנקב / microinjection עם כתבי ניאון ולדמיין תגובת in vivo לפגיעה באפידרמיס בעוברי דרוזופילה. מטרתה של שיטה זו היא לאפשר למגוון רחב יותר של מדענים להשתמש דרוזופילה ככלי לחקור את התהליכים המווסתים את תגובת תעתיק לפציעה לנקב באפידרמיס. האפידרמיס חד שכבתי בדרוזופילה מספק מערכת פשוטה ללמוד תגובת פצע אפידרמיס לאחר פציעה לנקב 2. עובר דרוזופילה הוא מערכת מודל חזקה גנטי לנתח את השלבים של תיקון פצע, לרבות תגובת פצע, דלקת, וreepithelialization 3. מדובר בין שאר משום שרבים או zygotic רוב מוטציות לשרוד עד סוף embryogenesהוא ולפתח מחסומי אפידרמיס גם כאשר דפוסים התפתחותיים הולך עמוק השתבש. אפיון קודם של ראש נשמרים היטב גורם שעתוק מגורען (Grh), זיהה כי גנים Grh יעד decarboxylase דופא (DDC) וhydroxylase טירוזין (ple) מופעלים תעתיק מסביב לאתרים של פגיעה 4. דרוזופילה כאורגניזם מודל לתגובת פצע מספק קו משלים של חקירה כדי לקדם מחקרים בריפוי פצע יונקים 5. מחקרים מאוחרים יותר זיהו גנים הנגרמים פצע דרוזופילה נוספים ופיתחו &quot;ארגז כלים&quot; של רבים כתבי פצע ניאון כדי לפקח על in vivo תגובת פצע אפידרמיס לנקות פצע 6. דיווחים אחרונים על הרגולציה של ריפוי פצע דרוזופילה התמקדו בפנוטיפ סגירת פצע, ומאפשרים גילוי של מסלולים רבים המסדירים תא הגירה 7,8. עם הניתוח שלכתבי פצע ניאון, המחקרים שלנו זיהו סט רומן של גנים הנדרשים לביטוי המקומיים של גנים פצע מושרה אפידרמיס 9. אחד היתרונות של שיטת כתב תגובת הפצע הוא שהתוצאות מספקות תובנה רבה יותר על מנגנון של כמה אותות transduced מהאתר של פגיעה בתאים השכנים. עם זאת, אחד החסרונות של שיטת כתב תגובת הפצע הוא שהתוצאות לא לקשר ישירות לפנוטיפים בריפוי או תיקון פצע. שימוש רחב יותר של הפרוטוקול לנקב פצע הנקי במסכים גנטיים וכימיים יאפשר רגולטורים חדשים של תגובת תעתיק לאפידרמיס ופצעו להיות מזוהים ולקדם את התרגום של תגליות ריפוי פצע לתוך מודלים של יונקים של טיפולי פציעה.

<table><tbody><tr><td>שמרים</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>מיץ תפוחים</td> אגר <td>גנרי</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה</td><td></td> שמן הלוקרבון גנרי<td></td><td></td></tr><tr><td>, 700 W</td> שמן הלוקרבון <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>, 27 W</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1- פנוקסי-2-פרופנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>מתיל-ובטא;-ציקלודקסטרין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>טולואידין כחול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד, 16%</td> <td>Polysciences, Inc</td><td>18814-20</td><td>כימיקל רעיל</td></tr><tr><td>הפטן</td><td>פישר Scientific</td><td>H360-1</td><td>מתנול כימי רעיל</td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A412-1</td><td>כימיקל רעיל</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ EGTA</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>ללא RNase H2O</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>דרוזופילה חממה</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>כלוב זבובים</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>צינור איסוף עוברים</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מפלסטיק</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>סרט מקל כפול מברשת</td><td>צבע גנרית</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>גנרית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחט דיסקציה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-965A</td><td>חפץ חד</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית להחליק Thermo</td><td>Scientific</td><td>3306</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ</td> אובייקט חד <td>Thermo Scientific</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td> אובייקט חד <td>Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000</td><td></td></tr><tr><td>מחט נימית</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>חפץ חד</td></tr><tr><td>מושך מחט</td><td>Narishige</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט מיקרו הזרקה</td><td>Narishige</td><td>MINJ4</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Carl Zeiss</td><td>Primo-Vert</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית צלחת פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-747A</td><td>חפץ</td></tr><tr><td>חד זכוכית פסטר</td><td>פיפטה פישר סיינטיפיק</td><td>22-063-172</td> נורת העברת <td>חפצים חדים</td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>קימוויפ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-666בקבוקון</td><td></td></tr><tr><td>נצנוץ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-337-7</td><td>שייקר מסלול אובייקט חד</td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת 1.5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>סריקת לייזר קונפוקלית</td><td>Leica</td><td>SP2</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת קיבוע</td> <td>(5 מ"ל)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>16% פורמלדהיד</td><td>2.5 מ"ל</td><td></td><td>כימיקל רעיל</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0.5 מ"ל</td> 0.5 מ' <td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>0.5 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase ללא H2O</td><td>1.5 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תערובת שמן הלוקרבון</td><td>(10 מ"ל)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>שמן הלוקרבון, 700 W</td><td>5 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שמן הלוקרבון, 27 W</td><td>5 מ"ל</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assay וmicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

עובר דרוזופילה מפתחת שכבת האפידרמיס חזק המשמשת גם להגנה על התאים הפנימיים מסביבה חיצונית קשה, כמו גם לשמור על הומאוסטזיס הסלולר. פציעה לנקב עם מחטי זכוכית מספקת שיטה ישירה כדי לעורר תגובת אפידרמיס פצע מהירה שמפעילה כתבי תעתיק פצע, אשר ניתן דמיינו ידי אות כתב מקומית בעוברים או זחלי חיים. פציעה לנקב או לייזר מספקת גם אותות המקדמים הגיוס של hemocytes לאתר הפצע. באופן מפתיע, פציעה לנקב חמור (ולפנים) בעוברים בשלב מאוחר רק לעתים רחוקות משבשת התפתחות עוברית נורמלית, כמו יותר מ 90% מעוברים נפצעו כזה לשרוד לבגרות, כאשר עוברים מוזרקים במדיום שמן שממזער זליגה מיידית של hemolymph מאתרים לנקב . הליך הפצע דורש המיקרומניפולציה של עוברי דרוזופילה, כוללים יישור ידני של העוברים על AGצלחות ar והעברת העוברים המיושרים לשקופיות מיקרוסקופ. Assay תגובת פצע אפידרמיס דרוזופילה מספק מערכת מהירה כדי לבדוק את הדרישות הגנטיות של מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים המקדמים ריפוי פצע, כמו גם דרך מסך עבור תרכובות כימיות פוטנציאליות המקדמות ריפוי פצע. מחזור החיים הקצר והשגרתי culturing קל לעשות דרוזופילה אורגניזם מודל רב עוצמה. ריפוי פצע נקי דרוזופילה מופיע לתאם את תגובת משובי אפידרמיס, עם התגובה החיסונית המולדת, בדרכים שנמצאות עדיין בחקירה, המספקת מערכת מצוינת למצוא שימור רגולציה מנגנונים נפוצים לדרוזופילה ופציעת אפידרמיס יונקים.

כדי להשיג את התוצאות שמוצגים בשיטה זו, מסגרת הקריאה הפתוחה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא קבעה את אמרגן / מושרה פצע רצף משפר מדופא decarboxylase (DDC) וDsRed הוא קבע את רצף משפר פצע מhydroxylase טירוזין ( ple) 4,6. בעובר דרוזופילה חי, התבגרות של חלבון כתב פצע הניאון היא 4-6 שעות אופטימליות אחרי פציעתם, המאפשרת זמן להצטברות של חלבון מספיק כדי להמחיש, כמו גם זמן לחלבון פלואורסצנטי לחמצן למדינת הניאון 15. כדי לבחון את לוקליזציה הכתב, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתחם מספיק. כדי לצפות בהגדלה גבוהה יותר של לוקליזציה הכתב, מיקרוסקופ confocal הוא אופטימלי כדי ליצור הקרנה המרבית של חלקים אופטיים מרובים (איור 1). Confocal בתחום ההדמיה vivo של עוברי דרוזופילה הוא מסובך ידי raגליות PID של העובר. . ניתן להשיג מלא מבט של עובר עם 20X אובייקטיבי וניתן לקבל מבט מקרוב על אתר פצע עם 40X אובייקטיבי. העליון נוכח לוקליזציה כתב פצע אפידרמיס ניתן הדמיה עם 10 סעיפים אופטיים 1μm רצופים. לרוחב תצוגה של לוקליזציה כתב פצע אפידרמיס ניתן הדמיה עם 40 1 מיקרומטר סעיפים אופטיים רצופים. שימוש בשיטות מעבר גנטי סטנדרטיות, ניתן לשלב כתבי פצע עם מוטציות גנטיות. דוגמא אחת שהוצגה במאמר זה היא Flotillin-2 (Flo-2), כי פסד של פונקציה (אלל null שנוצר עם כניסה P-אלמנט) ומוטציות לזכות-of-פונקציה (ביטוי יתר שנוצר עם ביטוי בכל מקום בכל התאים) של Flo-2 להדגים את מוצר גן Flo-2 הוא הכרחי ומספיק כדי לעכב את הלוקליזציה של DDC-GFP פצע כתבים 9 (2A דמויות ו2B). שימוש במיילפרוטוקול croinjection, ניתן לבחון האם כניסתה של superactivates פתרונות כימיים או מעכבת את הלוקליזציה של כתבי פצע. עוברים כימיים פצועים נפצעו בו זמנית והוזרקו להם ביחס של 1:4 של 1% צבע הכחול toluidine ותרכובות solubilized. צבע הכחול Toluidine אפשר לאישור חזותי של תרכובות solubilized שהוזרקו לתוך חלל הגוף. עוברי בקרה נפצעו במחט שבורה המכילה 1:04 יחס של 1% צבע כחול toluidine ומומס ללא כימי. שתי דוגמאות שהוצגו במאמר זה הן מי חמצן (H 2 O 2) ותיל-β-ציקלודקסטרין (MβCD), משום שהפתרונים הכימיים שני יש בם כדי גלובלי להפעיל הלוקליזציה של DDC-GFP פצע כתבים 9 (2C דמויות ו2D) . מי חמצן (H 2 O 2) היה מדולל בH 2 O ל0.6 מ &#39;מתיל-β-ציקלודקסטרין (MβCD) היה solubilized ב1 מ&#39;M NaOH עד 3 מ&quot;מ. באמצעות פרוטוקול קיבעון עובר, ניתן לזהות את הפעלת השעתוק של גנים תגובת פצע בתחום מקומי, המקיף את אתר פצע. דוגמא אחת שהוצגה במאמר זה היא הכלאה באתר של בדיקות RNA כדי לזהות DDC ותמלילי ple 4,6,9 (3A דמויות ו3B). <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. DDC-GFP וple-DsRed פצע כתב לוקליזציה. Brightfield ותמונות ניאון בעוברי סוג בר פצועים. Top-אור כתב פצע DDC-GFP (). (ב) Top-אור ple-DsRed פצע עיתונאי. כל התמונות נאספו על מיקרוסקופ confocal לייקה SP2, עם 20X אובייקטיבי. חצים מסמנים את אתר של פצע. קווים מקווקווים בנתוני הפנלs לסמן את קווי המתאר של עוברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. לוקליזציה של כתב DDC-GFP פצע ברקע מוטציה גנטי ועוברים כימיים microinjected. Brightfield ותמונות ניאון של עוברים נפצעו Flotillin-2 (Flo-2) שעברו מוטציה. () הפסד-of-פונקצית Flo-2 מוטציות {KG00210}, התרחבותה של פעילות עיתונאית בכל תאי האפידרמיס. (ב) רווח של פונקצית Flo-2 (ארמדיל-GAL4, כטב&quot;מ-Flo2) מוטנטים, עיכוב של פעילות עיתונאית בכל תאי האפידרמיס. (ג) מי חמצן (H 2 O 2 ) Microinjection פתרון, הרחבה של נציגORTER פעילות לאורך כל תאי האפידרמיס. (ד &#39;) מתיל-β-ציקלודקסטרין (MβCD) microinjection פתרון, הרחבת הפעילות עיתונאית בכל תאי האפידרמיס. כל התמונות נאספו על מיקרוסקופ confocal לייקה SP2, עם 20X אובייקטיבי. חצים מסמנים את אתר של פצע. קווים מקווקווים בלוחות נתונים לסמן את קווי המתאר של עוברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> איור 3. זיהוי של מולקולות RNA גן תגובת פצע. תמונות ניאון של הכלאה באתר וזיהוי RNA בעוברים פצועים סוג בר. DDC () וple (ב) תעתיקי רנ&quot;א לצבור סביב אתר הפצע. כל התמונות היו קולקטיביתטד על מיקרוסקופ confocal לייקה SP2, עם מטרת 20X. חצים מסמנים את אתר של פצע. קווים מקווקווים בלוחות נתונים לסמן את קווי המתאר של עוברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="טבלת 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> טבלת 1. סיכום של כתבי תגובת הפצע באפידרמיס. הוספות של ארבעה כתבי תגובת פצע (DDC, ple, MSN, kkv) זמין בשני כרומוזומים השניה והשלישי. כתבי תגובת DDC ופצע msn כל כתבי תגובת הפצע להפעיל את גן הקרינה (GFP או DsRed) במספר מצומצם של תאי האפידרמיס המקיפים את האתר של פציעה לנקב ברקע הסוג בר (פנוטיפ לדוגמא: &quot;המקומי&quot;). דורשים Grh עבור הפעלה של fluorescenגן ce לאחר פציעה לנקב (פנוטיפ לדוגמא: &quot;אף אחד&quot;). כל כתבי הפצע דורשים Flo-2 ללוקליזציה של גן הקרינה לאחר פציעה לנקב (פנוטיפ לדוגמא: &quot;הגלובלי&quot;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ויזואליזציה של רפורטר in vivo לתגובה לפצע עורי בעובר של דרוזופילה. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף של שלב התפתחותי שבו ניתן לזהות את פעילות הרפורטר באופן עקבי. השלב השני של הפרוצדורה הוא דקירת העובר באמצעות מחט זכוכית ומכשיר למיקרו-הזרקה.השלב השלישי הוא הרדמת העובר לצורך ויזואליזציה של הד reporter. השלב האחרון הוא תיקוף מיקום ה-reporter על ידי זיהוי תבנית הביטוי של גששי RNA. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית הפעלה ספציפית של ה-reporter לתגובת פצע באפידרמיס רק בתאים הסובבים את אתר הפגיעה מדקירה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הכוללות בחינה של סגירת פצע הוא היכולת לצפות בביטוי גנים המופעל על ידי פציעה מדקירה בעוברים חיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום תיקון הרקמות, כגון האופן שבו תאים הסובבים פגיעה מווסתים תגובה מיידית לפצע כדי לקדם תיקון. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של התחדשות רקמות, מאחר שוויסות התגובה לפצע הוא השלב הראשוני.ניתן לבחון ריפוי פצעים בכל שלב של ההתפתחות. עם זאת, בשלב 17, הקוטיקולה בוגרת מדי, ולכן רפורטרים ידועים לפצעים לא יופעלו.כדי להדגים, עוברים בשלבים 15 עד 16 ייפצעו לצורך איסוף. אספו זבובים בוגרים בני יומיים עד שלושה, 50 נקבות ו-25 זכרים. העבירו אותם לכלוב לאיסוף עוברים עם מצע טרי של מיץ תפוחים, אגר ומעט משחת שמרים.השאירו את הכלוב בטמפרטורה של 25 degrees Celsius בכל בוקר במהלך שלושת הימים הבאים. החליפו את הצלחת בצלחת חדשה. בשעות אחר הצהריים של היום השלישי, אפשרו לביצים להצטבר על צלחת חדשה במשך שעתיים.אחסן את הפיתח זה למשך 14 שעות בטמפרטורה של 25 degrees Celsius. הטלה של שעתיים אמורה להניב כ-200 עוברים למחרת. הוסף מספר מיליליטרים של מים לפיתח וסובב אותו בעדינות.לאחר מכן, בעזרת מכחול, העבירו את המים והעוברים מהצלחת לסלסילת רשת ניילון בתוך מבחנה לאיסוף. כעת הכינו אמבט הלבנה רדוד והשרו בו את העוברים למשך שתי דקות. שלב זה מסיר את ה-CORs, הביצים.סובבו בעדינות את האמבט מספר פעמים כדי למנוע מהעובריים להידבק זה לזה. לאחר שתי דקות, שטפו את העוברים תחת זרימת מים ובצלוחית פטרי למשך חמש שניות כל אחת. לאחר מכן, העבירו את סל העוברים לנייר סופג כדי לייבש את העוברים.בשלב הבא, בעזרת מחט דיסקציה, העבירו כ-50 עוברים מהרשת לצלחת אגר שהוכנה עם צבע מאכל ירוק. הצבע נועד להגברת הנראות של ביצי הברך. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, סדרו את העוברים בשתי שורות מקבילות במרחק של כחמישה מילימטרים זו מזו.מקמו את השורות במרחק של רוחב עובר אחת מהשנייה כדי לאפשר חילוף גזים. לאחר מכן, הצמידו בזהירות תzריות עם סרט דבק דו-צדדי על העובריים, כך שהשורות יהיו ניצבות לאורכה של התזריות. כדי להפחית את הלחץ הפנימי שלהם, הניחו לעובריים להתייבש באוויר.בדרך זו הם לא יתבקעו כאשר ייפצעו. לאחר 25 דקות, השקף הראשון שהוכן אמור להיות יבש. כעת, כסו את העוברים בשתיים עד שלוש טיפות של שמן halo carbon כדי למנוע התייבשות נוספת, ועברו מיד לפציעת העוברים היבשים.הנח את שקופית העוברים עלבמת מיקרוסקופ ההזרקה. אתר את העוברים בשדה הראייה ותרגל את תנועת הבמה של המיקרוסקופ ההפוך. כעת, התמקד במישור האמצעי של העובר לאורך הציר הגבי-בטני (dorsal ventral) והבא את העובר העליון של השורה הראשונה המסודרת אל שדה הראייה.בשלב הבא, מקם בזהירות והדק מחט משוכה בתוך מחזיק המחטים. השתמש במיקרו-מניפולטור כדי להוריד את המחט לעבר העשייה. יישר את המחט עם העובר באותו מישור מוקד.כעת, אין לכוונן את המיקרו-מניפולטור יותר. כעת, הזיזו את הבמה כדי לדקור את העובר לכל אורכו. לאחר מכן, עברו לעובר הבא בשורה.לאחר פציעת השורה הראשונה, העבירו את המחט לגמרי למעלה והרחיקו אותה מהבמה. לאחר מכן סובבו את העשייה והמשיכו לדקור עוברים בשורה השנייה. לאחר שכל העוברים נפצעו, ניתן לקבע אותם מיד לצורך היברידיזציה פנימית או צביעה בנוגדנים.לבחינת רפורטרים פלואורסצנטיים המתינו ארבע עד שש שעות והעבירו את העובר לזכוכית חדשה; מקמו חרוזי זכוכית מסביב לעובריים. לאחר מכן, הוסיפו מספר טיפות של 50% One phenoxy, two propanol, המשמש כחומר הרדמה, והניחו לוכית כיסוי על העוברים לצורך הזרקות מיקרוסקופיות. טענו את מחט ההזרקה מהחלק האחורי עם 1 µL של תמיסה כימית בתוספת צבע, כגון 0.6 molar hydrogen peroxide.אפשרו לפעולה קפילרית למשוך את התמיסה הכימית לקצה המחט. לאחר מכן, שברו את קצה המחט כנגד קצה של זכוכית כיסוי בתוך תערובת שמן פחמן-הלו (halo carbon oil mix). ראשית, הגבירו את המיקוד של המחט המותקנת כנגד קצה זכוכית הכיסוי המוטה בזווית שאינה בדיוק 90 מעלות.בשלב הבא, העבירו בעדינות את קצה זכוכית הכיסוי על חוד המחט עד שהיא נשברת. לאחר מכן, הפעילו לחץ על מכשיר המיקרו-הזרקה ובדקו שהתמיסה זורמת מהמחט. אם התמיסה אינה זורמת, שברו את קצה המחט מעט יותר.כעת, בצע את אותו ההליך ששימש לניקור העוברים בלבד. הפעם, בצע מיקרו-הזרקה של התמיסה בו-זמנית עם הניקור. באופן אידיאלי, יש להזריק 10 nanoliters.אם יוזרק תמיסה רבה מדי לעובר, ממברנת ה-Vitale תתבקע; בעת ביצוע הליך הקיבוע המפורט בפרוטוקול הטקסט, יש להקפיד על השלבים הבאים. השתמשו בפ pipette זכוכית, ולא בפלסטיק, כדי לשטוף את ה-heptane על גבי העשייה, והשתמשו בזכוכית כדי לסובב את העוברים למרכז פטריית הזכוכית. לאחר מכן, נערה את העוברים בתוך חומר הקיבוע במשך 25 דקות במהירות של 220 עד 230 RPM.לאחר הנעירה, המתינו עד שהבועות בממשק יתפוצצו לפני הסרה מלאה של הפאזה המימית התחתונה. כמו כן, היזהרו שלא לשאוב את העוברים. לאחר הוספת המתנול, העוברים הפצועים אמורים להתרכז מאוחר יותר בממשק; פזרו את העוברים על פני השטח של הפלטה באופן זה, והעבירו אותם לעגלה של זכוכית עם סרט דבק דו-צדדי באופן זה.לאחר מכן, דחפו בעדינות את העוברים באמצעות מחט הדיסקציה כדי לפוצץ את ממברנת הוויטל (Vitale membrane) והמשיכו בתהליך ההתייבשות. זבובים מסוג פרא (Wild type) עברו טרנספורמציה באמצעות רפורטרים פלואורסצנטיים המחוברים למגבירים (enhancers) של DOPA decarboxylase או tyrosine hydroxylase, ונחשפו לבדיקה המתוארת. תחת תאורת שדה בהיר (brightfield), ניתן היה לראות את אתר הפצע, בעוד שתחת תאורה פלואורסצנטית, ניתן היה לראות את פעילות רפורטר ה-DCD באתר הפצע.החיווי של ה-tyrosine hydroxylase הראה תוצאה דומה. שני התמונות נאספו במיקרוסקופ קונפוקלי Leica SP two עם עדשה של 20 x. הפרוצדורה בוצעה במוטנט flow two עם אובדן תפקוד (loss of function).רקע: פעילות הדיווח (reporter activity) של DOPA decarboxylase התרחבה בתאי האפידרמיס במוטנטים של gain-of-function בזרם שני, שנוצרו באמצעות ביטוי רב-תאי (ubiquitous expression) בכל התאים. נצפתה עיכוב של הדיווח לאורך תאי האפידרמיס. לאחר מכן, עוברים פצעו והוזרקו להם בו-זמנית תרכובת מומסת וצבע udine blue; מי חמצן ומים הרחיבו את פעילות הדיווח של DOPA decarboxylase בתאי האפידרמיס, כפי שעשתה גם הזרקה של methyl B cyclodextrin בתוך נתרן הידרוקסיד, תוך שימוש ב-in situ hybridization.הפעלה שעתוקית של גנים המגיבים לפצע נבחנה באמצעות DOPA decarboxylase אנדוגני. נראה כי ביטוי ה-RNA ממוקם סביב אתר הפצע, וכמובן, נמצא כי תמלילי RNA של tyrosine hydroxylase הצטברו אף הם באתר הפצע. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ב-60 דקות אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב שלא להקדיש זמן רב מדי ליישור העובריים ולהמשיך לשלבים הבאים בתהליך.

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה...

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

סרטון זה מתאר כיצד לבצע מיקרו-הזרקות המעבירות ריאגנטים לעוברי דרוזופילה חיים. חוקרים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי להציג תרכובות אקסוגניות כמו חומצות גרעין וחלבונים בשלבים המוקדמים של התפתחות העובר. הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד להגדיר ולבצע את ההליך להזרקה של כל מגיב מסיס - כאן, חלבון פלואורסצנטי לניסויי הדמיה חיים.

מיקרו-הזרקה של עוברי דרוזופילה חיים: מסירה מוקדמת של ריאגנטים לעובר המתפתח

זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

העור הבוגר של C. elegans הוא מודל ניתן למעקב למחקרים על תגובות פצע אפיתל, כולל סגירת פצע, היווצרות צלקות וחסינות מולדת.

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב C. elegans

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הדמיה לחיות הפצע ותיקון ההיענות דלקתיות המשויך ברזולוציה גבוהה-עתיים ויוו. שיטה זו משתמשת השלב הגולמי של פיתוח דרוזופילה כדי לאפשר לטווח ארוך הדמיה ומעקב של אוכלוסיות תאים מסוים לאורך זמן והוא תואם עם איון יעיל מציאה RNAi בתיווך גנים.

לטווח ארוך In Vivo מעקב של תאים דלקתיים הדינמיקה בתוך דרוזופילה הגלמים

פוליפואידציה הנגרמת על-ידי פצע היא אסטרטגיה של תיקון רקמות שוחמרות שבה תאים גדלים בגודל במקום לחלק כדי לפצות על אובדן תאים. הנה פרוטוקול מפורט על איך להשתמש בזבוב הפירות כמודל למדוד תכסיסה ויסות גנטי שלה בתיקון פצעים אפיתל.

מודל Drosophila לחקר פוליפלואידים הנגרמים על ידי פצע

המטרה של פרוטוקול זה היא להזריק רודמין מצומד אקטין כדורי לתוך עוברים Drosophila ואת התמונה הרכבה מוט actin תוך גרעיני בעקבות עומס חום.

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

פרוטוקולים אלו מתארים כיצד לאפיין את הארגון ותפקוד החסימה של צמתקי מחיצה מקופלים באפיתל העוברי של דרוזופילה.

ניסויי צביעת חיסון וחדירת צבע להגדרת חלבוני צומת ספטט מקופלים בליבה באפיתל עוברי של דרוזופילה

למדו לדמיין תגובת פצע עורית בזמן אמת בעוברי Drosophila באמצעות מיקרו-הזרקה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת לחקור ביטוי גנים בתאים סביב פצע לקידום ריפוי רקמות.

Assay וMicroinjection פצע

גלה סרטונים נוספים